Herramientas de ARNi específicas de tejidos para identificar componentes para la señalización de estrés sistémico

Resumen

El mantenimiento de la proteostasis del organismo requiere la coordinación de las respuestas de control de calidad de las proteínas, como la expresión de chaperonas, de un tejido a otro. Aquí, proporcionamos herramientas utilizadas en C. elegans que permiten monitorear la capacidad de proteostasis en tejidos específicos y determinar las respuestas de señalización intercelular.

Resumen

Durante la última década se ha producido un aumento transformador en el conocimiento en torno a la regulación de los procesos de control de calidad de las proteínas, lo que revela la importancia de los procesos de señalización intercelular en la regulación de la proteostasis no autónoma de las células. Estudios recientes están comenzando a descubrir los componentes de señalización y las vías que coordinan el control de la calidad de las proteínas de un tejido a otro. Por lo tanto, es importante identificar los mecanismos y componentes de la red de proteostasis (NP) no autónoma de las células y su relevancia para el envejecimiento, las respuestas al estrés y las enfermedades de mal plegamiento de proteínas. En el laboratorio, utilizamos la eliminación genética por ARNi específico de tejido en combinación con reporteros de estrés y sensores de proteostasis específicos de tejido para estudiar esto. Describimos metodologías para examinar e identificar componentes de la NP celular no autónoma que pueden actuar en los tejidos que perciben una condición de estrés y en las células que responden para activar una respuesta protectora. En primer lugar, describimos cómo generar construcciones de ARNi de horquilla para la eliminación genética constitutiva en tejidos específicos y cómo realizar la eliminación genética específica de tejido alimentando ARNi en diferentes etapas de la vida. Los reporteros de estrés y los ensayos de comportamiento funcionan como lecturas valiosas que permiten la detección rápida de genes y condiciones que modifican los procesos de señalización del estrés sistémico. Finalmente, se utilizan sensores de proteostasis expresados en diferentes tejidos para determinar cambios en la capacidad tisular específica de la NP en diferentes etapas de desarrollo y envejecimiento. Por lo tanto, estas herramientas deberían ayudar a clarificar y permitir el seguimiento de la capacidad de la NP en tejidos específicos, al tiempo que ayudan a identificar los componentes que funcionan en diferentes tejidos para mediar la NP no autónoma de células en un organismo.

Introducción

La proteostasis celular es monitoreada por una intrincada red de componentes de control de calidad de proteínas, como chaperonas moleculares, respuestas al estrés y mecanismos de degradación, incluido el sistema de proteasoma de ubiquitina (UPS) y la autofagia ^1,2. La activación de las vías de respuesta al estrés, como la respuesta de choque térmico mediada por HSF-1 (HSR), la respuesta proteica desplegada del retículo endoplásmico (UPR^ER) y las mitocondrias (UPR^mito) es vital para la adaptación celular y la supervivencia durante los desafíos ambientales o la enfermedad de plegamiento incorrecto de proteínas que conducen a la agregación de proteínas tóxicas 1,2,3,4,5^{, 6}.

La proteostasis celular está coordinada por una capa adicional en organismos multicelulares, como C. elegans, que requiere la orquestación de respuestas de estrés celular en diferentes tejidos para activar componentes protectores de control de calidad de proteínas, como las chaperonas moleculares⁷. En la última década, se ha observado la activación no autónoma de las vías de respuesta al estrés "celulares" para la respuesta al choque térmico (HSR), el^RE UPR y el^mito UPR, así como la señalización de chaperonas transcelulares (TCS)^3,4,7,8,9,10. En cada caso, el sistema nervioso, así como la señalización del intestino, desempeña un papel crucial en el control de la activación de chaperonas a través de los tejidos, para proteger contra las consecuencias tóxicas del estrés agudo y crónico por plegamiento incorrecto de proteínas 3,5,9,11. Esta transmisión de las neuronas al intestino y a otras células de la periferia puede ser lograda por neurotransmisores, como es el caso del^RE UPR y el HSR ^6,8,11. En una forma de señalización de estrés no autónoma de las células, TCS, que se activa por el aumento de la expresión de HSP-90 en las neuronas, los péptidos inmunes secretados desempeñan un papel en la activación de la expresión de chaperonas hsp-90 de las neuronas^{al músculo.} En otra forma de TCS, la reducción de la expresión de la chaperona molecular principal hsp-90 en el intestino conduce a un aumento de la expresión de hsp-70 inducible por calor a temperatura permisiva en el músculo de la pared corporal ^5,10. Sin embargo, en este caso particular, se desconocen las moléculas de señalización específicas activadas en el intestino que percibe el estrés y las células musculares que responden.

Por lo tanto, para identificar cómo se activa la expresión de chaperonas de un tejido a otro, se requiere un enfoque que permita monitorear la capacidad de la red de proteostasis (NP) y la activación de la respuesta al estrés a nivel específico del tejido. Para investigar qué vía de respuesta al estrés se activa en los tejidos individuales, se puede utilizar una selección disponible de reporteros de chaperonas transcripcionales fusionados con marcadores de proteínas fluorescentes (véase también la Tabla 3). Estos incluyen reporteros transcripcionales hsp-90, hsp-70 y hsp-16.2 marcados con fluorescencia que indican la inducción del HSR, hsp-4 que indica la activación del^RE UPR y hsp-6, que indica el^mito UPR. La combinación de estos reporteros con una condición de estrés específica del tejido permite una lectura potente que identificará los tejidos individuales que responden a un desequilibrio de la NP en un tejido "emisor" distal que percibe el estrés. Para inducir una condición de estrés o desequilibrio de la NP en un tejido específico, se pueden tomar diferentes enfoques. Por ejemplo, uno de estos enfoques es mediante la expresión ectópica de la forma activada de un factor de transcripción de estrés (p. ej., xbp-1s) y otro es mediante la reducción de los niveles de expresión de una chaperona molecular esencial (p. ej., hsp-90) utilizando promotores específicos de tejido ^8,10. Para agotar los componentes de PN en un solo tipo de célula, la eliminación específica de tejidos por ARNi es una herramienta útil.

Sin embargo, en C. elegans, el ARNi es sistémico; el ARN bicatenario en el medio ambiente puede entrar y propagarse por todo el animal para silenciar un gen objetivo^12,13. Esta diseminación sistémica del dsRNA ingerido está mediada por proteínas SID (ARNi sistémico defectuoso), como las proteínas SID-1 y SID-2 que son transportadoras de dsRNA, así como por el SID-5, que se colocaliza con las proteínas del endosoma tardío y está implicado en la exportación del dsRNA^ingerido 14,15,16. SID-1 es una proteína transmembrana de múltiples pasos en todas las células, excepto en las neuronas, y es necesaria para la exportación e importación de dsRNA a las células¹⁷. La expresión de SID-2 está restringida al intestino, donde funciona como un receptor endocítico para el dsRNA ingerido desde la luz intestinal hacia el citoplasma de las células intestinales¹⁶. Las neuronas carecen de una respuesta al ARNi sistémico, y esto se correlaciona con una expresión reducida de la proteína transmembrana SID-1 en las neuronas, que es esencial para que el dsRNA sea importado^15,18. Por lo tanto, para que el ARNi específico de tejido sea eficaz en un solo tipo de célula, es necesario evitar la propagación sistémica del dsRNA. Esto se puede lograr utilizando el mutante sid-1 resistente al ARNi (pk3321) que impide la liberación y absorción de dsRNA a través de los tejidos¹⁵. La expresión de una construcción de ARNi de horquilla específica de tejido en este mutante o la expresión ectópica de SID-1 en un tejido específico puede complementar la función de SID-1 mutante y permitirá un ARNi¹⁹ específico de tejido.

Entonces, ¿cómo es el dsRNA ingerido por el intestino en un mutante de pérdida de función SID-1 y cómo puede llegar a las neuronas o células musculares que expresan ectópicamente una construcción SID-1? En un modelo actual que explica este mecanismo, el dsRNA endocitado se absorbe en el citoplasma intestinal a través de SID-2 y luego se exporta al pseudoceloma por otro mecanismo independiente de SID-1, que involucra SID-5 y transcitosis¹⁷. Por lo tanto, debido a que SID-1 es necesario para la importación de dsRNA¹⁷, solo las células que expresan SID-1 de tipo salvaje podrán absorber el dsRNA liberado desde el intestino en el pseudoceloma.

Aquí demostramos el uso de un conjunto de herramientas que permiten el ARNi específico de tejido. Utilizamos el ejemplo de la chaperona molecular Hsp90 para describir la construcción de ARNi de horquilla que puede ser útil para derribar constitutivamente la expresión génica en un tejido específico¹⁰. El enfoque descrito podría utilizarse para cualquier gen diana de interés. La respuesta de otros tejidos al desequilibrio de la proteostasis causado por el ARNi hsp-90 específico del tejido puede sondearse mediante el seguimiento de la expresión de reporteros de estrés marcados con fluorescencia en otros tejidos. Como segundo método para el ARNi específico de tejido, demostramos cómo el sistema mutante sid-1 se puede adaptar para alimentar a bacterias que expresan ARNi en lugar de expresar una construcción de ARNi de horquilla. Esto puede ser útil cuando se realiza un cribado de ARNi candidato o de todo el genoma para identificar los componentes necesarios para una respuesta específica de tejido. Del mismo modo, los defectos de desarrollo asociados con el agotamiento de un componente vital de la NP requerirán la eliminación mediada por ARNi en tejidos específicos en etapas posteriores del desarrollo. Demostramos cómo se puede utilizar un sistema de complementación de SID-1 en un cribado de ARNi candidato para modificadores TCS específicos de tejido. En el ejemplo, nuestro objetivo es identificar los componentes de señalización que, al ser golpeados en el tejido emisor "que percibe el estrés" (intestino) y el tejido que afecta el estrés (músculo) conducen al cambio en la expresión de un reportero hsp-70 marcado con fluorescencia en las células musculares.

Protocolo

1. ARNi específico de tejido de dos maneras: ARNi de horquilla y complementación de SID-1 específico de tejido

1. Generación de construcciones de ARNi de horquilla para la expresión específica de tejido en mutantes sid-1
   1. Amplifique la secuencia del gen diana (por ejemplo, la secuencia hsp-90 aislada del clon de ARNi hsp-90 de la biblioteca de ARNi de Ahringer²⁰) mediante PCR. Coloque una secuencia no palindrómica en el extremo 3' de la secuencia hsp-90 , es decir, un sitio SfiI (ATCTA)²¹.
      NOTA: Los cebadores utilizados para clonar el hsp-90 con la secuencia SfiI (subrayados) son:
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
   2. Subclonar la secuencia amplificada en el vector del kit de clonación comercial (por ejemplo, TOPO pCR BluntII).
   3. Aislar la secuencia hsp-90 invertida del clon de ARNi hsp-90 (biblioteca de ARNi de Ahringer)²⁰ mediante digestión de restricción utilizando sitios de restricción XbaI y PstI y colocarla aguas abajo de la secuencia hsp-90-SfiI en el vector (desde el paso 1.1.1), dando como resultado una construcción de horquilla hsp-90 (Figura 1).
   4. Subclonar la construcción de horquilla en un vector de entrada de Gateway pDONR221 y fusionarla con clones de entrada de Gateway que contienen promotores específicos de tejido para cualquiera de las expresiones en neuronas (rgef-1p); en el intestino (VHA-6P); o el músculo de la pared corporal (unc-54p) y el unc-54 3'UTR (o cualquier otro 3'UTR de elección) en una reacción de puerta de enlace como se describe en el protocolo del proveedor.
   5. Linealizar las construcciones de ARNi de horquilla resultantes (Figura 1) utilizando un sitio de restricción único fuera de la secuencia codificante y microinyectar como una matriz compleja a una concentración de 1 ng/μL de construcción de ARNi de horquilla, mezclado con 100 ng/μL de ADN genómico N2 Bristol (digerido con ScaI) en una cepa de C. elegans que expresa el reportero hsp-70p::RFP (cepa AM722) y cruzada con el fondo genético de sid-1 (pk3321) mutantes (cepa NL3321). Para obtener un protocolo sobre cómo realizar la microinyección de matrices complejas, siga^{el 22}.
   6. Como control negativo, utilice construcciones de horquilla de vector vacío que expresen la secuencia que contiene SfiI no palindrómica (GGCCATCTAGGCC) bajo el control de un promotor específico de tejido.
   7. Utilice el aumento de la expresión de hsp-70p::RFP del reportero como lectura para puntuar los transformantes positivos que expresan el ARNi de horquilla de hsp-90 (Figura 3). Para un enfoque más general para verificar la eliminación específica del tejido de cualquier gen de interés, mida los niveles de ARNm de animales enteros mediante qRT-PCR del gen de interés.
   8. Integrar la matriz extracromosómica de la cepa resultante que expresa la construcción de horquilla hsp-90 específica del intestino (PVH2; ver Tabla 1) mediante irradiación gamma. Para la integración de las matrices extracromosómicas en el genoma, véase²².
2. Expresión de SID-1 específica de tejido para permitir ARNi específico de tejido mediante la alimentación de bacterias que expresan dsRNA
   1. Subclonar el ADN genómico sid-1 del vector TU867 (unc-119p::SID-1)¹⁹ en el vector de entrada de puerta de enlace pDONR221. Los cebadores para la clonación de ADN sid-1 se pueden encontrar en¹⁹. Fusionar la construcción sid-1 pDONR221 con clones de entrada Gateway que contengan promotores específicos de músculo (myo-3p) o intestino (vha-6p) y el unc-54 3'UTR (o cualquier otro 3'UTR de elección) en la reacción de Gateway como se describe anteriormente en 1.1.4.
   2. Microinyecte las construcciones resultantes vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR o myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR a una concentración de 30 ng/μL junto con un marcador de coinyección faríngeo fluorescente rojo (p. ej., myo-2p::RFP; 5 ng/μL) en mutantes sid-1(pk3321).
   3. Integrar las matrices extracromosómicas de sid-1 específicas del intestino o del músculo en el genoma como se describe en el^{artículo 22}. En este caso, esto dio lugar a las cepas PVH5 [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) y PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; SID-1 (PK3321).
   4. Para la expresión neuronal específica de sid-1 en el mutante sid-1(pk3321), use la cepa TU3401 uIs3401[unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) que fue generado previamente por Calixto et ^al.19.
   5. Como se mencionó en 1.1.7, asegure la eliminación específica del tejido del gen de interés midiendo los niveles de ARNm del gen diana deseado mediante qRT-PCR. Alternativamente, confirme la sensibilidad del ARNi específico del tejido mediante el uso de una proteína fluorescente (por ejemplo, GFP o RFP) expresada en el mismo tejido y trate los gusanos con GFP o RFP RNAi. Exponga los nematodos a GFP/RFP RNAi como larvas sincronizadas en etapa L1 y crezca en las bacterias RNAi hasta el día 1 de la edad adulta (ver Figura 2). En nuestro caso, utilizamos cepas que expresan SID-1 en las neuronas, el músculo o el intestino y las cruzamos en cepas que expresan HSP-90::RFP en las neuronas (AM987), en el intestino (AM986) y en el músculo (AM988).

2. Uso de reporteros de estrés y sensores de proteostasis para monitorear la proteostasis celular autónoma y no autónoma de la célula

NOTA: Para monitorizar la capacidad de la NP en tejidos específicos, utilice sensores de proteostasis específicos de tejido (como las cepas que expresan Q44 en el intestino o Q35 en el músculo – ver Tabla 3) y reporteros de estrés (como el reportero hsp-70p::mCherry inducible por calor; Tabla 3).

1. Cruzando genéticamente el alelo mutante sid-1 (pk3321) en una cepa sensora de proteostasis y confirmando la presencia de sid-1 (pk3321) alimentando ARNi
   1. Cruzar genéticamente la cepa del sensor de proteostasis/reportero de estrés con el fondo genético de la cepa mutante sid-1 (pk3321). Para establecer cruzamientos genéticos entre diferentes cepas transgénicas, siga el²³ para obtener un protocolo detallado.
      NOTA: Los mutantes sid-1(pk3321) son resistentes a la alimentación con ARNi y, por lo tanto, el tratamiento de embriones con ARNi contra un gen esencial (como elt-2 o hsp-90) solo conducirá a detenciones del desarrollo o letalidad larvaria en cepas heterocigóticas o de tipo salvaje para el gen sid-1 .
   2. Deje que 10 hermafroditas grávidos pongan huevos en placas de ARNi contra elt-2 o hsp-90 y controle (vector vacío; EV) Placas de ARNi a 20 °C. Retire las madres después de 1 a 2 h. Utilice N2 Bristol y el mutante sid-1(pk3321) como controles.
   3. Observe el desarrollo de las larvas en las placas de ARNi durante los próximos 2-3 días. ELT-2 El ARNi dará lugar a la detención de las larvas L1, mientras que el ARNi de hsp-90 dará lugar a la detención de las larvas L3 en N2 Bristol. Los mutantes sid-1 no se verán afectados por el tratamiento con ARNi y se convertirán en adultos grávidos.
      NOTA: El homocigoto de C. elegans para sid-1 (pk3321) mostrará una población uniforme que se desarrolla hasta la edad adulta. Los heterocigotos estarán indicados por poblaciones mixtas de algunos animales que muestran detención larvaria, y algunos animales que se convierten en adultos.
2. Confirmación de la presencia de sid-1(pk3321) por genotipado
   1. Recoger 15-20 gusanos de la cepa F2 candidata seleccionada en un tubo de PCR que contenga 15 μL de tampón de lisis de lombrices (Tabla 2).
   2. Coloque el tubo a -80 °C durante al menos 10 minutos o toda la noche.
   3. Incubar el tubo en la máquina de PCR utilizando el siguiente programa:
   4. 65 °C durante 60 min (gusano de lisis); 95 °C durante 15 min (inactiva la proteinasa K); mantener a 4 °C.
   5. Utilice 2 μL del lisado de lombriz como "plantilla" para realizar la reacción de PCR para el genotipado, utilizando los siguientes cebadores para sid-1: sid-1 forw: 5'-agctctgtacttgtattcg-3' y sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
   6. Utilice el siguiente programa para el genotipado por PCR: 1 ciclo a 95 °C durante 3 min; luego 30 ciclos de 95 °C durante 10 , 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; 1 ciclo a 72 °C durante 10 min, mantener a 4 °C.
   7. Purifique el producto de PCR de ~650 pb utilizando un kit de purificación de PCR (Tabla de materiales) y secuencie el producto de PCR sid-1 para identificar la mutación puntual G-a-A del alelo sid-1 (pk3321). Alternativamente, la mutación puntual G-a-A crea un sitio de restricción de ApoI, que se puede utilizar en el producto de PCR para el genotipado, como se describe en el^{punto 24}.
3. Uso de iQ44::YFP como sensor de proteostasis para el intestino
   1. Sincronizar C. elegans expresando Q44::YFP en el intestino (cepa OG412) o cruzado con el fondo mutante sid-1(pk3321) mediante blanqueo, siguiendo el protocolo descrito en²⁵. Coloque las larvas L1 sincronizadas en una placa de agar y medio de crecimiento de nematodos (NGM) de 9 cm que contenga la bacteria OP50 y crezca hasta la etapa L4 a 20 °C.
   2. Recoge animales L4 lavando los gusanos del plato con 5 mL de tampón M9. Transfiera el tampón M9 que contiene lombrices L4 a un tubo de 15 ml con una pipeta de vidrio o una pipeta de plástico siliconado, y centrifugue a 1000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente para granular suavemente las lombrices. Retire el sobrenadante con cuidado, asegurándose de dejar la pelletza de lombriz intacta.
   3. Paso crítico: Para transferir o eliminar nematodos, use una pipeta de vidrio o una punta de pipeta de plástico que haya sido tratada con un agente siliconante (por ejemplo, SigmaCote) siguiendo las instrucciones del fabricante. Esto evita que los gusanos se peguen a la superficie de plástico de la punta de una pipeta.
   4. Repita el paso 2.3.2 tres veces más para lavar todas las bacterias OP50 de los gusanos.
   5. Tome el gránulo de lombriz en 5 mL de tampón M9 y cuente el número de gusanos presentes en 10 μL.
   6. Colocar los animales L4 en placas de agar NGM de 6 cm que contengan bacterias de control de vectores vacíos (EV) o ARNi hsp-90 a una densidad de 10 gusanos por placa (preparar 5 placas por punto de tiempo y replicar biológicamente) e incubar durante 24 -48 horas a 20 °C.
   7. Después de 24 horas (=Día 1 adultos) y 48 horas (=Día 2 adultos) se cuenta el número de focos Q44 en los intestinos de los nematodos que exhiben agregados. Puntúa un total de 30-50 nematodos por réplica biológica.

3. Cribado de ARNi candidato a tejido específico para modificadores de la proteostasis celular no autónoma

NOTA: Para el cribado de ARNi específico de tejido, utilizamos la cepa PVH172, que permite el ARNi específico del intestino mediante la alimentación de bacterias RNAi y la cepa PVH171, que permite el ARNi específico del músculo (véase la Tabla 1 para el genotipo).

1. Preparación de las placas candidatas de ARNi
   1. Prepare placas de agar NGM de 6 cm suplementadas con 100 μg/mL de ampicilina, 12,5 μg/mL de tetraciclina y 1 mM de IPTG de acuerdo con los métodos estándar²⁵.
   2. Utilice la biblioteca de ARNi de Ahringer para obtener los clones de ARNi candidatos para el cribado de ARNi²⁰.
   3. Inocular 3 mL de medio LB-amp (50 μg/mL de ampicilina en medio LB) en un tubo de 15 mL con el clon de ARNi deseado utilizando una punta de pipeta de plástico. Crecer a 37 °C durante la noche con agitación.
   4. Al día siguiente, agregue isopropil-b-D-tiogalactopiranosida (IPTG) (de un stock de 1 M) a una concentración final de 1 mM en el cultivo bacteriano durante la noche.
   5. Agitar los cultivos durante 3 h más a 37 °C.
   6. Placa de 300 μL de cultivo de ARNi bacteriano en una placa de agar NGM de 6 cm suplementada con 100 μg/mL de ampicilina, 12,5 μg/mL de tetraciclina y 1 mM de IPTG. Deje que las placas se sequen en el banco durante 2 días a temperatura ambiente, cubiertas con papel de aluminio para protegerlas de la luz. Una vez secas, las placas de ARNi pueden almacenarse en una caja a 4 °C durante varias semanas.
2. Sincronización de C. elegans y tratamiento con bacterias RNAi
   1. Para sincronizar las cepas de gusanos, elija 15 adultos grávidos en placas de ARNi y deje poner huevos durante 1 h. A continuación, retira los adultos del plato.
   2. Paso crítico: En este caso, se evita la sincronización por blanqueo, ya que puede inducir el reportero hsp-70p::RFP , ya que es una condición estresante para C. elegans.
   3. Elija las larvas sincronizadas en etapa L4 y transfiéralas a una placa de ARNi fresca.
   4. Permitir que los nematodos crezcan en el ARNi relevante durante dos generaciones para garantizar una absorción eficiente del dsRNA, asegurándose de que la temperatura se mantenga a 20 °C.
   5. Para la obtención de imágenes y la cuantificación de fluorescencia hsp-70p::RFP , utilice adultos del día 1.
3. Preparación de portaobjetos de microscopio
   1. Prepare los portaobjetos del microscopio colocando ~250 μL de una solución de agarosa al 2% (en tampón M9) sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio y coloque un segundo portaobjetos encima para crear un disco plano.
   2. Coloque 5 μL de solución de 5 mM de levamisol (en tampón M9) en la almohadilla de agarosa establecida y transfiera 5 gusanos adultos del Día 1 a la gota de Levamisol. Deja que los nematodos se paralicen durante 5 min.
   3. Una vez que C. elegans esté paralizado, alinéelo cuidadosamente con un pico de alambre de platino y elimine el exceso de levamisol con una toallita de laboratorio antes de agregar un cubreobjetos.
   4. Paso crítico: Asegúrese de tomar imágenes de los gusanos dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación de los portaobjetos del microscopio. Los nematodos paralizados en el portaobjetos del microscopio pueden secarse y reventar, lo que puede comprometer las mediciones de fluorescencia.
4. Ajustes del microscopio y análisis de imágenes
   NOTA: Las imágenes se obtienen utilizando un microscopio confocal equipado con una cámara EM-CCD y un software de automatización y análisis de imágenes de microscopía.
   1. Tome imágenes con aumentos de 10x utilizando un láser de 561 nm para la excitación de fluorescencia RFP. Asegúrese de que todas las imágenes se tomen con los mismos ajustes de potencia láser, tamaño de orificio y ganancia de fluorescencia para permitir las comparaciones.
   2. Guarde todas las imágenes como archivos TIFF.
   3. Realice análisis de imágenes con ImageJ. Mida la intensidad de fluorescencia en cada imagen como píxeles por unidad de área, restando la fluorescencia de fondo. Normalice la intensidad de fluorescencia de cada imagen al área de la imagen, así como la longitud de los gusanos.
   4. Mida la intensidad media con Analizar | Medir en ImageJ. Normalice el valor de intensidad resultante al área de la imagen dividiendo la intensidad por el área.
   5. Para normalizar la intensidad de la longitud del gusano, mida el gusano dibujando una línea a lo largo de la longitud del gusano en ImageJ y utilizando Analizar | Medir. La razón para normalizar la intensidad de la fluorescencia a la longitud del gusano es que los gusanos pueden variar en tamaño, dependiendo del gen que es derribado por el ARNi, y esto podría afectar la intensidad media.
   6. Normalizar las intensidades de fluorescencia medidas a controles no tratados (es decir, C transgénico . elegans cultivados en placas de ARNi de control (EV). Agrupe los valores normalizados para comparar las intensidades medias de fluorescencia para cada condición de ARNi. El objetivo es obtener imágenes de 20 gusanos por réplica biológica y recopilar al menos 3 imágenes de réplicas biológicas.
   7. Calcule los valores P de los valores medios de intensidad de fluorescencia utilizando la prueba t de Student y realice una corrección para pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg, utilizando una tasa de falsos descubrimientos de 0,05.

Resultados

ARNi específico de tejido de dos maneras: Expresión de construcciones de horquilla o complementación de SID-1 específica de tejido
La expresión de construcciones de ARNi de horquilla específicas de tejido permite la eliminación constitutiva de un gen a lo largo del desarrollo. Sin embargo, esto a veces puede ser poco práctico cuando el gen estudiado es necesario para la organogénesis de ese tejido en particular, como elt-2 , que se requiere para el d...

Discusión

Los métodos aquí descritos demuestran el uso de herramientas que permiten la eliminación tisular específica de los componentes de la NP de una manera constitutiva y temporal. Hemos identificado previamente TCS, un mecanismo de respuesta al estrés no autónomo de las células que es inducido por la alteración específica del tejido de los niveles de expresión de Hsp90¹⁰. La eliminación tisular específica de hsp-90 por la expresión de ARNi de horq...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Merck	A0166-5G	Protocol Section 3.1.
DNA Clean & Concentrator-500	Zymo Research	D4031	Protocol Section 2.2.
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Merck	367-93-1	Protocol Section 3.1.
Multisite Gateway Cloning Kit	Thermo Fisher	12537100	Protocol Section 1.2.
SigmaCote	Merck	SL2-25mL	Protocol Section 2.3.
Tetracycline	Merck	T7660-5G	Protocol Section 3.1.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K280002	Protocol Section 1.1.