Strumenti RNAi tessuto-specifici per identificare i componenti per la segnalazione dello stress sistemico

Riepilogo

Il mantenimento della proteostasi dell'organismo richiede il coordinamento delle risposte di controllo della qualità delle proteine, come l'espressione dei chaperoni da un tessuto all'altro. Qui, forniamo strumenti utilizzati in C. elegans che consentono il monitoraggio della capacità di proteostasi in tessuti specifici e determinano le risposte di segnalazione intercellulare.

Abstract

Nell'ultimo decennio c'è stato un aumento trasformativo delle conoscenze relative alla regolazione dei processi di controllo della qualità delle proteine, svelando l'importanza dei processi di segnalazione intercellulare nella regolazione della proteostasi cellulare non autonoma. Studi recenti stanno ora iniziando a scoprire componenti e percorsi di segnalazione che coordinano il controllo della qualità delle proteine da un tessuto all'altro. È quindi importante identificare i meccanismi e i componenti della rete di proteostasi non autonoma (PN) cellulare e la sua rilevanza per l'invecchiamento, le risposte allo stress e le malattie da misfolding proteico. In laboratorio, utilizziamo il knockdown genetico da parte dell'RNAi tessuto-specifico in combinazione con reporter di stress e sensori di proteostasi tessuto-specifici per studiarlo. Descriviamo le metodologie per esaminare e identificare i componenti della PN cellula-non autonoma che possono agire nei tessuti che percepiscono una condizione di stress e nelle cellule che rispondono per attivare una risposta protettiva. Per prima cosa descriviamo come generare costrutti di RNAi a forcina per il knockdown genetico costitutivo in tessuti specifici e come eseguire il knockdown genetico tessuto-specifico alimentando l'RNAi in diverse fasi della vita. I reporter di stress e i saggi comportamentali funzionano come preziose letture che consentono lo screening rapido di geni e condizioni che modificano i processi di segnalazione dello stress sistemico. Infine, i sensori di proteostasi espressi in diversi tessuti vengono utilizzati per determinare i cambiamenti nella capacità tessuto-specifica del PN in diversi stadi di sviluppo e invecchiamento. Pertanto, questi strumenti dovrebbero aiutare a chiarire e consentire il monitoraggio della capacità della PN in tessuti specifici, aiutando al contempo a identificare i componenti che funzionano in diversi tessuti per mediare la PN non autonoma in un organismo.

Introduzione

La proteostasi cellulare è monitorata da un'intricata rete di componenti per il controllo della qualità delle proteine, come chaperoni molecolari, risposte allo stress e meccanismi di degradazione, tra cui il sistema del proteasoma ubiquitina (UPS) e l'autofagia ^1,2. L'attivazione delle vie di risposta allo stress, come la risposta allo shock termico mediata da HSF-1 (HSR), la risposta proteica dispiegata del reticolo endoplasmatico (UPR^ER) e dei mitocondri (UPR^mito) è vitale per l'adattamento cellulare e la sopravvivenza durante le sfide ambientali o la malattia da misfolding proteico che porta all'aggregazione proteica tossica 1,2,3,4,5^{, 6}.

La proteostasi cellulare è coordinata da uno strato aggiuntivo negli organismi multicellulari, come C. elegans, che richiede l'orchestrazione delle risposte cellulari allo stress attraverso diversi tessuti per attivare componenti protettivi di controllo della qualità delle proteine come gli chaperoni molecolari⁷. Nell'ultimo decennio, è stata osservata l'attivazione cellulare non autonoma delle vie di risposta allo stress "cellulare" per la risposta allo shock termico (HSR), l'UPR^ER e l'UPR^mito, così come la segnalazione transcellulare chaperone (TCS)3,4,7,8,9,10 . In ogni caso, il sistema nervoso e la segnalazione dall'intestino svolgono un ruolo cruciale nel controllo dell'attivazione degli chaperoni attraverso i tessuti, per proteggere dalle conseguenze tossiche degli stress acuti e cronici da misfolding proteico 3,5,9,11. Questa trasmissione dai neuroni all'intestino e ad altre cellule della periferia può essere ottenuta dai neurotrasmettitori, come nel caso dell'UPR^ER e dell'HSR ^6,8,11. In una forma di segnalazione cellulare non autonoma dello stress, TCS, che è attivata dall'aumentata espressione di HSP-90 nei neuroni, i peptidi immunitari secreti svolgono un ruolo nell'attivazione dell'espressione di hsp-90 chaperone dai neuroni al muscolo⁵. In un'altra forma di TCS, la riduzione dell'espressione del principale chaperone molecolare hsp-90 nell'intestino porta ad un aumento dell'espressione di hsp-70 inducibile dal calore a temperatura permissiva nel muscolo della parete corporea ^5,10. In questo caso particolare, le molecole di segnalazione specifiche attivate nell'intestino che percepisce lo stress e le cellule muscolari che rispondono sono, tuttavia, sconosciute.

Pertanto, al fine di identificare come l'espressione del chaperone viene attivata da un tessuto all'altro, è necessario un approccio che consenta di monitorare la capacità della rete di proteostasi (PN) e l'attivazione della risposta allo stress a livello tessuto-specifico. Per studiare quale via di risposta allo stress è attivata nei singoli tessuti, è possibile utilizzare una selezione disponibile di reporter chaperone trascrizionali fusi a tag proteici fluorescenti (vedi anche Tabella 3). Questi includono reporter trascrizionali hsp-90, hsp-70 e hsp-16.2 marcati in fluorescenza che indicano l'induzione dell'HSR, hsp-4 che indica l'attivazione^{dell'UPR ER} e hsp-6, che indica l'UPR^mito. La combinazione di questi reporter con una condizione di stress tessuto-specifica consente quindi una lettura potente che individuerà i singoli tessuti che rispondono a uno squilibrio del PN in un tessuto "trasmettitore" distale che percepisce lo stress. Per indurre una condizione di stress o uno squilibrio del PN in un tessuto specifico, si possono adottare diversi approcci. Ad esempio, uno di questi approcci consiste nell'espressione ectopica della forma attivata di un fattore di trascrizione dello stress (ad esempio, xbp-1s) e un altro consiste nel ridurre i livelli di espressione di un chaperone molecolare essenziale (ad esempio, hsp-90) utilizzando promotori tessuto-specifici ^8,10. Per esaurire i componenti del PN in un solo tipo di cellula, il knockdown tessuto-specifico da parte dell'RNAi è uno strumento utile.

In C. elegans, l'RNAi è comunque sistemico; l'RNA a doppio filamento nell'ambiente può entrare e diffondersi in tutto l'animale per silenziare un gene bersaglio^12,13. Questa diffusione sistemica del dsRNA ingerito è mediata dalle proteine SID (sistemiche RNAi difettose), come le proteine SID-1 e SID-2 che sono trasportatori di dsRNA, così come SID-5, che colocalizza con le proteine degli endosomi tardivi ed è implicata nell'esportazione del dsRNA ingerito 14,15,16. SID-1 è una proteina transmembrana multi-pass in tutte le cellule tranne i neuroni, ed è necessaria per l'esportazione di dsRNA e per l'importazione nelle cellule¹⁷. L'espressione di SID-2 è limitata all'intestino, dove funziona come recettore endocitico per il dsRNA ingerito dal lume intestinale nel citoplasma delle cellule intestinali¹⁶. I neuroni mancano di una risposta all'RNAi sistemico, e questo è correlato con una ridotta espressione della proteina transmembrana SID-1 nei neuroni, che è essenziale per l'importazione del dsRNA^15,18. Pertanto, affinché l'RNAi tessuto-specifico sia efficace in un solo tipo di cellula, è necessario prevenire la diffusione sistemica del dsRNA. Ciò può essere ottenuto utilizzando il mutante sid-1 (pk3321) resistente all'RNAi che impedisce il rilascio e l'assorbimento di dsRNA attraverso i tessuti¹⁵. L'espressione di un costrutto di RNAi a forcina tessuto-specifico in questo mutante o l'espressione ectopica di SID-1 in un tessuto specifico possono quindi integrare la funzione del mutante sid-1 e consentiranno l'RNAi tessuto-specifico¹⁹.

Quindi, come viene ingerito il dsRNA dall'intestino in un mutante con perdita di funzione di sid-1 e come può poi raggiungere i neuroni o le cellule muscolari che esprimono ectopicamente un costrutto SID-1? In un modello attuale che spiega questo meccanismo, il dsRNA endocitoso viene assorbito nel citoplasma intestinale tramite SID-2 e quindi esportato nello pseudoceloma da un altro meccanismo indipendente da SID-1, che coinvolge SID-5 e transcitosi¹⁷. Quindi, poiché SID-1 è necessario per l'importazione del dsRNA¹⁷, solo le cellule che esprimono SID-1 wild type saranno in grado di assorbire il dsRNA rilasciato dall'intestino nello pseudoceloma.

Qui dimostriamo l'uso di una serie di strumenti che consentono l'RNAi tessuto-specifico. Usiamo l'esempio del chaperone molecolare Hsp90 per descrivere la costruzione di RNAi a forcina che può essere utile per abbattere costitutivamente l'espressione genica in un tessuto specifico¹⁰. L'approccio descritto potrebbe essere utilizzato per qualsiasi gene bersaglio di interesse. La risposta di altri tessuti allo squilibrio della proteostasi causato dall'RNAi hsp-90 tessuto-specifico può essere sondata monitorando l'espressione di reporter di stress marcati in fluorescenza in altri tessuti. Come secondo metodo per l'RNAi tessuto-specifico, dimostriamo come il sistema mutante sid-1 possa essere adattato per l'alimentazione di batteri che esprimono RNAi piuttosto che l'espressione di un costrutto di RNAi a forcina. Questo può essere utile quando si esegue uno screening RNAi candidato o a livello di genoma per identificare i componenti necessari per una risposta tessuto-specifica. Allo stesso modo, i difetti di sviluppo associati alla deplezione di un componente vitale della PN richiederanno il knockdown mediato dall'RNAi in tessuti specifici nelle fasi successive dello sviluppo. Dimostriamo come un sistema di complementazione SID-1 possa essere utilizzato su uno screening RNAi candidato per modificatori TCS tessuto-specifici. Nell'esempio, miriamo a identificare i componenti di segnalazione che, in caso di knockdown nel tessuto trasmettitore "che percepisce lo stress" (intestino) e nel tessuto che influenza lo stress (muscolo) portano alla variazione dell'espressione di un reporter hsp-70 marcato in fluorescenza nelle cellule muscolari.

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Protocollo

1. RNAi tessuto-specifico in due modi: RNAi a forcina e complementazione SID-1 tessuto-specifica

1. Generazione di costrutti di RNAi a forcina per l'espressione tessuto-specifica nei mutanti sid-1
   1. Amplificare la sequenza genica bersaglio (ad esempio, la sequenza hsp-90 isolata dal clone RNAi hsp-90 dalla libreria Ahringer RNAi²⁰) mediante PCR. Posizionare una sequenza non palindromica all'estremità 3' della sequenza hsp-90 , che è un sito SfiI (ATCTA)²¹.
      NOTA: I primer utilizzati per la clonazione dell'hsp-90 con la sequenza SfiI (sottolineata) sono:
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
   2. Subclonare la sequenza amplificata nel vettore del kit di clonazione commerciale (ad esempio, TOPO pCR BluntII).
   3. Isolare la sequenza hsp-90 invertita dal clone di RNAi hsp-90 (libreria di RNAi Ahringer)²⁰ mediante digestione di restrizione utilizzando i siti di restrizione XbaI e PstI e posizionarla a valle della sequenza hsp-90-SfiI nel vettore (dal passaggio 1.1.1), ottenendo un costrutto a forcina hsp-90 (Figura 1).
   4. Subclonare il costrutto hairpin in un vettore di ingresso Gateway pDONR221 e fonderlo con cloni di ingresso Gateway che contengono promotori tessuto-specifici per entrambe le espressioni nei neuroni (rgef-1p); nell'intestino (VHA-6P); o il muscolo della parete corporea (unc-54p) e l'unc-54 3'UTR (o qualsiasi altro 3'UTR a scelta) in una reazione Gateway come descritto nel protocollo del fornitore.
   5. Linearizzare i costrutti di RNAi a forcina risultanti (Figura 1) utilizzando un sito di restrizione unico al di fuori della sequenza codificante e microiniettare come array complesso a una concentrazione di 1 ng/μL di costrutto di RNAi a forcina, miscelato con 100 ng/μL di DNA genomico Bristol N2 (digerito con ScaI) in un ceppo di C. elegans che esprime il reporter hsp-70p::RFP (ceppo AM722) e incrociato nel background genetico di sid-1 (pk3321) mutanti (ceppo NL3321). Per un protocollo su come eseguire la microiniezione di array complessi, seguire²².
   6. Come controllo negativo, utilizzare costrutti a forcina vettoriale vuoti che esprimono la sequenza non palindromica contenente SfiI (GGCCATCTAGGCC) sotto il controllo di un promotore tessuto-specifico.
   7. Utilizzare l'aumento dell'espressione hsp-70p::RFP del reporter come lettura per valutare i trasformanti positivi che esprimono l'RNAi a forcina hsp-90 (Figura 3). Per un approccio più generale per verificare il knock-down tessuto-specifico di qualsiasi gene di interesse, misurare i livelli di mRNA dell'intero animale utilizzando la qRT-PCR del gene di interesse.
   8. Integrare l'array extracromosomico del ceppo risultante che esprime il costrutto a forcina hsp-90 specifico per l'intestino (PVH2; vedi Tabella 1) mediante irradiazione gamma. Per l'integrazione delle matrici extracromosomiche nel genoma, vedere²².
2. Espressione di SID-1 tessuto-specifica per consentire la produzione di RNAi tessuto-specifici alimentando i batteri che esprimono dsRNA
   1. Subclonare il DNA genomico sid-1 dal vettore TU867 (unc-119p::SID-1)¹⁹ nel vettore di ingresso Gateway pDONR221. I primer per la clonazione del DNA sid-1 possono essere trovati in¹⁹. Fondere il costrutto sid-1 pDONR221 con cloni di ingresso Gateway contenenti promotori specifici del muscolo (myo-3p) o dell'intestino (vha-6p) e l'unc-54 3'UTR (o qualsiasi altro 3'UTR a scelta) nella reazione Gateway come descritto in precedenza in 1.1.4.
   2. Microiniettare i costrutti risultanti vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR o myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR a una concentrazione di 30 ng/μL insieme a un marcatore di co-iniezione faringea fluorescente rosso (ad esempio, myo-2p::RFP; 5 ng/μL) in mutanti sid-1(pk3321 ).
   3. Integrare gli array di sid-1 extracromosomici specifici per l'intestino o il muscolo nel genoma come descritto in²². Qui, questo ha portato a ceppi PVH5 [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) e PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; SID-1 (PK3321).
   4. Per l'espressione neurone-specifica di sid-1 nel mutante sid-1(pk3321), utilizzare il ceppo TU3401 uIs3401[unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) che è stato generato in precedenza da Calixto et ^al.19.
   5. Come accennato in 1.1.7, garantire il knockdown tessuto-specifico del gene di interesse misurando i livelli di mRNA del gene bersaglio desiderato mediante qRT-PCR. In alternativa, confermare la sensibilità all'RNAi tessuto-specifica utilizzando una proteina fluorescente (ad es. GFP o RFP) espressa nello stesso tessuto e trattare i vermi con GFP o RFP RNAi. Esporre i nematodi all'RNAi GFP/RFP come larve sincronizzate allo stadio L1 e crescere sui batteri RNAi fino al primo giorno dell'età adulta (vedi Figura 2). Nel nostro caso, abbiamo utilizzato ceppi che esprimono SID-1 nei neuroni, nel muscolo o nell'intestino e incrociati in ceppi che esprimono HSP-90::RFP nei neuroni (AM987), nell'intestino (AM986) e nel muscolo (AM988).

2. Utilizzo di segnalatori di stress e sensori di proteostasi per monitorare la proteostasi cellulare autonoma e cellulare non autonoma

NOTA: Per monitorare la capacità di PN in tessuti specifici, utilizzare sensori di proteostasi tessuto-specifici (come i ceppi che esprimono Q44 nell'intestino o Q35 nel muscolo - vedere Tabella 3) e reporter di stress (come il reporter hsp-70p::mCherry inducibile dal calore; Tabella 3).

1. Incrocio genetico dell'allele mutante sid-1 (pk3321) in un ceppo sensore di proteostasi e conferma della presenza di sid-1 (pk3321) alimentando RNAi
   1. Incrociare geneticamente il ceppo sensore di proteostasi/reporter di stress nel background genetico del ceppo mutante sid-1 (pk3321). Per stabilire incroci genetici tra diversi ceppi transgenici, si prega di seguire²³ per un protocollo dettagliato.
      NOTA: i mutanti sid-1 (pk3321) sono resistenti all'alimentazione con RNAi e quindi il trattamento di embrioni con RNAi contro un gene essenziale (come elt-2 o hsp-90) porterà solo ad arresti dello sviluppo o letalità larvale in ceppi eterozigoti o wildtype per il gene sid-1.
   2. Lasciare che 10 ermafroditi gravidi depongano le uova su piastre RNAi contro elt-2 o hsp-90 e controllare (vettore vuoto; EV) Piastre RNAi a 20 °C. Rimuovere le madri dopo 1 - 2 ore. Utilizzare N2 Bristol e il mutante sid-1 (pk3321) come controlli.
   3. Osservare lo sviluppo delle larve sulle piastre RNAi nei prossimi 2-3 giorni. elt-2 L'RNAi provoca l'arresto larvale L1, mentre l'RNAi hsp-90 provoca l'arresto larvale L3 in N2 Bristol. I mutanti di sid-1 non saranno influenzati dal trattamento con RNAi e si svilupperanno in adulti gravidi.
      NOTA: L'omozigote di C. elegans per sid-1(pk3321) mostrerà una popolazione uniforme che si sviluppa fino all'età adulta. Gli eterozigoti saranno indicati da popolazioni miste di alcuni animali che mostrano arresto larvale e da alcuni animali che si sviluppano in adulti.
2. Conferma della presenza di sid-1 (pk3321) mediante genotipizzazione
   1. Prelevare 15-20 vermi del ceppo F2 candidato selezionato in una provetta PCR contenente 15 μl di tampone per lisi dei vermi (Tabella 2).
   2. Posizionare la provetta a -80 °C per almeno 10 minuti o durante la notte.
   3. Incubare la provetta nella macchina per PCR utilizzando il seguente programma:
   4. 65 °C per 60 min (verme di lisi); 95 °C per 15 min (inattivare la proteinasi K); mantenere a 4 °C.
   5. Utilizzare 2 μL di lisato di vermi come "modello" per eseguire la reazione PCR per la genotipizzazione, utilizzando i seguenti primer per sid-1: sid-1 forw: 5'-agctctgtacttgtattcg-3' e sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
   6. Utilizzare il seguente programma per la genotipizzazione PCR: 1 ciclo a 95 °C per 3 min; poi 30 cicli a 95 °C per 10 , 55 °C per 30 s e 72 °C per 30 s; 1 ciclo a 72 °C per 10 min, mantenimento a 4 °C.
   7. Purificare il prodotto PCR da ~650 bp utilizzando un kit di purificazione PCR (Tabella dei materiali) e sequenziare il prodotto PCR sid-1 per identificare la mutazione puntiforme da G ad A dell'allele sid-1 (pk3321). In alternativa, la mutazione puntiforme G-to-A crea un sito di restrizione ApoI, che può essere utilizzato sul prodotto PCR per la genotipizzazione come descritto in²⁴.
3. Utilizzo di iQ44::YFP come sensore di proteostasi per l'intestino
   1. Sincronizzare C. elegans che esprime Q44::YFP nell'intestino (ceppo OG412) o attraversato nel fondo mutante sid-1(pk3321) mediante sbiancamento, seguendo il protocollo descritto in²⁵. Piastra sincronizzata delle larve L1 su una piastra di 9 cm di terreno di crescita per nematodi (NGM)-agar contenente batteri OP50 e crescita fino allo stadio L4 a 20 °C.
   2. Raccogli gli animali L4 lavando via i vermi dalla piastra usando 5 ml di tampone M9. Trasferire il tampone M9 contenente vermi L4 in una provetta da 15 ml utilizzando una pipetta di vetro o una pipetta di plastica siliconata e centrifugare a 1000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente per pellettare delicatamente i vermi. Rimuovere con cura il surnatante, assicurandosi di lasciare indisturbato il pellet del verme.
   3. Passaggio critico: per trasferire o impiattare i nematodi, utilizzare una pipetta di vetro o un puntale di plastica trattato con un agente siliconato (ad es. SigmaCote) seguendo le istruzioni del produttore. In questo modo si evita che i vermi si attacchino alla superficie in plastica del puntale di una pipetta.
   4. Ripetere il passaggio 2.3.2 altre tre volte per lavare via tutti i batteri OP50 dai vermi.
   5. Prelevare il pellet di verme in 5 mL di tampone M9 e contare il numero di vermi presenti in 10 μL.
   6. Piastra L4 di animali su piastre NGM Agar da 6 cm contenenti batteri RNAi di controllo vettoriale (EV) vuoto o hsp-90 ad una densità di 10 vermi per piastra (preparare 5 piastre per punto temporale e replicare biologicamente) e incubare per 24-48 ore a 20 °C.
   7. Dopo 24 ore (=Giorno 1 adulti) e 48 ore (=Giorno 2 adulti) contare il numero di focolai di Q44 nell'intestino dei nematodi che presentano aggregati. Punteggio totale di 30-50 nematodi per replica biologica.

3. Screening dell'RNAi candidato tessuto-specifico per modificatori della proteostasi cellulare non autonoma

NOTA: Per lo screening dell'RNAi tessuto-specifico abbiamo utilizzato il ceppo PVH172 che consente l'RNAi specifico dell'intestino alimentando i batteri RNAi e il ceppo PVH171 che consente l'RNAi muscolo-specifico (vedere la Tabella 1 per il genotipo).

1. Preparazione delle piastre RNAi candidate
   1. Preparare piastre per agar NGM da 6 cm integrate con 100 μg/mL di ampicillina, 12,5 μg/mL di tetraciclina e 1 mM di IPTG secondo i metodi standard²⁵.
   2. Utilizzare la libreria Ahringer RNAi per ottenere i cloni RNAi candidati per lo screening RNAi²⁰.
   3. Inoculare 3 mL di terreno LB-amp (50 μg/mL di ampicillina in terreno LB) in una provetta da 15 mL con il clone di RNAi desiderato utilizzando un puntale per pipetta in plastica. Crescere a 37 °C durante la notte con agitazione.
   4. Il giorno successivo aggiungere Isopropyl-b-D-tiogalactopyranosid (IPTG) (da un ceppo da 1 M) a una concentrazione finale di 1 mM nella coltura batterica notturna.
   5. Agitare le colture per altre 3 ore a 37 °C.
   6. Piastra 300 μL di coltura batterica di RNAi su una piastra di agar NGM da 6 cm integrata con 100 μg/mL di ampicillina, 12,5 μg/mL di tetraciclina e 1 mM di IPTG. Lasciate asciugare i piatti sul banco per 2 giorni a temperatura ambiente, coperti con un foglio di alluminio per proteggerli dalla luce. Una volta asciutte, le piastre RNAi possono essere conservate in una scatola a 4 °C per diverse settimane.
2. Sincronizzazione di C. elegans e trattamento con batteri RNAi
   1. Per sincronizzare i ceppi di vermi, prelevare 15 adulti gravidi su piastre RNAi e lasciare deporre le uova per 1 ora. Quindi rimuovere gli adulti dal piatto.
   2. Passaggio critico: In questo caso si evita la sincronizzazione mediante sbiancamento, perché può indurre il reporter hsp-70p::RFP , poiché è una condizione stressante per C. elegans.
   3. Prelevare le larve sincronizzate dello stadio L4 e trasferirle su una piastra RNAi fresca.
   4. Lasciare che i nematodi crescano sull'RNAi pertinente per due generazioni per garantire un assorbimento efficiente del dsRNA, assicurandosi che la temperatura sia mantenuta a 20 °C.
   5. Per l'imaging e la quantificazione della fluorescenza hsp-70p::RFP , utilizzare il giorno 1 adulti.
3. Preparazione di vetrini per microscopio
   1. Preparare i vetrini da microscopio posizionando ~250 μL di una soluzione di agarosio al 2% (in tampone M9) su un vetrino da microscopio e un secondo vetrino posizionato sopra per creare un disco piatto.
   2. Posizionare 5 μL di soluzione di Levamisolo 5 mM (in tampone M9) sul tampone di agarosio impostato e trasferire 5 vermi adulti del Giorno 1 nella goccia di Levamisolo. Lasciare paralizzare i nematodi per 5 minuti.
   3. Una volta che C. elegans è paralizzato, allineare con cura con un plettro di filo di platino e rimuovere levamisolo in eccesso con una salvietta da laboratorio prima di aggiungere un vetrino coprioggetti.
   4. Passaggio critico: Assicurarsi di scattare immagini dei vermi entro 30 minuti dalla preparazione dei vetrini del microscopio. I nematodi paralizzati sul vetrino del microscopio possono seccarsi e scoppiare, compromettendo le misurazioni della fluorescenza.
4. Impostazioni del microscopio e analisi delle immagini
   NOTA: Le immagini sono ottenute utilizzando un microscopio confocale dotato di una telecamera EM-CCD e di un software di automazione delle immagini e analisi delle immagini al microscopio.
   1. Scatta immagini con ingrandimenti 10x utilizzando un laser da 561 nm per l'eccitazione a fluorescenza RFP. Assicurati che tutte le immagini vengano scattate utilizzando le stesse impostazioni per la potenza del laser, le dimensioni del foro stenopeico e il guadagno di fluorescenza per consentire i confronti.
   2. Salva tutte le immagini come file TIFF.
   3. Eseguire l'analisi delle immagini utilizzando ImageJ. Misura l'intensità della fluorescenza in ogni immagine in pixel per unità di area, sottraendo la fluorescenza di fondo. Normalizza l'intensità della fluorescenza per ogni immagine nell'area dell'immagine e la lunghezza dei vermi.
   4. Misurare l'intensità media utilizzando Analizza | Misura in ImageJ. Normalizza il valore di intensità risultante nell'area dell'immagine dividendo l'intensità per area.
   5. Per normalizzare l'intensità in base alla lunghezza del sistema a vite senza fine, misurare il tipo di vite senza fine tracciando una linea lungo la lunghezza del sistema a vite senza fine in ImageJ e utilizzando Analizza | Misurare. La ragione per normalizzare l'intensità della fluorescenza alla lunghezza del verme è che i vermi possono variare di dimensioni, a seconda del gene che viene abbattuto dall'RNAi, e questo potrebbe influenzare l'intensità media.
   6. Normalizzare le intensità di fluorescenza misurate per i controlli non trattati (ad esempio, C. elegans cresciuti su piastre RNAi di controllo (EV)). Raggruppare i valori normalizzati per confrontare le intensità medie di fluorescenza per ciascuna condizione di RNAi. Cerca di visualizzare 20 vermi per replica biologica e raccogliere almeno 3 immagini di repliche biologiche.
   7. Calcolare i valori P dei valori medi di intensità della fluorescenza utilizzando il test t di Student ed eseguire una correzione per test multipli utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg, utilizzando un tasso di false scoperte di 0,05.

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Risultati

RNAi tessuto-specifico in due modi: espressione di costrutti a forcina o complementazione tessuto-specifica di SID-1
L'espressione di costrutti di RNAi a forcina tessuto-specifici consente il knockdown costitutivo di un gene durante lo sviluppo. Tuttavia, questo a volte può essere poco pratico quando il gene esaminato è necessario per l'organogenesi di quel particolare tessuto, come l'elt-2 che è necessario per lo sviluppo dell'intestino^2...

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Discussione

I metodi qui descritti dimostrano l'uso di strumenti che consentono il knockdown tessuto-specifico dei componenti del PN in modo costitutivo e temporale. Abbiamo precedentemente identificato il TCS, un meccanismo di risposta allo stress non autonomo delle cellule indotto dall'alterazione tessuto-specifica dei livelli di espressione di Hsp90¹⁰. Il knockdown tessuto-specifico di hsp-90 attraverso l'espressione dell'RNAi a forcina porta a una sovraregolazion...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Merck	A0166-5G	Protocol Section 3.1.
DNA Clean & Concentrator-500	Zymo Research	D4031	Protocol Section 2.2.
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Merck	367-93-1	Protocol Section 3.1.
Multisite Gateway Cloning Kit	Thermo Fisher	12537100	Protocol Section 1.2.
SigmaCote	Merck	SL2-25mL	Protocol Section 2.3.
Tetracycline	Merck	T7660-5G	Protocol Section 3.1.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K280002	Protocol Section 1.1.