Sistemik Stres Sinyali için Bileşenleri Tanımlamak için Dokuya Özgü RNAi Araçları

Özet

Organizma proteostazının sürdürülmesi, bir dokudan diğerine şaperon ekspresyonu gibi protein kalite kontrol yanıtlarının koordinasyonunu gerektirir. Burada, C . elegans'ta kullanılan ve belirli dokularda proteostaz kapasitesinin izlenmesine ve hücreler arası sinyalleşme yanıtlarının belirlenmesine izin veren araçlar sunuyoruz.

Özet

Son on yılda, protein kalite kontrol süreçlerinin düzenlenmesini çevreleyen bilgilerde dönüştürücü bir artış oldu ve hücre otonom olmayan proteostazın düzenlenmesinde hücreler arası sinyalleme süreçlerinin önemini ortaya çıkardı. Son çalışmalar, bir dokudan diğerine protein kalite kontrolünü koordine eden sinyal bileşenlerini ve yollarını ortaya çıkarmaya başlıyor. Bu nedenle, hücre-otonom olmayan proteostaz ağının (PN) mekanizmalarını ve bileşenlerini ve bunun yaşlanma, stres tepkileri ve protein yanlış katlanma hastalıkları ile ilgisini belirlemek önemlidir. Laboratuvarda, bunu incelemek için stres raportörleri ve dokuya özgü proteostaz sensörleri ile birlikte dokuya özgü RNAi ile genetik yıkım kullanıyoruz. Bir stres durumunu algılayan dokularda ve koruyucu bir yanıtı aktive etmek için yanıt veren hücrelerde hareket edebilen hücre otonom olmayan PN'nin bileşenlerini incelemek ve tanımlamak için metodolojileri açıklıyoruz. İlk olarak, belirli dokularda yapısal genetik yıkım için saç tokası RNAi yapılarının nasıl oluşturulacağını ve farklı yaşam evrelerinde RNAi'yi besleyerek dokuya özgü genetik yıkımın nasıl gerçekleştirileceğini açıklıyoruz. Stres raporlayıcıları ve davranışsal tahliller, sistemik stres sinyalleme süreçlerini değiştiren genlerin ve koşulların hızlı bir şekilde taranmasını sağlayan değerli okumalar olarak işlev görür. Son olarak, farklı dokularda eksprese edilen proteostaz sensörleri, gelişim ve yaşlanmanın farklı aşamalarında PN'nin dokuya özgü kapasitesindeki değişiklikleri belirlemek için kullanılır. Bu nedenle, bu araçlar, bir organizmada hücre otonom olmayan PN'ye aracılık etmek için farklı dokularda işlev gören bileşenlerin tanımlanmasına yardımcı olurken, belirli dokularda PN'nin kapasitesinin netleştirilmesine ve izlenmesine izin vermelidir.

Giriş

Hücresel proteostaz, moleküler şaperonlar, stres tepkileri ve ubikitin proteazom sistemi (UPS) ve otofaji ^1,2 dahil olmak üzere bozunma mekanizmaları gibi karmaşık bir protein kalite kontrol bileşenleri ağı tarafından izlenir. HSF-1 aracılı ısı şoku tepkisi (HSR), endoplazmik retikulumun katlanmamış protein tepkisi (^{UPR ER)} ve mitokondri (UPR^mito) gibi stres tepki yollarının aktivasyonu, toksik protein agregasyonuna yol açan çevresel zorluklara veya protein yanlış katlanma hastalığına hücresel adaptasyon ve hayatta kalma için hayati önem taşır ^{1,2,3,4,5, 6}.

Hücresel proteostaz, moleküler şaperonlar⁷ gibi koruyucu protein kalite kontrol bileşenlerini aktive etmek için farklı dokular boyunca hücresel stres tepkilerinin orkestrasyonunu gerektiren C. elegans gibi çok hücreli organizmalarda ek bir katman tarafından koordine edilir. Son on yılda, ısı şoku tepkisi (HSR), UPR^ER ve UPR^mito'nun yanı sıra hücre içi şaperon sinyalizasyonu (TCS) için "hücresel" stres yanıt yollarının hücre otonom olmayan aktivasyonu gözlenmiştir3,4,7,8,9,10. Her durumda, sinir sistemi ve bağırsaktan gelen sinyaller, akut ve kronik protein yanlış katlanma streslerinin toksik sonuçlarına karşı korunmak için şaperonların dokular arasında aktivasyonunu kontrol etmede çok önemli bir rol oynar 3,5,9,11. Nöronlardan bağırsağa ve periferdeki diğer hücrelere bu iletim, UPR,^ER ve HSR ^6,8,11'de olduğu gibi nörotransmiterler tarafından sağlanabilir. Hücre otonom olmayan stres sinyallemesinin bir formunda, nöronlarda HSP-90'ın artan ekspresyonu ile aktive edilen TCS, salgılanan immün peptitler, nöronlardan kaslara hsp-90 şaperon ekspresyonunun aktivasyonunda rol oynar⁵. TCS'nin başka bir formunda, bağırsaktaki ana moleküler şaperon hsp-90'ın ekspresyonunun azaltılması, vücut duvarı kasında izin verilen sıcaklıkta ısıya bağlı hsp-70 ekspresyonunun artmasına yol açar ^5,10. Bununla birlikte, bu özel durumda, stres algılayan bağırsakta aktive olan spesifik sinyal molekülleri ve yanıt veren kas hücreleri bilinmemektedir.

Bu nedenle, şaperon ekspresyonunun bir dokudan diğerine nasıl aktive edildiğini belirlemek için, proteostaz ağının (PN) kapasitesinin ve dokuya özgü düzeyde stres yanıtı aktivasyonunun izlenmesine izin veren bir yaklaşım gereklidir. Tek tek dokularda hangi stres yanıt yolunun aktive edildiğini araştırmak için, floresan protein etiketlerine kaynaşmış mevcut bir transkripsiyonel şaperon raportörü seçimi kullanılabilir (ayrıca bakınız Tablo 3). Bunlar, HSR'nin indüksiyonunu gösteren floresan etiketli hsp-90, hsp-70 ve hsp-16.2 transkripsiyonel raportörleri,^{UPR ER'nin} aktivasyonunu gösteren hsp-4 ve UPR^mito'yu gösteren hsp-6'yı içerir. Bu raportörlerin dokuya özgü bir stres durumu ile kombinasyonu, daha sonra, stresi algılayan distal bir "gönderen" dokuda PN dengesizliğine yanıt veren tek tek dokuları tam olarak belirleyecek güçlü bir okumaya izin verir. Belirli bir dokuda bir stres durumunu veya PN dengesizliğini indüklemek için farklı yaklaşımlar uygulanabilir. Örneğin, böyle bir yaklaşım, bir stres transkripsiyon faktörünün (örneğin, xbp-1'ler) aktive edilmiş formunun ektopik ekspresyonudur ve bir diğeri, dokuya özgü promotörler ^8,10 kullanılarak temel bir moleküler şaperonun (örneğin, hsp-90) eksprese etme seviyelerinin azaltılmasıdır. PN bileşenlerini yalnızca bir hücre tipinde tüketmek için, RNAi ile dokuya özgü yıkım yararlı bir araçtır.

Bununla birlikte, C. elegans'ta, RNAi sistemiktir; Ortamdaki çift sarmallı RNA, hedeflenen bir geni susturmak için hayvana girebilir ve yayılabilir^12,13. Yutulan dsRNA'nın bu sistemik yayılımasına, dsRNA taşıyıcıları olan SID-1 ve SID-2 proteinleri gibi SID (sistemik RNAi kusurlu) proteinlerinin yanı sıra geç endozom proteinleri ile kolokalize olan ve yutulan dsRNA'nın dışa aktarılmasında rol oynayan SID-5 aracılık eder ^14,15,16. SID-1, nöronlar hariç tüm hücrelerde çok geçişli bir transmembran proteindir ve dsRNA dışa aktarmanın yanı sıra^{hücre 17'ye} içe aktarma için gereklidir. SID-2 ekspresyonu, bağırsak lümeninden bağırsak hücrelerinin sitoplazmasına alınan dsRNA için endositik bir reseptör olarak işlev gördüğü bağırsakla^{sınırlıdır 16}. Nöronlar, sistemik RNAi'ye yanıt vermez ve bu, dsRNA'nın içe aktarılması için gerekli olan nöronlardaki transmembran protein SID-1'in ekspresyonunun azalması ile ilişkilidir ^15,18. Bu nedenle, dokuya özgü RNAi'nin sadece bir hücre tipinde etkili olabilmesi için, dsRNA'nın sistemik yayılımının önlenmesi gerekir. Bu, dsRNA'nın dokular¹⁵ boyunca salınmasını ve alınmasını önleyen RNAi'ye dirençli sid-1 (pk3321) mutantı kullanılarak başarılabilir. Bu mutantta dokuya özgü bir saç tokası RNAi yapısının ekspresyonu veya spesifik bir dokuda SID-1'in ektopik ekspresyonu daha sonra mutant sid-1'in işlevini tamamlayabilir ve dokuya özgü RNAi^19'a izin verir.

Peki, dsRNA, bir sid-1 fonksiyon kaybı mutantında bağırsak tarafından nasıl alınır ve daha sonra ektopik olarak bir SID-1 yapısını ifade eden nöronlara veya kas hücrelerine nasıl ulaşabilir? Bu mekanizmayı açıklayan mevcut bir modelde, endositoza uğramış dsRNA, SID-2 yoluyla bağırsak sitoplazmasına alınır ve daha sonra SID-5 ve transsitoz^17'yi içeren başka bir SID-1 bağımsız mekanizması ile psödosölom içine aktarılır. Bu nedenle, dsRNA ithalatı¹⁷ için SID-1 gerekli olduğundan, yalnızca vahşi tip SID-1'i eksprese eden hücreler, bağırsaktan salınan dsRNA'yı psödokoelom'a alabilecektir.

Burada, dokuya özgü RNAi'ye izin veren bir dizi aracın kullanımını gösteriyoruz. Belirli bir dokuda gen ekspresyonunu yapısal olarak yıkmak için yararlı olabilecek firkete RNAi'nin yapısını tanımlamak için moleküler şaperon Hsp90 örneğini kullanıyoruz¹⁰. Açıklanan yaklaşım, ilgilenilen herhangi bir hedef gen için kullanılabilir. Dokuya özgü hsp-90 RNAi'nin neden olduğu proteostaz dengesizliğine diğer dokuların tepkisi, diğer dokulardaki floresan etiketli stres raportörlerinin ekspresyonunun izlenmesiyle araştırılabilir. Dokuya özgü RNAi için ikinci bir yöntem olarak, sid-1 mutant sisteminin, bir firkete RNAi yapısının ekspresyonu yerine RNAi eksprese eden bakterileri beslemek için nasıl uyarlanabileceğini gösteriyoruz. Bu, dokuya özgü bir yanıt için gerekli bileşenleri tanımlamak için bir aday veya genom çapında RNAi taraması gerçekleştirirken yararlı olabilir. Benzer şekilde, hayati bir PN bileşeninin tükenmesiyle ilişkili gelişimsel kusurlar, gelişimin sonraki aşamalarında belirli dokularda RNAi aracılı yıkım gerektirecektir. Bir SID-1 tamamlama sisteminin, dokuya özgü TCS değiştiricileri için aday bir RNAi ekranında nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Örnekte, "stres algılayan" gönderici dokuda (bağırsak) ve stresi etkileyen dokuda (kas) yere yığıldığında, kas hücrelerinde floresan etiketli bir hsp-70 raportörünün değişen ekspresyonuna yol açan sinyal bileşenlerini tanımlamayı amaçlıyoruz.

Protokol

1. Dokuya özgü RNAi iki şekilde: Saç tokası RNAi ve dokuya özgü SID-1 tamamlayıcısı

1. Sid-1 mutantlarında dokuya özgü ekspresyon için firkete RNAi yapılarının üretilmesi
   1. Hedef gen dizisini (ör., Ahringer RNAi kütüphanesi^20'den hsp-90 RNAi klonundan izole edilen hsp-90 dizisi) PCR ile amplifiye edin. Hsp-90 dizisinin 3' ucuna, yani bir SfiI bölgesi (ATCTA)^21'e palindromik olmayan bir dizi yerleştirin.
      NOT: hsp-90'ı SfiI dizisi (altı çizili) ile klonlamak için kullanılan primerler şunlardır:
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
   2. Amplifiye edilmiş diziyi ticari klonlama kiti vektörüne (örneğin, TOPO pCR BluntII) alt klonlayın.
   3. Ters çevrilmiş hsp-90 dizisini hsp-90 RNAi klonundan (Ahringer RNAi kütüphanesi)²⁰ XbaI ve PstI kısıtlama bölgelerini kullanarak kısıtlama sindirimi ile izole edin ve vektördeki hsp-90-SfiI dizisinin aşağı akışına yerleştirin (adım 1.1.1'den itibaren), bir hsp-90 firkete yapısı ile sonuçlanır (Şekil 1).
   4. Saç tokası yapısını bir Ağ Geçidi giriş vektörü pDONR221'e alt klonlayın ve nöronlardaki her iki ekspresyon için dokuya özgü promotörler içeren Ağ Geçidi giriş klonları ile birleştirin (rgef-1p); bağırsakta (VHA-6P); veya tedarikçinin protokolünde açıklandığı gibi bir Ağ Geçidi reaksiyonunda vücut duvarı kası (unc-54p) ve unc-54 3'UTR (veya tercih edilen başka bir 3'UTR).
   5. Elde edilen firkete RNAi yapılarını (Şekil 1) kodlama dizisinin dışında benzersiz bir kısıtlama bölgesi kullanarak doğrusallaştırın ve 100 ng/μL N2 Bristol genomik DNA (ScaI ile sindirilmiş) ile karıştırılmış 1 ng/μL firkete RNAi yapısı konsantrasyonunda karmaşık bir dizi olarak mikroenjekte edin, hsp-70p::RFP raportörünü (suş AM722) eksprese eden bir C. elegans suşuna karıştırın ve sid-1'in (pk3321) genetik arka planına çaprazlayın mutantlar (suşu NL3321). Karmaşık dizilerin mikroenjeksiyonunun nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin bir protokol için lütfen^22'yi takip edin.
   6. Negatif bir kontrol olarak, dokuya özgü bir promotörün kontrolü altında palindromik olmayan SfiI içeren diziyi (GGCCATCTAGGCC) ifade eden boş vektör firkete yapılarını kullanın.
   7. Hsp-90 firkete RNAi'sini ifade eden pozitif transformantları puanlamak için raportörün artan hsp-70p::RFP ifadesini bir okuma olarak kullanın (Şekil 3). İlgilenilen herhangi bir genin dokuya özgü yıkımını doğrulamak için daha genel bir yaklaşım için, ilgilenilen genin qRT-PCR'sini kullanarak tüm hayvan mRNA seviyelerini ölçün.
   8. Gama ışınlaması ile bağırsağa özgü hsp-90 saç tokası yapısını (PVH2; bakınız Tablo 1) ifade eden elde edilen suşun ekstrakromozomal dizisini entegre edin. Ekstrakromozomal dizilerin genoma entegrasyonu için lütfen^22'ye bakınız.
2. dsRNA eksprese eden bakterileri besleyerek dokuya özgü RNAi'ye izin vermek için dokuya özgü SID-1 ekspresyonu
   1. Sid-1 genomik DNA'sını TU867 (unc-119p::SID-1)¹⁹ vektöründen Ağ Geçidi giriş vektörü pDONR221'e alt klonlayın. Sid-1 DNA'nın klonlanması için primerler^19'da bulunabilir. Sid-1 pDONR221 yapısını, daha önce 1.1.4'te açıklandığı gibi Ağ Geçidi reaksiyonunda kas (myo-3p) veya bağırsak- (vha-6p) spesifik promotörler ve unc-54 3'UTR (veya tercih edilen başka bir 3'UTR) içeren Ağ Geçidi giriş klonları ile birleştirin.
   2. Elde edilen vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR veya myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR yapılarını 30 ng/μL konsantrasyonda kırmızı floresan faringeal ko-enjeksiyon markörü ile birlikte mikroenjekte edin (ör., myo-2p::RFP; 5 ng/μL) sid-1(pk3321) mutantlarına.
   3. Ekstrakromozomal bağırsak veya kasa özgü sid-1 dizilerini^22'de tarif edildiği gibi genoma entegre edin. Burada, bu PVH5 suşları ile sonuçlandı [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) ve PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; SID-1(PK3321).
   4. Sid-1(pk3321) mutantında sid-1'in nörona özgü ekspresyonu için, TU3401 uIs3401 [unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP] suşunu kullanın; Daha önce Calixto ve ^ark.19 tarafından oluşturulan sid-1(pk3321).
   5. 1.1.7'de belirtildiği gibi, istenen hedef genin mRNA seviyelerini qRT-PCR ile ölçerek ilgilenilen genin dokuya özgü dekosesini sağlayın. Alternatif olarak, aynı dokuda eksprese edilen bir floresan proteini (örneğin, GFP veya RFP) kullanarak dokuya özgü RNAi duyarlılığını doğrulayın ve solucanları GFP veya RFP RNAi ile tedavi edin. Nematodları senkronize L1 evre larvaları olarak GFP / RFP RNAi'ye maruz bırakın ve yetişkinliğin 1. gününe kadar RNAi bakterileri üzerinde büyürler (bkz. Şekil 2). Olgumuzda, nöronlarda, kasta veya bağırsakta SID-1 eksprese eden suşlar kullandık ve nöronlarda (AM987), bağırsakta (AM986) ve kasta (AM988) HSP-90::RFP eksprese eden suşlara geçtik.

2. Hücre otonom ve hücre otonom olmayan proteostazı izlemek için stres muhabirleri ve proteostaz sensörlerinin kullanılması

NOT: Belirli dokularda PN kapasitesini izlemek için, dokuya özgü proteostaz sensörleri (bağırsakta Q44 veya kasta Q35 eksprese eden suşlar gibi - bkz. Tablo 3) ve stres raporlayıcıları (ısı ile indüklenebilen hsp-70p::mCherry raportörü gibi; Tablo 3).

1. Genetik olarak sid-1 (pk3321) mutant alelini bir proteostaz sensör suşuna geçmek ve RNAi'yi besleyerek sid-1(pk3321) varlığını doğrulamak
   1. Proteostaz sensörü/stres raportörü suşunu, sid-1 (pk3321) mutant suşunun genetik arka planına genetik olarak çaprazlayın. Farklı transgenik suşlar arasında genetik çaprazlamalar oluşturmak için lütfen ayrıntılı bir protokol için^23'ü takip edin.
      NOT: sid-1 (pk3321) mutantları, RNAi'yi beslemeye dirençlidir ve bu nedenle embriyoların RNAi ile temel bir gene (elt-2 veya hsp-90 gibi) karşı tedavisi, yalnızca sid-1 geni için heterozigot veya vahşi tip suşlarda gelişimsel arrestlere veya larva ölümcüllüğüne yol açacaktır.
   2. 10 gravid hermafroditin elt-2 veya hsp-90'a karşı RNAi plakalarına yumurta bırakmasına izin verin ve kontrol edin (boş vektör; EV) 20 °C'de RNAi plakaları. Anneleri 1-2 saat sonra çıkarın. Kontrol olarak N2 Bristol ve sid-1 (pk3321) mutantını kullanın.
   3. Önümüzdeki 2-3 gün boyunca RNAi plakalarındaki larvaların gelişimini gözlemleyin. ELT-2 RNAi, L1 larva durması ile sonuçlanırken, hsp-90 RNAi, N2 Bristol'de L3 larva durması ile sonuçlanır. sid-1 mutantları, RNAi tedavisinden etkilenmeyecek ve gravid yetişkinlere dönüşecektir.
      NOT: Sid-1 (pk3321) için C. elegans homozigot, yetişkinliğe doğru gelişen tek tip bir popülasyon gösterecektir. Heterozigotlar, larva durması gösteren bazı hayvanların karışık popülasyonları ve yetişkinlere dönüşen bazı hayvanlar ile gösterilecektir.
2. Genotipleme ile sid-1(pk3321) varlığının doğrulanması
   1. Seçilen aday F2 suşundan 15-20 solucanı 15 μL Solucan Lizis Tamponu içeren bir PCR tüpüne seçin (Tablo 2).
   2. Tüpü en az 10 dakika veya gece boyunca -80 °C'de yerleştirin.
   3. Aşağıdaki programı kullanarak tüpü PCR makinesinde inkübe edin:
   4. 60 dakika boyunca 65 °C (lyse solucanı); 15 dakika boyunca 95 ° C (Proteinaz K'yi inaktive edin); 4 °C'de tutun.
   5. Sid-1 için aşağıdaki primerleri kullanarak, genotipleme için PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek için bir "şablon" olarak 2 μL solucan lizatı kullanın: sid-1 forw: 5'-agctctgtacttgtattcg-3' ve sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
   6. PCR genotiplemesi için aşağıdaki programı kullanın: 3 dakika boyunca 95 ° C'de 1 döngü; daha sonra 10 saniye boyunca 95 ° C'lik 30 döngü, 30 saniye boyunca 55 ° C ve 30 saniye boyunca 72 ° C; 72 °C'de 10 dakika boyunca 1 döngü, 4 °C'de tutun.
   7. Bir PCR saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak ~650 bp PCR ürününü saflaştırın ve sid-1 (pk1) alelinin G-to-A noktası mutasyonunu tanımlamak için sid-3321 PCR ürününü sıralayın. Alternatif olarak, G-to-A noktası mutasyonu,^24'te tarif edildiği gibi genotipleme için PCR ürününde kullanılabilen bir ApoI kısıtlama bölgesi oluşturur.
3. iQ44::YFP'yi bağırsak için proteostaz sensörü olarak kullanma
   1. Bağırsakta Q44::YFP eksprese eden C. elegans'ı senkronize edin (OG412 suşu) veya ağartma yoluyla sid-1 (pk3321) mutant arka plana çaprazlayın,^25'te açıklanan protokolü izleyerek. Plaka, L1 larvalarını OP50 bakteri içeren 9 cm'lik bir nematod büyüme ortamı (NGM)-agar plakasına senkronize eder ve 20 ° C'de L4 aşamasına kadar büyür.
   2. 5 mL M9 tamponu kullanarak solucanları plakadan yıkayarak L4 hayvanlarını toplayın. L4 solucanları içeren M9 tamponunu bir cam pipet veya silikonlu plastik pipet kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve solucanları nazikçe peletlemek için oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın, solucan peletini rahatsız edilmeden bıraktığınızdan emin olun.
   3. Kritik Adım: Nematodları aktarmak veya plakalamak için, üreticinin talimatına uygun olarak bir silikonlaştırıcı madde (örn. SigmaCote) ile muamele edilmiş bir cam pipet veya plastik pipet ucu kullanın. Bu, solucanların pipet ucunun plastik yüzeyine yapışmasını önler.
   4. Solucanlardaki tüm OP50 bakterilerini temizlemek için adım 2.3.2'yi üç kez daha tekrarlayın.
   5. Solucan peletini 5 mL M9 tamponunda alın ve 10 μL'de bulunan solucan sayısını sayın.
   6. Plaka başına 10 solucan yoğunluğunda boş vektör kontrol (EV) veya hsp-90 RNAi bakterisi içeren 6 cm NGM Agar plakaları üzerinde L4 hayvanları plaka (zaman noktası başına 5 plaka hazırlayın ve biyolojik olarak çoğaltın) ve 20 °C'de 24-48 saat inkübe edin.
   7. 24 saat sonra (=1. gün yetişkin) ve 48 saat (=2. gün yetişkin) agregat sergileyen nematodların bağırsaklarındaki Q44 odaklarının sayısını sayın. Biyolojik kopya başına toplam 30-50 nematod puanlayın.

3. Hücre otonom olmayan proteostazın değiştiricileri için dokuya özgü aday RNAi ekranı

NOT: Dokuya özgü RNAi taraması için, RNAi bakterilerini besleyerek bağırsağa özgü RNAi'ye izin veren PVH172 suşunu ve kasa özgü RNAi'ye izin veren PVH171 suşunu kullandık (genotip için Tablo 1'e bakınız).

1. Aday RNAi plakalarının hazırlanması
   1. 100 μg/mL ampisilin, 12.5 μg/mL tetrasiklin ve 1 mM IPTG ile desteklenmiş 6 cm NGM agar plakalarını standart yöntemlere^{göre hazırlayın 25}.
   2. RNAi ekranı²⁰ için aday RNAi klonlarını elde etmek için Ahringer RNAi kitaplığını kullanın.
   3. 3 mL LB-amp ortamını (LB ortamında 50 μg/mL ampisilin) 15 mL'lik tüpe plastik bir pipet ucu kullanarak istenen RNAi klonu ile aşılayın. Çalkalama ile gece boyunca 37 ° C'de büyütün.
   4. Ertesi gün, bakteri gece kültüründe 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar İzopropil-BD-tiyogalaktopiranosid (IPTG) (1 M'lik bir stoktan) ekleyin.
   5. Kültürleri 37 ° C'de 3 saat daha çalkalayın.
   6. 300 μL bakteriyel RNAi kültürünü, 100 μg/mL ampisilin, 12.5 μg/mL tetrasiklin ve 1 mM IPTG ile desteklenmiş 6 cm'lik bir NGM agar plakasına yerleştirin. Plakaları oda sıcaklığında 2 gün tezgah üzerinde kurumaya bırakın, ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın. Kuruduktan sonra, RNAi plakaları birkaç hafta boyunca 4 °C'de bir kutuda saklanabilir.
2. C. elegans'ın senkronizasyonu ve RNAi bakterileri ile tedavisi
   1. Solucan suşlarını senkronize etmek için, RNAi plakalarına 15 gravid yetişkin seçin ve 1 saat boyunca yumurta bırakmaya bırakın. Sonra yetişkinleri plakadan çıkarın.
   2. Kritik adım: Bu durumda ağartma ile senkronizasyondan kaçınılır, çünkü C. elegans için stresli bir durum olduğu için hsp-70p::RFP raportörünü indükleyebilir.
   3. Senkronize L4 aşama larvalarını seçin ve taze bir RNAi plakasına aktarın.
   4. dsRNA'nın verimli bir şekilde alınmasını sağlamak için nematodların iki nesil boyunca ilgili RNAi üzerinde büyümesine izin verin ve sıcaklığın 20 °C'de tutulduğundan emin olun.
   5. Görüntüleme ve hsp-70p::RFP floresan ölçümü için 1. gün yetişkinlerini kullanın.
3. Mikroskop lamlarının hazırlanması
   1. ~250 μL% 2 agaroz çözeltisi (M9 tamponunda) bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirerek ve düz bir disk oluşturmak için üstüne ikinci bir slayt yerleştirerek mikroskop slaytlarını hazırlayın.
   2. 5 μL 5 mM Levamisol solüsyonunu (M9 tamponunda) ayarlanan agaroz pedine yerleştirin ve 5 Gün 1 yetişkin solucanı Levamisol damlasına aktarın. Nematodları 5 dakika felç olmaya bırakın.
   3. C. elegans felç olduktan sonra, bir platin tel çekme ile dikkatlice hizalayın ve bir lamel eklemeden önce fazla levamisolü bir laboratuvar mendili ile çıkarın.
   4. Kritik adım: Mikroskop slaytlarının hazırlanmasından sonraki 30 dakika içinde solucanların görüntülerini aldığınızdan emin olun. Mikroskop lamı üzerindeki felçli nematodlar kuruyabilir ve patlayabilir, bu da floresan ölçümlerini tehlikeye atabilir.
4. Mikroskop ayarları ve görüntü analizi
   NOT: Görüntüler, bir EM-CCD kamera ve bir mikroskopi görüntü otomasyonu ve görüntü analiz yazılımı ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edilir.
   1. RFP floresan uyarımı için 561 nm lazer kullanarak 10x büyütme ile görüntü çekin. Karşılaştırmaları mümkün kılmak için tüm görüntülerin lazer gücü, iğne deliği boyutu ve floresan kazancı için aynı ayarlar kullanılarak çekildiğinden emin olun.
   2. Tüm görüntüleri TIFF dosyaları olarak kaydedin.
   3. ImageJ kullanarak görüntü analizi gerçekleştirin. Her görüntüdeki floresan yoğunluğunu, arka plan floresansı çıkarılarak birim alan başına piksel olarak ölçün. Her görüntü için floresan yoğunluğunu görüntü alanına ve solucanların uzunluğuna göre normalleştirin.
   4. Analiz Et'i kullanarak ortalama yoğunluğu ölçme | ImageJ'de ölçün . Elde edilen yoğunluk değerini, yoğunluğu alana bölerek görüntü alanına normalleştirin.
   5. Yoğunluğu solucan uzunluğuna göre normalleştirmek için, ImageJ'de solucanın uzunluğu boyunca bir çizgi çizerek ve Analiz | Ölçün. Floresan yoğunluğunu solucan uzunluğuna normalleştirmenin nedeni, solucanların RNAi tarafından parçalanan gene bağlı olarak boyutlarının değişebilmesi ve bunun ortalama yoğunluğu etkileyebilmesidir.
   6. Ölçülen floresan yoğunluklarını tedavi edilmemiş kontrollere (yani, transgenik C. kontrol (EV) RNAi plakalarında yetiştirilen elegans). Her RNAi koşulu için ortalama floresan yoğunluklarını karşılaştırmak için normalleştirilmiş değerleri bir araya getirin. Biyolojik replikasyon başına 20 solucan görüntülemeyi ve en az 3 biyolojik replika görüntü toplamayı hedefleyin.
   7. Öğrencinin t testini kullanarak ortalama floresan yoğunluğu değerlerinin P değerlerini hesaplayın ve 0,05'lik bir yanlış keşif oranı kullanarak Benjamini-Hochberg yöntemini kullanarak çoklu test için bir düzeltme yapın.

Sonuçlar

Dokuya özgü RNAi iki şekilde: Saç tokası yapılarının ekspresyonu veya dokuya özgü SID-1 tamamlayıcısı
Dokuya özgü firkete RNAi yapılarının ekspresyonu, gelişim boyunca bir genin yapısal olarak yıkılmasına izin verir. Bununla birlikte, incelenen gen, bağırsağın gelişimi için gerekli olan elt-2 gibi belirli bir dokunun organogenezi için gerekli olduğunda, bu bazen pratik olmayabilir²⁶. RNAi'ye dirençli sid...

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntemler, PN bileşenlerinin yapısal ve zamansal bir şekilde dokuya özgü nakavtına izin veren araçların kullanımını göstermektedir. Daha önce, Hsp90 ekspresyon seviyeleri^10'un dokuya özgü değişikliği ile indüklenen hücre otonom olmayan bir stres yanıt mekanizması olan TCS'yi tanımlamıştık. Saç tokası RNAi'nin ekspresyonu ile hsp-90'ın dokuya özgü yıkımı, distal dokularda koruyucu hsp-70 şaper...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Merck	A0166-5G	Protocol Section 3.1.
DNA Clean & Concentrator-500	Zymo Research	D4031	Protocol Section 2.2.
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Merck	367-93-1	Protocol Section 3.1.
Multisite Gateway Cloning Kit	Thermo Fisher	12537100	Protocol Section 1.2.
SigmaCote	Merck	SL2-25mL	Protocol Section 2.3.
Tetracycline	Merck	T7660-5G	Protocol Section 3.1.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K280002	Protocol Section 1.1.