JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תחזוקה של פרוטאוסטזיס אורגניזמי דורשת תיאום של תגובות בקרת איכות חלבון כגון ביטוי מלווה מרקמה אחת לאחרת. כאן, אנו מספקים כלים המשמשים ב-C. elegans המאפשרים ניטור של יכולת פרוטאוסטזיס ברקמות ספציפיות וקובעים תגובות איתות בין-תאיות.

Abstract

במהלך העשור האחרון חלה עלייה טרנספורמטיבית בידע סביב רגולציה של תהליכי בקרת איכות חלבונים, וחשפה את החשיבות של תהליכי איתות בין-תאיים בוויסות פרוטאוסטזיס לא אוטונומי בתא. מחקרים אחרונים מתחילים כעת לחשוף רכיבי איתות ומסלולים המתאמים את בקרת איכות החלבון מרקמה אחת לאחרת. לכן חשוב לזהות מנגנונים ומרכיבים של רשת פרוטאוסטזיס תאית לא אוטונומית (PN) ואת הרלוונטיות שלה להזדקנות, תגובות לחץ ומחלות קיפול חלבונים. במעבדה, אנו משתמשים ב-Knockdown גנטי על ידי RNAi ספציפי לרקמה בשילוב עם מדווחי לחץ וחיישני פרוטאוסטזיס ספציפיים לרקמה כדי לחקור זאת. אנו מתארים מתודולוגיות לבחינה וזיהוי מרכיבים של PN לא אוטונומי של התא שיכולים לפעול ברקמות התופסות מצב לחץ ובתאים מגיבים להפעלת תגובת הגנה. ראשית אנו מתארים כיצד ליצור מבני RNAi של סיכות ראש עבור נוקדאון גנטי מכונן ברקמות ספציפיות וכיצד לבצע נוק-דאון גנטי ספציפי לרקמה על ידי הזנת RNAi בשלבי חיים שונים. מדווחי מתח ומבחנים התנהגותיים מתפקדים כקריאות חשובות המאפשרות סינון מהיר של גנים ומצבים המשנים תהליכי איתות מתח מערכתיים. לבסוף, חיישני פרוטאוסטזיס המתבטאים ברקמות שונות משמשים לקביעת שינויים בקיבולת הספציפית לרקמה של ה-PN בשלבי התפתחות והזדקנות שונים. לפיכך, כלים אלה אמורים לסייע בהבהרה ולאפשר ניטור של יכולת ה-PN ברקמות ספציפיות, תוך סיוע בזיהוי רכיבים המתפקדים ברקמות שונות כדי לתווך PN לא אוטונומי של תאים באורגניזם.

Introduction

פרוטאוסטזיס תאי מנוטר על ידי רשת מורכבת של רכיבי בקרת איכות חלבונים כגון מלווים מולקולריים, תגובות לחץ ומנגנוני פירוק כולל מערכת יוביקוויטין פרוטאזום (UPS) ואוטופגיה 1,2. הפעלת מסלולי תגובת לחץ, כגון תגובת הלם חום מתווכת HSF-1 (HSR), תגובת החלבון הפרושה של הרטיקולום האנדופלזמי (UPRER) והמיטוכונדריה (UPRmito) חיונית להסתגלות תאית והישרדות במהלך אתגרים סביבתיים או מחלת קיפול חלבון שגויה המובילה לצבירת חלבונים רעילים 1,2,3,4,5, 6.

פרוטאוסטזיס תאי מתואם על ידי שכבה נוספת באורגניזמים רב-תאיים, כגון C. elegans, הדורשת תזמור של תגובות לחץ תאיות על פני רקמות שונות כדי להפעיל רכיבי בקרת איכות חלבונים מגינים כגון מלווים מולקולריים7. בעשור האחרון נצפתה הפעלה לא אוטונומית של תאים של מסלולי תגובת מתח "תאיים" עבור תגובת הלם חום (HSR), ה-UPRER וה-UPR מיטו, כמו גם איתות מלווה טרנס-תאי (TCS)3,4,7,8,9,10 . בכל מקרה, מערכת העצבים כמו גם איתות מהמעי ממלאים תפקיד מכריע בשליטה על הפעלת המלווים על פני הרקמות, כדי להגן מפני ההשלכות הרעילות של מתחים חריפים וכרוניים של קיפול שגוי של חלבונים 3,5,9,11. העברה זו מהנוירונים למעי ולתאים אחרים בפריפריה יכולה להיות מושגת על ידי נוירוטרנסמיטורים, כפי שקורה עבור UPRER ו- HSR 6,8,11. בצורה אחת של איתות מתח לא אוטונומי בתא, TCS, המופעל על ידי ביטוי מוגבר של HSP-90 בנוירונים, פפטידים חיסוניים המופרשים ממלאים תפקיד בהפעלת ביטוי מלווה hsp-90 מהנוירונים לשריר5. בצורה אחרת של TCS, הפחתת הביטוי של המלווה המולקולרי העיקרי hsp-90 במעי מובילה לביטוי מוגבר של hsp-70 המושרה בחום בטמפרטורה מתירנית בשריר דופן הגוף 5,10. במקרה הספציפי הזה, מולקולות האיתות הספציפיות המופעלות במעי הקולט מתח ותאי השריר המגיבים אינן ידועות.

לפיכך, על מנת לזהות כיצד ביטוי המלווה מופעל מרקמה אחת לאחרת, נדרשת גישה המאפשרת לנטר את הקיבולת של רשת הפרוטאוסטזיס (PN) והפעלת תגובת הלחץ ברמה הספציפית לרקמה. כדי לחקור איזה מסלול תגובת לחץ מופעל ברקמות הבודדות, ניתן להשתמש במבחר זמין של מדווחי מלווה שעתוק המאוחים לתגי חלבון פלואורסצנטיים (ראה גם טבלה 3). אלה כוללים מדווחי שעתוק hsp-90, hsp-70 ו-hsp-16.2 מתויגים פלואורסצנטיים המצביעים על אינדוקציה של HSR, hsp-4 המציין את הפעלת ה-UPRER ו-hsp-6, המציין אתה-UPR mito. השילוב של מדווחים אלה עם מצב לחץ ספציפי לרקמה מאפשר קריאה עוצמתית שתאתר רקמות בודדות המגיבות לחוסר איזון של ה-PN ברקמת "שולח" דיסטלית הקולטת את הלחץ. כדי לגרום למצב לחץ או חוסר איזון של ה-PN ברקמה ספציפית, ניתן לנקוט בגישות שונות. לדוגמה, גישה אחת כזו היא על ידי ביטוי חוץ רחמי של הצורה המופעלת של גורם שעתוק מתח (למשל, xbp-1s) וגישה אחרת היא על ידי הפחתת רמות הביטוי של מלווה מולקולרי חיוני (למשל, hsp-90) באמצעות מקדמים ספציפיים לרקמה 8,10. כדי לרוקן רכיבי PN בסוג תא אחד בלבד, נוקדאון ספציפי לרקמה על ידי RNAi הוא כלי שימושי.

ב-C. elegans, RNAi הוא סיסטמי; RNA דו-גדילי בסביבה יכול להיכנס ולהתפשט ברחבי החיה כדי להשתיק גן ממוקד12,13. התפשטות מערכתית זו של dsRNA שנבלע מתווכת על ידי חלבוני SID (RNAi פגום מערכתי), כגון חלבוני SID-1 ו-SID-2 שהם מובילי dsRNA, כמו גם SID-5, המשתלב עם חלבוני אנדוזום מאוחרים ומעורב בייצוא של dsRNA שנבלע 14,15,16. SID-1 הוא חלבון טרנסממברני מרובה מעברים בכל התאים למעט נוירונים, והוא נדרש לייצוא dsRNA כמו גם לייבוא לתאים17. ביטוי SID-2 מוגבל למעי שם הוא מתפקד כקולטן אנדוציטי ל-dsRNA שנבלע מלומן המעי לציטופלזמה של תאי המעי16. לנוירונים אין תגובה ל-RNAi מערכתי, וזה מתאם עם ביטוי מופחת של החלבון הטרנסממברני SID-1 בנוירונים, החיוני לייבוא dsRNA 15,18. לפיכך, כדי ש-RNAi ספציפי לרקמה יהיה יעיל רק בסוג תא אחד, יש למנוע את ההתפשטות המערכתית של dsRNA. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש במוטציה sid-1 (pk3321) עמידה ל-RNAi המונעת שחרור וספיגה של dsRNA על פני רקמות15. ביטוי של מבנה RNAi של סיכת ראש ספציפית לרקמה במוטציה זו או ביטוי חוץ רחמי של SID-1 ברקמה ספציפית יכול להשלים את התפקוד של SID-1 מוטנטי ויאפשר RNAi19 ספציפי לרקמה.

אז כיצד dsRNA נבלע על ידי המעי במוטציה של אובדן תפקוד sid-1 וכיצד הוא יכול להגיע לתאי עצב או לתאי שריר המבטאים באופן חיצוני מבנה SID-1? במודל נוכחי אחד המסביר מנגנון זה, dsRNA אנדוציטוזי נקלט לציטופלזמה של המעי באמצעות SID-2 ולאחר מכן מיוצא לפסאודו-קואלום על ידי מנגנון עצמאי אחר של SID-1, הכולל SID-5 וטרנסציטוזיס17. לפיכך, מכיוון ש-SID-1 נדרש לייבוא dsRNA17, רק תאים המבטאים SID-1 מסוג בר יוכלו לקלוט את ה-dsRNA המשתחרר מהמעי לפסאודו-קולום.

כאן אנו מדגימים את השימוש בסט כלים המאפשרים RNAi ספציפי לרקמה. אנו משתמשים בדוגמה של המלווה המולקולרי Hsp90 כדי לתאר את הבנייה של RNAi סיכת ראש שיכולה להיות שימושית כדי להפיל באופן קונסטרוקטיבי ביטוי גנים ברקמה ספציפית10. הגישה המתוארת יכולה לשמש עבור כל גן מטרה מעניין. ניתן לחקור את התגובה של רקמות אחרות לחוסר איזון הפרוטאוסטזיס הנגרם על ידי hsp-90 RNAi ספציפי לרקמה על ידי ניטור הביטוי של מדווחי מתח מתויגים פלואורסצנטית ברקמות אחרות. כשיטה שנייה ל-RNAi ספציפי לרקמות, אנו מדגימים כיצד ניתן להתאים את מערכת המוטציה sid-1 להזנת חיידקים המבטאים RNAi במקום ביטוי של מבנה RNAi סיכת ראש. זה יכול להיות שימושי בעת ביצוע מועמד או מסך RNAi בכל הגנום כדי לזהות רכיבים הנדרשים לתגובה ספציפית לרקמה. כמו כן, פגמים התפתחותיים הקשורים לדלדול של רכיב PN חיוני ידרשו נוקדאון בתיווך RNAi ברקמות ספציפיות בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות. אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש במערכת השלמה של SID-1 על מסך RNAi מועמד עבור משני TCS ספציפיים לרקמות. בדוגמה, אנו שואפים לזהות רכיבי איתות שעם הפלה ברקמת השולח "תופסת הלחץ" (המעי) והרקמה המשפיעה על הלחץ (השריר) מובילים לביטוי המשתנה של מדווח hsp-70 מתויג פלואורסצנטי בתאי שריר.

Protocol

1. RNAi ספציפי לרקמות בשתי דרכים: RNAi סיכת ראש והשלמת SID-1 ספציפית לרקמה

  1. יצירת מבני RNAi של סיכת ראש לביטוי ספציפי לרקמה במוטציות sid-1
    1. להגביר את רצף גן המטרה (למשל, רצף hsp-90 שבודד משיבוט hsp-90 RNAi מספריית AhringerRNAi 20) על ידי PCR. מקם רצף לא פלינדרומי בקצה ה-3' של רצף hsp-90 , כלומר אתר SfiI (ATCTA)21.
      הערה: הפריימרים המשמשים לשיבוט ה-hsp-90 עם רצף SfiI (מסומן בקו תחתון) הם:
      כ-hsp90-sfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
    2. שכפל את הרצף המוגבר לווקטור ערכת השיבוט המסחרי (למשל, TOPO pCR BluntII).
    3. בודד את רצף hsp-90 ההפוך משיבוט hsp-90 RNAi (ספריית Ahringer RNAi)20 על ידי עיכול הגבלה באמצעות אתרי הגבלה XbaI ו-PstI ומקם אותו במורד הזרם של רצף hsp-90-SfiI בווקטור (משלב 1.1.1), וכתוצאה מכך מבנה סיכת ראש hsp-90 (איור 1).
    4. לשכפל את מבנה סיכת הראש לווקטור כניסה של Gateway pDONR221 ולמזג אותו עם שיבוטי כניסה של Gateway המכילים מקדמים ספציפיים לרקמה עבור כל ביטוי בתאי עצב (rgef-1p); במעי (vha-6p); או שריר דופן הגוף (unc-54p) ו-unc-54 3'UTR (או כל 3'UTR אחר לבחירה) בתגובת Gateway כמתואר בפרוטוקול של הספק.
    5. ליניאריזציה של מבני ה-RNAi של סיכת הראש המתקבלת (איור 1) באמצעות אתר הגבלה ייחודי מחוץ לרצף הקידוד והזרקת מיקרו כמערך מורכב בריכוז של מבנה RNAi של סיכת ראש של 1 ננוגרם/מיקרוליטר, מעורבב עם 100 ננוגרם/מיקרוליטר N2 DNA גנומי של בריסטול (מעוכל עם ScaI) לזן C. elegans המבטא את מדווח hsp-70p::RFP (זן AM722) וחוצה לרקע הגנטי של sid-1 (pk3321) מוטציות (זן NL3321). לפרוטוקול כיצד לבצע מיקרו-הזרקה של מערכים מורכבים אנא עקוב אחר22.
    6. כבקרה שלילית, השתמש במבנים ריקים של סיכות ראש וקטוריות המבטאות את הרצף המכיל SfiI לא-פלינדרומי (GGCCATCTAGGCC) בשליטה של מקדם ספציפי לרקמה.
    7. השתמש בביטוי המוגבר hsp-70p::RFP של המדווח כקריאה כדי לקלוע טרנספורמטורים חיוביים המבטאים hsp-90 RNAi סיכת ראש (איור 3). לגישה כללית יותר לאימות הפלה ספציפית לרקמה של כל גן מעניין, מדוד את רמות ה-mRNA של בעלי חיים שלמים באמצעות qRT-PCR של הגן המעניין.
    8. לשלב את המערך החוץ-כרומוזומלי של הזן המתקבל המבטא את מבנה סיכת הראש hsp-90 הספציפי למעי (PVH2; ראה טבלה 1) על ידי הקרנת גמא. לשילוב המערכים החוץ-כרומוזומליים בגנום, ראה22.
  2. ביטוי SID-1 ספציפי לרקמה כדי לאפשר RNAi ספציפי לרקמה על ידי הזנת חיידקים המבטאים dsRNA
    1. שכפל את ה-DNA הגנומי של sid-1 מווקטור TU867 (unc-119p::SID-1)19 לתוך וקטור הכניסה של Gateway pDONR221. פריימרים לשיבוט DNA sid-1 ניתן למצואב-19. מזגו את מבנה ה-sid-1 pDONR221 עם שיבוטי כניסת Gateway המכילים מקדמים ספציפיים לשרירים (myo-3p) או מעיים (vha-6p) ו-unc-54 3'UTR (או כל 3'UTR אחר לבחירה) בתגובת השער כמתואר קודם לכן ב-1.1.4.
    2. מיקרו-הזרקה של מבני vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR או myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR מבני בריכוז של 30 ננוגרם/מיקרוליטר יחד עם סמן הזרקה משותפת של הלוע הפלואורסצנטי האדום (למשל, myo-2p::RFP; 5 ננוגרם/מיקרוליטר) לתוך מוטציות SID-1(pk3321).
    3. שלב את מערכי ה-sid-1 החוץ-כרומוזומליים הספציפיים למעי או לשריר בגנום כמתוארב-22. כאן, זה הביא לזנים PVH5 [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]; SID-1(PK3321) ו-PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; סיד-1 (PK3321).
    4. לביטוי ספציפי לנוירונים של sid-1 במוטציה sid-1(pk3321), השתמש בזן TU3401 uIs3401[unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) שנוצר בעבר על ידי Calixto et al.19.
    5. כפי שהוזכר ב-1.1.7, הבטח הפלה ספציפית לרקמה של הגן המעניין על ידי מדידת רמות mRNA של גן המטרה הרצוי על ידי qRT-PCR. לחלופין, יש לאשר רגישות RNAi ספציפית לרקמה על ידי שימוש בחלבון פלואורסצנטי (למשל, GFP או RFP) המתבטא באותה רקמה ולטפל בתולעים באמצעות GFP או RFP RNAi. לחשוף נמטודות ל-GFP/RFP RNAi כזחלים מסונכרנים בשלב L1 ולגדול על חיידקי ה-RNAi עד היום הראשון של הבגרות (ראו איור 2). במקרה שלנו, השתמשנו בזנים המבטאים SID-1 בתאי העצב, בשריר או במעי ועברנו לזנים המבטאים HSP-90::RFP בתאי עצב (AM987), במעי (AM986) ובשריר (AM988).

2. שימוש במדווחי מתח וחיישני פרוטאוסטזיס לניטור פרוטאוסטזיס אוטונומי ותאי לא אוטונומי

הערה: כדי לנטר את קיבולת ה-PN ברקמות ספציפיות, השתמש בחיישני פרוטאוסטזיס ספציפיים לרקמה (כגון זנים המבטאים Q44 במעי או Q35 בשריר - ראה טבלה 3) ומדווחי מתח (כגון מדווח hsp-70p::mCherry המעורר חום; טבלה 3).

  1. חצייה גנטית של האלל המוטנטי sid-1 (pk3321) לזן חיישן פרוטאוסטזיס ואישור נוכחותו של sid-1 (pk3321) על ידי הזנת RNAi
    1. חצו גנטית את הזן של חיישן פרוטאוסטזיס/מדווח מתח לרקע הגנטי של הזן המוטנטי sid-1 (pk3321). כדי לקבוע הכלאות גנטיות בין זנים טרנסגניים שונים, אנא עקוב אחר23 לפרוטוקול מפורט.
      הערה: מוטציות sid-1(pk3321) עמידות להזנת RNAi ומכאן שטיפול בעוברים עם RNAi כנגד גן חיוני (כגון elt-2 או hsp-90) יוביל רק למעצרים התפתחותיים או קטלניות זחלים בזנים הטרוזיגוטיים או פראיים עבור הגן sid-1 .
    2. תן ל-10 הרמפרודיטים גרבידיים להטיל ביצים על לוחות RNAi כנגד elt-2 או hsp-90 ולשלוט (וקטור ריק; EV) לוחות RNAi ב-20 מעלות צלזיוס. הסר את האימהות לאחר 1 - 2 שעות. השתמש בבריסטול N2 ובמוטציה sid-1 (pk3321) כבקרות.
    3. צפו בהתפתחות הזחלים על לוחות ה-RNAi במהלך 2-3 הימים הבאים. ELT-2 RNAi יביא למעצר זחל L1, בעוד ש-hsp-90 RNAi יביא למעצר זחל L3 ב-N2 בריסטול. מוטציות SID-1 לא יושפעו מהטיפול ב-RNAi ויתפתחו למבוגרים גרבידיים.
      הערה: C. elegans homozygote עבור sid-1 (pk3321) יראה אוכלוסייה אחידה המתפתחת לבגרות. הטרוזיגוט יצוין על ידי אוכלוסיות מעורבות של כמה בעלי חיים המראים עצירת זחלים, וחלק מבעלי החיים מתפתחים לבוגרים.
  2. אישור נוכחות של sid-1(pk3321) על ידי גנוטיפ
    1. בחר 15-20 תולעים מזן F2 המועמד שנבחר לתוך צינור PCR המכיל 15 מיקרוליטר של מאגר ליזיס תולעים (טבלה 2).
    2. הנח את הצינור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות או למשך הלילה.
    3. דגרו את הצינור במכונת ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה:
    4. 65 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות (תולעת ליז); 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (לנטרל את פרוטאינאז K); יש להחזיק בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    5. השתמש ב-2 מיקרוליטר של ליזאט התולעת כ"תבנית" לביצוע תגובת ה-PCR לגנוטיפ, תוך שימוש בפריימרים הבאים עבור sid-1: sid-1 forw: 5'-agctctgtacttgtattcg-3' ו-sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
    6. השתמש בתוכנית הבאה לגנוטיפ PCR: מחזור אחד ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; לאחר מכן 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; מחזור אחד ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, החזק ב-4 מעלות צלזיוס.
    7. טהר את מוצר ה-PCR ~650 bp באמצעות ערכת טיהור PCR (טבלת חומרים) ורצף את מוצר ה-PCR sid-1 כדי לזהות את המוטציה הנקודתית G-to-A של האלל sid-1 (pk3321). לחלופין, המוטציה הנקודתית G-to-A יוצרת אתר הגבלת ApoI, שניתן להשתמש בו במוצר ה-PCR לגנוטיפ כמתוארב-24.
  3. שימוש ב-iQ44::YFP כחיישן פרוטאוסטזיס למעי
    1. סנכרן C. elegans המבטא Q44::YFP במעי (זן OG412) או חצה לרקע המוטנטי sid-1 (pk3321) על ידי הלבנה, בהתאם לפרוטוקול המתואר ב-25. צלחת מסונכרנת זחלי L1 על גבי מצע גידול נמטודות (NGM) בגודל 9 ס"מ - צלחת אגר המכילה חיידקי OP50 וגדלים עד לשלב L4 ב-20 מעלות צלזיוס.
    2. אסוף חיות L4 על ידי שטיפת תולעים מהצלחת באמצעות 5 מ"ל של מאגר M9. העבירו את מאגר ה-M9 המכיל תולעי L4 לצינור של 15 מ"ל באמצעות פיפטת זכוכית או פיפטה מפלסטיק סיליקון, וצנטריפוגה ב-1000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי לגלול בעדינות את התולעים. הסר את הסופרנטנט בזהירות, והקפד להשאיר את כדור התולעת ללא הפרעה.
    3. שלב קריטי: כדי להעביר או להוציא נמטודות השתמש בפיפטה מזכוכית או בקצה פיפטה מפלסטיק שטופל בחומר סיליקון (למשל, SigmaCote) בהתאם להוראות היצרן. זה מונע הידבקות של תולעים למשטח הפלסטיק של קצה הפיפטה.
    4. חזור על שלב 2.3.2 שלוש פעמים נוספות כדי לשטוף את כל חיידקי OP50 מהתולעים.
    5. קח את כדור התולעת ב -5 מ"ל של מאגר M9 וספור את מספר התולעים הקיימות ב -10 מיקרוליטר.
    6. צלחת L4 על לוחות אגר NGM 6 ס"מ המכילים חיידקי בקרת וקטור ריקים (EV) או hsp-90 RNAi בצפיפות של 10 תולעים לצלחת (מכינים 5 צלחות לנקודת זמן ושכפול ביולוגי) ודוגרים במשך 24-48 שעות ב-20 מעלות צלזיוס.
    7. לאחר 24 שעות (=יום 1 בוגרים) ו-48 שעות (=יום 2 בוגרים) סופרים את מספר מוקדי Q44 במעיים של נמטודות המציגות אגרגטים. ציון כולל של 30-50 נמטודות לכל שכפול ביולוגי.

3. מסך RNAi מועמד ספציפי לרקמות עבור משנים של פרוטאוסטזיס לא אוטונומי של תאים

הערה: עבור מסך ה-RNAi הספציפי לרקמה השתמשנו בזן PVH172 המאפשר RNAi ספציפי למעי על ידי הזנת חיידקי RNAi וזן PVH171 המאפשר RNAi ספציפי לשריר (ראה טבלה 1 לגנוטיפ).

  1. הכנת לוחות ה- RNAi המועמדים
    1. הכן צלחות אגר NGM 6 ס"מ בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין, 12.5 מיקרוגרם/מ"ל טטרציקלין ו-1 מ"מ IPTG לפי שיטות סטנדרטיות25.
    2. השתמש בספריית Ahringer RNAi כדי להשיג את שיבוטי ה-RNAi המועמדים למסך RNAi20.
    3. חסנו 3 מ"ל של מדיה LB-amp (50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין במדיה LB) בצינור של 15 מ"ל עם שיבוט ה-RNAi הרצוי באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק. גדל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם תסיסה.
    4. למחרת הוסיפו את Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid (IPTG) (ממלאי של 1 M) לריכוז סופי של 1 מ"מ בתרבית הלילה של החיידקים.
    5. מערבבים את התרביות למשך 3 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    6. צלחת 300 מיקרוליטר של תרבית RNAi חיידקית על צלחת אגר NGM בגודל 6 ס"מ בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין, 12.5 מיקרוגרם/מ"ל טטרציקלין ו-1 מ"מ IPTG. הניחו לצלחות להתייבש על הספסל למשך יומיים בטמפרטורת החדר, מכוסות בנייר אלומיניום להגנה מפני אור. לאחר הייבוש, ניתן לאחסן את לוחות ה-RNAi בקופסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  2. סנכרון של C. elegans וטיפול בחיידקי RNAi
    1. כדי לסנכרן זני תולעים, בחר 15 בוגרים על צלחות RNAi ואפשר להטיל ביצים למשך שעה. ואז מוציאים את המבוגרים מהצלחת.
    2. שלב קריטי: סנכרון על ידי הלבנה נמנע במקרה זה, מכיוון שהוא יכול לגרום לכתב hsp-70p::RFP , מכיוון שהוא מצב מלחיץ עבור C. elegans.
    3. בחר זחלי שלב L4 מסונכרנים והעביר לצלחת RNAi טרייה.
    4. אפשר לנמטודות לגדול על ה-RNAi הרלוונטי במשך שני דורות כדי להבטיח קליטה יעילה של dsRNA, וודא שהטמפרטורה נשמרת על 20 מעלות צלזיוס.
    5. להדמיה וכימות פלואורסצנטי hsp-70p::RFP , השתמש במבוגרים ביום הראשון.
  3. הכנת שקופיות מיקרוסקופ
    1. הכן את שקופיות המיקרוסקופ על ידי הנחת ~250 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז של 2% (במאגר M9) על שקופית מיקרוסקופ זכוכית והנחת שקופית שנייה למעלה ליצירת דיסק שטוח.
    2. הניחו 5 מיקרוליטר של תמיסת Levamisole של 5 מ"מ (במאגר M9) על כרית האגרוז שנקבעה והעבירו תולעים בוגרות של 5 ימים 1 לתוך טיפת Levamisol. השאירו את הנמטודות לשיתוק למשך 5 דקות.
    3. לאחר ש-C. elegans משותק, יישר בזהירות עם קיסם חוט פלטינה והסר עודפי levamisole עם מגבון מעבדה לפני הוספת כיסוי.
    4. שלב קריטי: הקפד לצלם תמונות של התולעים תוך 30 דקות לאחר הכנת שקופיות המיקרוסקופ. נמטודות משותקות בשקופית המיקרוסקופ עלולות להתייבש ולהתפוצץ, מה שעלול לפגוע במדידות הקרינה.
  4. הגדרות מיקרוסקופ וניתוח תמונה
    הערה: התמונות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במצלמת EM-CCD ותוכנת אוטומציה וניתוח תמונות מיקרוסקופיות.
    1. צלם תמונות בהגדלות פי 10 באמצעות לייזר 561 ננומטר לעירור פלואורסצנטי RFP. ודא שכל התמונות מצולמות באמצעות אותן הגדרות עבור עוצמת לייזר, גודל חור סיכה ורווח פלואורסצנטי כדי לאפשר השוואות.
    2. שמור את כל התמונות כקובצי TIFF.
    3. בצע ניתוח תמונה באמצעות ImageJ. מדוד את עוצמת הקרינה בכל תמונה כפיקסלים ליחידת שטח, תוך הפחתת הקרינה ברקע. נרמל את עוצמת הקרינה עבור כל תמונה לאזור התמונה וכן לאורך התולעים.
    4. מדידת העוצמה הממוצעת באמצעות ניתוח | מדידה ב-ImageJ. נרמלו את ערך העוצמה המתקבל לאזור התמונה באמצעות חלוקת העוצמה באזור.
    5. כדי לנרמל את העוצמה לאורך התולעת, מדוד את התולעת על ידי ציור קו לאורך התולעת ב-ImageJ ושימוש ב-Analyze | למדוד. הסיבה לנורמליזציה של עוצמת הקרינה לאורך התולעת, היא שתולעים יכולות להשתנות בגודלן, תלוי בגן שהופל על ידי RNAi, וזה יכול להשפיע על העוצמה הממוצעת.
    6. לנרמל את עוצמות הקרינה הנמדדות לבקרות לא מטופלות (כלומר, C טרנסגני . elegans שגדלו על לוחות RNAi בקרה (EV). אסוף את הערכים המנורמלים כדי להשוות את עוצמות הקרינה הממוצעות עבור כל מצב RNAi. שאפו לדמות 20 תולעים לכל שכפול ביולוגי ולאסוף לפחות 3 תמונות שכפול ביולוגיות.
    7. חשב ערכי P של ערכי עוצמת הקרינה הממוצעת באמצעות מבחן t של התלמיד ובצע תיקון לבדיקות מרובות בשיטת בנימיני-הוכברג, תוך שימוש בשיעור גילוי שגוי של 0.05.

תוצאות

RNAi ספציפי לרקמה בשתי דרכים: ביטוי של מבני סיכות ראש או השלמת SID-1 ספציפית לרקמה
ביטוי של מבני RNAi של סיכת ראש ספציפית לרקמה מאפשר הפלה מכוננת של גן לאורך ההתפתחות. עם זאת, לפעמים זה יכול להיות לא מעשי כאשר הגן הנסקר נדרש לאורגנוגנזה של אותה רקמה מסוימת, כגון elt-2

Discussion

השיטות המתוארות כאן מדגימות את השימוש בכלים המאפשרים הפלה ספציפית לרקמה של רכיבי PN באופן מכונן וזמני. זיהינו בעבר TCS, מנגנון תגובת מתח לא אוטונומי של תאים המושרה על ידי שינוי ספציפי לרקמה של רמות ביטוי Hsp9010. הפלה ספציפית לרקמה של hsp-90 על ידי ביטוי RNAi של סי?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר ריצ'רד א. מורימוטו על אספקת הזן AM722. חלק מזני C. elegans ששימשו במחקר זה סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של ה-NIH (P40 OD010440). P.v.O.-H. מומן על ידי מענקים מ-NC3Rs (NC/P001203/1) ועל ידי פרס Wellcome Trust Seed (200698/Z/16/Z). J.M. נתמך על ידי שותפות הכשרת דוקטורט של MRC DiMeN (MR/N013840/1).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinMerckA0166-5GProtocol Section 3.1.
DNA Clean & Concentrator-500Zymo ResearchD4031Protocol Section 2.2.
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosideMerck367-93-1Protocol Section 3.1.
Multisite Gateway Cloning KitThermo Fisher12537100Protocol Section 1.2.
SigmaCoteMerckSL2-25mLProtocol Section 2.3.
TetracyclineMerckT7660-5GProtocol Section 3.1.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning KitThermo FisherK280002Protocol Section 1.1.

References

  1. Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 76, 91-99 (2011).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 421-435 (2019).
  3. Imanikia, S., Özbey, N. P., Krueger, C., Casanueva, M. O., Taylor, R. C. Neuronal XBP-1 Activates Intestinal Lysosomes to Improve Proteostasis in C. elegans. Current Biology. 29, 2322-2338 (2019).
  4. Berendzen, K. M., et al. Neuroendocrine Coordination of Mitochondrial Stress Signaling and Proteostasis. Cell. 166, 1553-1563 (2016).
  5. O'Brien, D., et al. A PQM-1-Mediated Response Triggers Transcellular Chaperone Signaling and Regulates Organismal Proteostasis. Cell Reports. 23, 3905-3919 (2018).
  6. Tatum, M. C., et al. Neuronal Serotonin Release Triggers the Heat Shock Response in C. elegans in the Absence of Temperature Increase. Current Biology. 25, 163-174 (2015).
  7. Miles, J., Scherz-Shouval, R., van Oosten-Hawle, P. Expanding the Organismal Proteostasis Network: Linking Systemic Stress Signaling with the Innate Immune Response. Trends in Biochemical Sciences. 44, 927-942 (2019).
  8. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 Is a Cell-Nonautonomous Regulator of Stress Resistance and Longevity. Cell. 153, 1435-1447 (2013).
  9. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320, 811-814 (2008).
  10. van Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of Organismal Proteostasis by Transcellular Chaperone Signaling. Cell. 153, 1366-1378 (2013).
  11. Frakes, A. E., et al. Four glial cells regulate ER stress resistance and longevity via neuropeptide signaling in C. elegans. Science. 367, 436-440 (2020).
  12. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  13. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  14. Hinas, A., Wright, A. J., Hunter, C. P. SID-5 is an endosome-associated protein required for efficient systemic RNAi in C. elegans. Current Biology. 22, 1938-1943 (2012).
  15. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans Requires the Putative Transmembrane Protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
  16. McEwan, D. L., Weisman, A. S., Hunter, C. P. Uptake of extracellular double-stranded RNA by SID-2. Molecular Cell. 47, 746-754 (2012).
  17. Whangbo, J. S., Weisman, A. S., Chae, J., Hunter, C. P. SID-1 Domains Important for dsRNA Import in Caenorhabditis elegans. G3 GenesGenomesGenetics. 7, 3887-3899 (2017).
  18. Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1. Science. 301, 1545-1547 (2003).
  19. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7, 554-559 (2010).
  20. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  21. Lee, Y. S., Carthew, R. W. Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers. Methods (San Diego CA). 30, 322-329 (2003).
  22. Evans, T. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
  23. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
  24. Lim, M. A., et al. Reduced Activity of AMP-Activated Protein Kinase Protects against Genetic Models of Motor Neuron Disease. Journal of Neuroscience. 32, 1123-1141 (2012).
  25. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  26. Hawkins, M. G., McGhee, J. D. elt-2, a second GATA factor from the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 270, 14666-14671 (1995).
  27. Bharadwaj, S., Ali, A., Ovsenek, N. Multiple components of the HSP90 chaperone complex function in regulation of heat shock factor 1 In vivo. Molecular and Cellular Biology. 19, 8033-8041 (1999).
  28. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9, 1003466 (2013).
  29. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14914-14919 (2009).
  30. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 10417-10422 (2002).
  31. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine Proteins at the Pathogenic Threshold Display Neuron-Specific Aggregation in a Pan-Neuronal Caenorhabditis elegans Model. Journal of Neuroscience. 26, 7597-7606 (2006).
  32. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin Signaling and the Heat Shock Response Modulate Protein Homeostasis in the Caenorhabditis elegans Intestine during Infection. Journal of Biological Chemistry. 283, 194-201 (2008).
  33. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. , e52321 (2015).
  34. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400, 166-173 (2007).
  35. Zou, L., et al. Construction of a germline-specific RNAi tool in C. elegans. Scientific Reports. 9, 1-10 (2019).
  36. Silva-García, C. G., et al. Single-Copy Knock-In Loci for Defined Gene Expression in Caenorhabditis elegans. G3 Bethesda Md. 9, 2195-2198 (2019).
  37. Chang, J. T., Kumsta, C., Hellman, A. B., Adams, L. M., Hansen, M. Spatiotemporal regulation of autophagy during Caenorhabditis elegans aging. eLife. 6, 18459 (2017).
  38. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7, 473-478 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RNAiRNAi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved