Dupla injeção direta de sangue na Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnóide

Resumo

Descrevemos neste protocolo um modelo de rato de hemorragia subaracnóide padronizada (SAH) por uma dupla injeção de sangue total autólogo na cisterna magna. O alto grau de padronização do procedimento de dupla injeção representa um modelo médio-agudo de HAS com relativa segurança em relação à mortalidade.

Resumo

Entre os derrames, a hemorragia subaracnóide (HAS) consecutiva à ruptura de um aneurisma arterial cerebral representa de 5 a 9%, mas é responsável por cerca de 30% da mortalidade total relacionada ao acidente vascular cerebral com uma morbidade importante em termos de desfecho neurológico. Um vasospasmo cerebral atrasado (CVS) pode ocorrer na maioria das vezes em associação com uma isquemia cerebral retardada. Diferentes modelos animais de HAS estão sendo usados agora, incluindo perfuração endovascular e injeção direta de sangue na cisterna magna ou mesmo na cisterna pré-técnica, cada uma apresentando vantagens e desvantagens distintas. Neste artigo, é apresentado um modelo de rato padronizado de SAH por dupla injeção direta de volumes determinados de sangue total autólogo na cisterna magna. Resumidamente, os camundongos foram pesados e, em seguida, anestesiados pela inalação de isoflurano. Em seguida, o animal foi colocado em posição reclinável em um cobertor aquecido mantendo uma temperatura retal de 37 °C e posicionado em uma estrutura estereotática com uma curva cervical de cerca de 30°. Uma vez no lugar, a ponta de uma micropipette de vidro alongada preenchida com o sangue arterial homólogo retirado da artéria carótida de outro rato da mesma idade e gênero (C57Bl/6J) foi posicionada em um ângulo reto em contato com a membrana atlanto-occipital por meio de um micromanipulador. Em seguida, 60 μL de sangue foi injetado na cisterna magna seguido por uma inclinação de 30° para baixo do animal por 2 minutos. A segunda infusão de 30 μL de sangue na cisterna magna foi realizada 24 h após a primeira. O acompanhamento individual de cada animal é realizado diariamente (avaliação cuidadosa do peso e bem-estar). Este procedimento permite uma distribuição previsível e altamente reprodutível do sangue, provavelmente acompanhada de elevação da pressão intracraniana que pode ser imitada por uma injeção equivalente de um fluido cerebral cerebral artificial (CSF), e representa um modelo agudo a leve de HAS induzindo baixa mortalidade.

Introdução

A hemorragia subaracnóide (HAS) é responsável por até 5% de todos os casos de AVC e constitui uma patologia relativamente comum com incidência de 7,2 a 9 pacientes por 100.000 por ano, com uma taxa de mortalidade de 20%-60% dependendo do estudo^1,,2,,3. Na fase aguda, a mortalidade é atribuível à gravidade do sangramento, reejamento, vasospasmo cerebral (CVS) e/ou complicações médicas⁴. Nos sobreviventes, a lesão cerebral precoce (EBI) está associada à extensão parêncima da hemorragia e aumento abrupto da pressão intracraniana, o que pode resultar em isquemia cerebral primária⁵ e morte imediata em cerca de 10%-15% dos casos⁶. Após o estágio inicial "agudo" da HAS, o prognóstico depende da ocorrência de isquemia cerebral "secundária" ou retardada (DCI), detectada em quase 40% dos pacientes por tomografia computadorizada cerebral, e em até 80% dos pacientes após ressonância magnética (RM)^7,,8. Além do CVV ocorrer entre 4 a 21 dias após a ruptura do aneurisma na maioria dos pacientes com HAS, o DCI⁹ pode resultar de lesões cerebrais difusas multifatoriais secundárias à formação de microtrombose, perfusão cerebral reduzida, neuroinflamação e depressão de disseminação cortical (DSC)^{10,,11,,12,,13}. Isso afeta 30% dos sobreviventes da HAS e impacta funções cognitivas, incluindo memória visual, memória verbal, tempo de reação e funções executivas, visuosespaciais e linguísticas¹⁴ prejudicando a vida diária¹⁵. As terapias padrão atuais para prevenir cvs e/ou os desfechos cognitivos ruins em pacientes com HAS baseiam-se no bloqueio da sinalização e vasoconstrição de Ca²⁺ usando inibidores do canal Ca²⁺ como Nimodipina. No entanto, ensaios clínicos mais recentes voltados à vasoconstrição revelaram dissociação entre o desfecho neurológico do paciente e a prevenção do CVS¹⁶, sugerindo mecanismos fisiodicos mais complexos envolvidos nas consequências do SAH a longo prazo. Portanto, há uma necessidade médica de maior compreensão do número de eventos patológicos que acompanham a HAS e o desenvolvimento de modelos animais válidos e padronizados para testar intervenções terapêuticas originais.

A ruptura de um aneurisma intracraniano principalmente responsável pela HAS em humanos é provavelmente difícil de imitar em modelos animais pré-clínicos. Atualmente, a ruptura do aneurisma e a situação de HAS podem ser testadas provisoriamente pela perfuração da artéria cerebral média (modelo de punção endovascular) responsável por disfunções cvs e sensitivasmotoras em camundongos^17,18. Devido à falta de qualquer possível controle sobre o aparecimento do sangramento e a difusão de sangue neste modelo, outros métodos foram desenvolvidos em roedores para gerar modelos SAH sem ruptura endovascular. Mais precisamente, consistem na administração direta do sangue arterial no espaço subaracnóide através de uma única ou dupla injeção na cisterna magna¹⁹ ou uma única injeção na cisterna pré-chiasmática²⁰. A principal vantagem desses modelos de camundongos sem ruptura endovascular é a possibilidade de dominar reproduzivelmente o procedimento cirúrgico e a qualidade e quantidade da amostra de sangue injetada. Outra vantagem desse modelo sobre o modelo por perfuração endovascular, em particular, é a preservação do bem-estar geral do animal. Na verdade, esta cirurgia é menos invasiva e tecnicamente menos desafiadora do que a necessária para gerar uma ruptura da parede carótida. Neste último modelo, o animal deve ser entubado e mecanicamente ventilado, enquanto um monofilamento é inserido na artéria carótida externa, e avançado na artéria carótida interna. Isso provavelmente leva a isquemia transitória devido à obstrução da embarcação pelo caminho do fio. Consequentemente, a co-morbidade (estado moribundo, dor importante e morte) associada à cirurgia é menos importante no modelo de dupla injeção em comparação com o modelo de perfuração endovascular. Além de ser um SAH mais consistente, o método de dupla injeção direta cumpre o bem-estar animal em pesquisa e testes (tempo reduzido sob anestesia, dor por interrupção tecidual na cirurgia e angústia) e leva a um número total mínimo de animais utilizados para o estudo do protocolo e treinamento de pessoal.

Além disso, isso permite a implementação do mesmo protocolo para camundongos transgênicos, levando a uma compreensão patológica otimizada da HAS e à possibilidade de testes comparativos de potenciais compostos terapêuticos. Aqui, apresentamos um modelo de rato padronizado de hemorragia subaracnóide (SAH) por uma dupla injeção diária consecutiva de sangue arterial autólogo na cisterna magna em camundongos C57Bl/6J masculinos de 6-8 semanas de idade. A principal vantagem deste modelo é o controle do volume sanguíneo em comparação com o modelo de perfuração endovascular, e o reforço do evento sanguíneo sem um aumento drástico da pressão intracraniana²¹. Recentemente, a dupla injeção direta de sangue na cisterna magna foi bem descrita sobre as questões experimentais e fisiopatológicas em camundongos. De fato, recentemente demonstramos CVS de grandes artérias cerebrais (basilar (BA), média (MCA) e artérias cerebrais anteriores (ACA), deposição de fibrina cerebrovascular e apoptose celular do dia 3 (D3) a 10 (D10), defeitos de circulação do fluido cefalorraquidiano paravascular acompanhado de alterações sensitivas motoras e funções cognitivas em camundongos, 10 dias pós-SAH neste modelo²². Assim, torna este modelo dominado, validado e caracterizado para eventos de curto prazo e duradouros pós-SAH. Deve ser idealmente adequado para a identificação prospectiva de novas metas e para estudos sobre estratégias terapêuticas potentes e eficientes contra complicações associadas à HAS.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados sob a supervisão de H. Castel, de acordo com o Comitê de Ética francês e as diretrizes da Diretiva do Parlamento Europeu 2010/63/UE e do Conselho para a Proteção dos Animais Utilizados para Fins Científicos. Este projeto foi aprovado pelo CENOMEXA local e pelos comitês nacionais de ética em pesquisa e testes em animais. Os camundongos C57Bl/6J Rj masculinos (Janvier), com idade entre 8 e 12 semanas, foram alojados sob condições ambientais padrão controladas: 22 °C ± 1 °C, 12 horas/12 horas de ciclo claro/escuro e água e alimentos disponíveis ad libitum.

1. Configuração da cirurgia SAH e preparação para injeção

1. Antes do início da cirurgia, puxe um número adequado de capilares de vidro usando um puxador de micropipette. A pipeta de injeção deve apresentar um diâmetro interno de 0,86 mm e diâmetro externo de 1,5 mm.
2. Prepare o fluido cerebrospinal artificial (aCSF) para a condição falsa.
   1. Prepare uma solução com 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl_2,10 mM de glicose, 26,2 mM NaHCO₃ em H₂O, pH 7.4.
   2. Gás aCSF com 95% O₂ e 5% CO₂ por 15 min, e depois adicionar 2,5 mM CaCl₂.
   3. Esterilize o aCSF oxigenado com um aparelho de filtro de 0,22 μm. A solução aCSF pode ser estável por 3-4 semanas a 4 °C. Se a contaminação (solução ficar nublada) ou uma formação de depósito tiver aparecido, descarte e faça aCSF fresco.
3. Coleta de sangue de um doador de rato homólogo
   1. Isole a artéria carótida ao longo da traqueia e colete a quantidade máxima de sangue por punção da artéria carótida.
   2. Na prática, coloque o rato em uma câmara de anestesia e carregue a câmara com 5% de isoflurane até que o animal perca a consciência.
   3. Verifique a falta de reflexos fixando um dos dois membros posteriores para permitir a configuração do procedimento experimental cirúrgico.
   4. Cubra uma seringa de 1 mL com uma solução de heparina usando uma agulha de 26 G (sódio heparina). Isso evitará a coagulação sanguínea durante os próximos passos.
   5. Instale o animal posicionado em decúbito dorsal com pernas separadas, e o nariz em uma máscara de anestesia (manutenção da anestesia com isoflurane de 2 a 2,5%).
   6. Isole a artéria carótida ao longo da traqueia dissecando o músculo omomóide longitudinalmente. Uma vez isolada a artéria, insira a agulha em direção ao coração com a ajuda do gancho de microdisscção e fórceps e colete o máximo de sangue através da punção da artéria carótida (60 μL é necessário por rato SAH).
   7. Sacrifique o rato doador anestesiado imediatamente após a coleta de sangue usando luxação cervical.

2. Preparação animal (8-10-week-week-old C57BL/6J machos) preparação

1. Pesar cada mouse precisamente usando um equilíbrio eletrônico. No presente estudo, os camundongos teriam peso corporal na faixa de 20 a 25 gramas pouco antes da cirurgia.
2. Como explicado anteriormente (ver etapas 1.3.2 e 1.3.3), induzir anestesia de camundongos a serem operados.
3. Raspe o pescoço e o espaço entre as orelhas com um cortador elétrico adequado.
4. Instale o animal posicionado em decúbito ventral com pernas separadas e o nariz em uma máscara de anestesia (manutenção de anestesia com isoflurane de 2 e 2,5%) em um quadro estereotático.
5. Verifique se o rato está dormindo e que sua cabeça está devidamente bloqueada.
6. Injete subcutâneamente 100 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg) com uma agulha de 26 G na parte inferior das costas, para evitar dor após o despertar.
7. Evite os olhos secos usando gel líquido protetor e mantenha uma temperatura intraretal de 37 °C usando uma manta elétrica autorregulada.
8. Trate a área posterior raspada do pescoço com uma solução antisséptica (povidone-iodo ou clorexidina usando uma estrada de algodão estéril).
9. Pré-esterilizar todos os instrumentos que toquem a pele preparada/tecido subcutâneo (aquecimento a 200 °C por 2 horas) e manuseie asepticamente.

3. Indução sah

1. No primeiro dia (D-1)
   1. Corte uma incisão de 1 cm com uma tesoura fina no pescoço posterior, seguida pela separação dos músculos ao longo da linha média para acessar a cisterna magna.
   2. Corte a ponta da pipeta de vidro vazia com uma tesoura fina. Em seguida, adapte-se a uma seringa conectada a um conector flexível de silicone.
   3. Transfira 60 μL de sangue ou aCSF (para condição SAH ou sham, respectivamente) em um tubo de 0,5 mL usando uma micropipette de precisão.
   4. Suge para dentro da pipeta de vidro os 60 μL de sangue para a condição SAH ou 60 μL de aCSF para a condição falsa.
   5. Para injeção, instale a pipeta no quadro estereotático usando um anel ou aderência azul e leve lentamente a ponta da pipeta para a membrana na interface com a cisterna magna.
   6. Insira lentamente a ponta da pipeta através da membrana atlanto-occipital na cisterna magna, usando um micro-manipulador do quadro estereotático.
   7. Conecte a pipeta previamente preenchida com sangue ou aCSF à seringa pronta para indução de pressão.
   8. Injete pressionando o êmbolo a uma taxa baixa em torno de 10 μL/min, para evitar pressão intracraniana aguda.
   9. Durante a injeção, monitore de perto a taxa respiratória e a temperatura retal.
   10. No final da injeção, retire cuidadosamente a pipeta através do micromutor e certifique-se visualmente de que não há vazamento durante a retirada.
   11. Alcance hemostasia usando um hemostat absorvível e execute duas suturas com fio de sutura trançado não absorvível.
   12. Imediatamente após a cirurgia, isole e posicione o rato em decúbito de declínio e cubra-o com um cobertor de sobrevivência em uma caixa aberta durante a recuperação.
2. Segundo dia de indução (D0)
   1. Após 24 horas, induza anestesia (ver passos 1.3.2 e 1.3.3). Injete subcutâneamente 100 μL de buprenorfina novamente (0,1 mg/kg) e evite olhos secos usando gel líquido protetor (ver passos 2.7 e 2.8).
   2. Instale o animal no quadro estereotático como no dia anterior.
   3. Remova cuidadosamente as suturas com microscisores.
   4. Prepare a membrana atlanto-occipital como antes e aplique preparação antisséptica na área raspada do pescoço com uma vara de algodão estéril.
   5. Injete 30 μL de sangue ou aCSF a uma taxa baixa (ver passos 3.1.2 a 3.1.8). Monitore a taxa respiratória e a temperatura retal.
   6. No final da injeção, retire cuidadosamente a pipeta e controle a ausência de vazamento de sangue durante a retirada.
   7. Alcance hemostasia e execute duas suturas com fio de sutura absorvível trançado.

4. Acompanhamento pós-operatório e fim do experimento

1. Imediatamente após a cirurgia, isole e posicione o rato em decúbito de declínio com um cobertor de sobrevivência nas costas em uma caixa aberta durante a recuperação.
2. Pesar e observar cuidadosamente diariamente o comportamento de cada rato até o sacrifício (por exemplo, D7 pós-cirurgia).
3. Entre os pontos finais humanos, uma perda significativa de peso (>15% do peso) é notada clássicamente. Uma postura "curvada para trás", movimentos lentos, prostração, vocalizações anormais de dor e/ou comportamento agressivo significativo também são sinais importantes de sofrimento animal. Se algum desses sinais ou uma combinação de sinais aparecer, o monitoramento do animal é reforçado poucas horas após sua aparência. Se o bem-estar do animal piorar ou não melhorar dentro de 48 horas, será considerado que um nível de sofrimento intolerável é atingido, e a eutanásia é realizada.
4. No momento da escolha, sacrificar camundongos anestesiados por decapitação, e colher cérebros para novas análises.
5. Realizar eutanásia (decapitação) após anestesia isoflurane (5%).

Resultados

Cronograma experimental, procedimento, acompanhamento e mortalidade
Figura 1A e Figura 1B resumem o protocolo modelo SAH por dupla injeção intracisternal de sangue. Resumidamente, no primeiro dia de indução sah (D-1), 60 μL de sangue retirado de um rato homólogo ou 60 μL de fluido cerebrospinal artificial (aCSF) foram injetados na cisterna magna em condições SAH ou falsas, respectivamente. No dia seguinte (D0), 30 μL de sangue retir...

Discussão

Apesar da intensidade da pesquisa no campo da HAS e do desenvolvimento de estratégias terapêuticas como opções de tratamento endovascular e farmacológico aumentando nos últimos vinte anos, a mortalidade permanece elevada na primeira semana de internação hospitalar e atinge cerca de 50% nos 6 meses^{seguintes 24,25}. Este modelo pré-clínico atual por injeção dupla diária de sangue arterial homólogo na cisterna magna tem sido reconhecido...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable hemostat	Ethicon	Surgicel
absorbable suturing thread	Ethicon	Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket	Harvard Apparatus	50-7087-F
bluetack for capillary fixation	UHU	Patafix
electronic balance	Denver Instrument	MXX-2001
glass capillaries	Harvard Apparatus	GC150F-15	inner diameter 0.86 mm outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer	Phymep	V100
micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
needle 26 G	BD microbalance	300300
non absorbable suturing thread	Peters surgical	Filapeau 4.0
stereotaxic frame	David Kopf instruments	Model 902
surgical equipment	Kent scientific	clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO	Thermofisher	11866071