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要約

生物のプロテオスタシスの維持には、ある組織から別の組織へのシャペロン発現などのタンパク質品質管理応答の調整が必要です。ここでは、 C.エレガンス に用いられるツールを提供し、特定の組織におけるタンパク質静止能力のモニタリングと細胞間シグナル伝達応答の決定を可能にします。

要約

過去10年間で、タンパク質の品質管理プロセスの制御に関する知識は変革的に増加しており、細胞の非自律的プロテオスタシスの制御における細胞間シグナル伝達プロセスの重要性が明らかになりました。最近の研究では、ある組織から別の組織へのタンパク質の品質管理を調整するシグナル伝達成分と経路が明らかになり始めています。したがって、細胞非自律的プロテオスタシスネットワーク(PN)のメカニズムと構成要素、および老化、ストレス応答、およびタンパク質のミスフォールディング疾患との関連性を特定することが重要です。研究室では、組織特異的RNAiによる遺伝子ノックダウンとストレスレポーター、組織特異的なタンパク質抑制センサーを組み合わせて研究しています。ストレス状態を知覚する組織や応答する細胞に作用して防御応答を活性化する細胞非自律的PNの成分を調査および特定するための方法論について説明します。まず、特定の組織における構成的遺伝的ノックダウンのためのヘアピンRNAiコンストラクトを生成する方法と、さまざまなライフステージでRNAiを供給することにより組織特異的な遺伝的ノックダウンを実行する方法について説明します。ストレスレポーターと行動アッセイは、全身のストレスシグナル伝達プロセスを修飾する遺伝子と状態の迅速なスクリーニングを可能にする貴重な読み出しとして機能します。最後に、さまざまな組織で発現するプロテオスタシスセンサーを利用して、発生と老化のさまざまな段階でのPNの組織特異的容量の変化を決定します。したがって、これらのツールは、特定の組織におけるPNの能力を明確にし、モニタリングすると同時に、生物の細胞非自律性PNを媒介するためにさまざまな組織で機能する成分を特定するのに役立つはずです。

概要

細胞のプロテオスタシスは、分子シャペロン、ストレス応答、ユビキチンプロテアソームシステム(UPS)やオートファジー1,2などのタンパク質品質管理コンポーネントの複雑なネットワークによってモニターされます。HSF-1を介した熱ショック応答(HSR)、小胞体(UPRER)のアンフォールドタンパク質応答、およびミトコンドリア(UPRmito)などのストレス応答経路の活性化は、環境問題や毒性タンパク質凝集1,2,3,4,5につながる環境課題やタンパク質のミスフォールディング疾患に対する細胞の適応と生存に不可欠です。6.

細胞のプロテオスタシスは、C.エレガンスなどの多細胞生物の追加の層によって調整されており、分子シャペロンなどの保護タンパク質品質管理コンポーネントを活性化するために、さまざまな組織間で細胞ストレス応答を調整する必要があります7。過去10年間で、熱ショック応答(HSR)、UPRERおよびUPRmito、ならびに細胞内シャペロンシグナル伝達(TCS)において、「細胞性」ストレス応答経路の細胞非自律的活性化が観察されている3,4,7,8,9,10 .いずれの場合も、神経系および腸からのシグナル伝達は、組織全体のシャペロンの活性化を制御する上で重要な役割を果たし、急性および慢性のタンパク質のミスフォールディングストレスの毒性結果から保護する3,5,9,11。ニューロンから腸や末梢の他の細胞へのこの伝達は、UPRERやHSR 6,8,11の場合と同様に、神経伝達物質によって達成できます。ニューロンにおけるHSP-90の発現増加によって活性化される細胞非自律的ストレスシグナル伝達の1つの形態であるTCSでは、分泌された免疫ペプチドがニューロンから筋肉へのhsp-90シャペロン発現の活性化に役割を果たす5。TCSの別の形態では、腸における主要な分子シャペロンhsp−90の発現を減少させると、体壁筋5,10における許容温度での熱誘導性hsp−70の発現が増加する。しかし、この特定のケースでは、ストレスを知覚する腸で活性化される特定のシグナル伝達分子と応答する筋細胞は不明です。

したがって、シャペロン発現が1つの組織から別の組織にどのように活性化されるかを特定するためには、組織特異的レベルでのプロテオスタシスネットワーク(PN)およびストレス応答活性化の能力を監視できるアプローチが必要です。個々の組織においてどのストレス応答経路が活性化されるかを調べるために、蛍光タンパク質タグに融合した転写シャペロンレポーターの利用可能な選択を利用することができる(表3も参照のこと)。これらには、HSRの誘導を示す蛍光タグ付きhsp-90、hsp-70、hsp-16.2転写レポーター、UPRERの活性化を示すhsp-4、UPR水戸を示すhsp-6が含まれます。これらのレポーターと組織特異的なストレス状態を組み合わせることで、ストレスを感知する遠位の「送信者」組織のPNの不均衡に応答する個々の組織をピンポイントで特定する強力な読み出しが可能になります。特定の組織におけるPNのストレス状態または不均衡を誘発するために、さまざまなアプローチをとることができます。例えば、そのようなアプローチの一つは、ストレス転写因子(例えば、xbp-1s)の活性化型の異所性発現によるものであり、もう一つは、組織特異的プロモーター8,10を用いて必須分子シャペロン(例えば、hsp-90)の発現レベルを低下させることによるものである。1つの細胞タイプのPN成分を枯渇させるには、RNAiによる組織特異的ノックダウンが有用なツールです。

しかし、C.エレガンスでは、RNAiは全身性です。環境中の二本鎖RNAは、標的遺伝子12,13をサイレンシングするために動物全体に侵入して拡散する可能性があります。この摂取されたdsRNAの全身的な広がりは、dsRNAトランスポーターであるSID-1およびSID-2タンパク質、ならびに後期エンドソームタンパク質と共局在し、摂取されたdsRNAの輸送に関与しているSID-5などのSID(全身性RNAi欠損)タンパク質によって媒介されます14,15,16。SID-1は、ニューロンを除く全ての細胞におけるマルチパス膜貫通タンパク質であり、dsRNAの輸送および細胞へのインポートに必要である17。SID−2の発現は腸に限定されており、腸内腔から腸細胞の細胞質に摂取されたdsRNAのエンドサイトーシス受容体として機能する16。ニューロンは全身性RNAiに対する応答を欠いており、これはニューロンにおける膜貫通タンパク質SID-1の発現減少と相関しており、これはdsRNAが輸入されるために不可欠な15,18。したがって、組織特異的なRNAiが1つの細胞タイプでのみ効果を発揮するためには、dsRNAの全身的な拡散を防ぐ必要があります。これは、組織15を横切るdsRNAの放出および取り込みを防止するRNAi耐性sid-1(pk3321)変異体を利用することによって達成することができる。この変異体における組織特異的ヘアピンRNAiコンストラクトの発現、または特定の組織におけるSID−1の異所性発現は、次いで、変異体sid−1の機能を補完し、組織特異的RNAi19を可能にする。

では、 dsRNAはsid-1 の機能喪失変異体で腸からどのように摂取され、その後、SID-1構築物を異所的に発現するニューロンまたは筋肉細胞にどのように到達できるのでしょうか?このメカニズムを説明する1つの現在のモデルでは、エンドサイトーシスされたdsRNAはSID-2を介して腸の細胞質に取り込まれ、次にSID-5とトランスサイトーシス17を含む別のSID-1に依存しないメカニズムによって偽体腔に輸送されます17。したがって、SID−1はdsRNAの輸入17に必要であるため、野生型SID−1を発現する細胞のみが、腸から放出されたdsRNAを偽体腔に取り込むことができる。

ここでは、組織特異的なRNAiを可能にする一連のツールの使用を示します。分子シャペロンHsp90の例を用いて、特定の組織における遺伝子発現を構成的にノックダウンするのに有用であり得るヘアピンRNAiの構築を説明する10。記載されたアプローチは、目的の任意の標的遺伝子に使用できます。組織特異的 なhsp-90 RNAiによって引き起こされるプロテオスタシスの不均衡に対する他の組織の応答は、他の組織における蛍光タグ付きストレスレポーターの発現をモニタリングすることで調べることができます。組織特異的RNAiの2番目の方法として、 シド-1 変異体システムをヘアピンRNAiコンストラクトの発現ではなく、RNAi発現細菌のフィーディングにどのように適応できるかを示します。これは、候補またはゲノムワイドなRNAiスクリーニングを実施して、組織特異的な応答に必要な成分を特定する場合に役立ちます。同様に、重要なPN成分の枯渇に関連する発生障害は、発生の後期に特定の組織でRNAiを介したノックダウンを必要とします。組織特異的TCS修飾剤の候補RNAiスクリーニングでSID-1相補システムをどのように使用できるかを示します。この例では、「ストレスを知覚する」送信者組織(腸)とストレス影響組織(筋肉)をノックダウンすると、筋肉細胞における蛍光タグ付き hsp-70 レポーターの発現が変化するシグナル伝達成分を特定することを目指しています。

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プロトコル

1. 2つの方法での組織特異的RNAi:ヘアピンRNAiと組織特異的SID-1相補

  1. sid-1変異体における組織特異的発現のためのヘアピンRNAiコンストラクトの作製
    1. 標的遺伝子配列(例えば、Ahringer RNAiライブラリー20のhsp-90 RNAiクローンから単離されたhsp-90配列)をPCRにより増幅する。hsp-90配列の3'末端、すなわちSfiI部位(ATCTA)21に非回文配列を配置する。
      注:SfiI配列(下線部)を持つ hsp-90 のクローニングに使用されるプライマーは次のとおりです。
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
    2. 増幅した配列を市販のクローニングキットベクター(TOPO pCR BluntIIなど)にサブクローニングします。
    3. XbaIおよびPstI制限部位を用いた制限消化により、hsp-90 RNAiクローン(Ahringer RNAiライブラリー)20から逆hsp-90配列を単離し、それをベクター内のhsp-90-SfiI配列の下流に配置する(ステップ1.1.1から)、hsp-90ヘアピンコンストラクトを得る(図1)。
    4. ヘアピンコンストラクトをGatewayエントリーベクターpDONR221にサブクローンし、ニューロンにおけるいずれかの発現に対する組織特異的なプロモーターを含むGatewayエントリークローン(rgef-1p) と融合します。腸内 (VHA-6P); または供給者のプロトコルに記載されているゲートウェイ反応における体壁筋 (UNC-54P)および UNC-54 3'UTR (または任意の他の選択の3'UTR)。
    5. 得られたヘアピンRNAiコンストラクト(図1)を、コード配列の外側のユニークな制限部位を用いて線状化し、100 ng/μLのヘアピンRNAiコンストラクトの濃度で複合体アレイとしてマイクロインし、100 ng/μL N2ブリストルゲノムDNA(ScaIで消化)と混合して、hsp-70p::RFPレポーター(AM722株)を発現するC.エレガンス株にhsp-70p::RFPレポーター(AM722株)を発現させ、sid-1(pk3321)の遺伝的背景に交配します。変異体(株NL3321)。複雑なアレイのマイクロインジェクションを実行する方法に関するプロトコルについては、22に従ってください。
    6. ネガティブコントロールとして、組織特異的プロモーターの制御下で非回文性SfiI含有配列(GGCCATCTAGGCC)を発現する空のベクターヘアピンコンストラクトを使用します。
    7. レポーターの増加した hsp-70p::RFP 発現を読み取り値として使用して、 hsp-90 ヘアピンRNAiを発現する陽性の形質転換体をスコアリングします(図3)。目的の遺伝子の組織特異的なノックダウンを検証するためのより一般的なアプローチとして、目的の遺伝子のqRT-PCRを使用して全動物のmRNAレベルを測定します。
    8. 腸特異的 hsp-90 ヘアピンコンストラクト(PVH2; 表1参照)を発現する得られた株の染色体外アレイをガンマ線照射により統合します。染色体外アレイのゲノムへの組み込みについては、22を参照されたい。
  2. dsRNA発現細菌への供給による組織特異的なRNAiを可能にする組織特異的SID-1発現
    1. ベクターTU867(unc-119p::SID-1)19からsid-1ゲノムDNAをGatewayエントリーベクターpDONR221にサブクローンします。sid-1 DNAのクローニング用のプライマーは19に見られます。sid-1 pDONR221コンストラクトを、筋肉(myo-3p)または腸(vha-6p)特異的プロモーターを含むGatewayエントリークローンとunc-54 3'UTR(または任意の他の3'UTR)を融合させます。これは、1.1.4で前述したGateway反応です。
    2. 得られた vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR または myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR コンストラクトを30 ng/μLの濃度で、赤色蛍光咽頭同時注入マーカー(例: myo-2p::RFP; 5 ng/μL)とともに sid-1(pk3321) 変異体にマイクロインジェクションします。
    3. 染色体外腸または筋肉特異的な sid-1 アレイをゲノムに統合します(22)。ここでは、これにより PVH5 [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP];sid-1(pk3321) および PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP];SID-1(PK3321)です。
    4. sid-1(pk3321)変異体におけるsid-1のニューロン特異的発現には、TU3401 uIs3401[unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP];SiD-1(PK3321)は、Calixto et al.19によって以前に生成されました。
    5. 1.1.7で述べたように、目的の標的遺伝子のmRNAレベルをqRT-PCRで測定することにより、目的の遺伝子の組織特異的なノックダウンを確保します。あるいは、同じ組織で発現する蛍光タンパク質(GFPやRFPなど)を使用して組織特異的なRNAi感度を確認し、GFPまたはRFP RNAiで線虫を治療します。線虫を同期L1期の幼虫としてGFP/RFP RNAiに曝露し、成体期の1日目までRNAi細菌上で増殖します(図2を参照)。私たちの場合、ニューロン、筋肉、腸でSID-1を発現する株を使用し、ニューロン(AM987)、腸(AM986)、筋肉(AM988)でHSP-90::RFPを発現する株に交配しました。

2. ストレスレポーターとプロテオスタシスセンサーを用いた細胞自律型および非自律型プロテオスタシスのモニタリング

注:特定の組織のPN容量を監視するには、組織特異的なタンパク質静止センサー(腸でQ44を発現する株や筋肉でQ35を発現する株など- 表3を参照)とストレスレポーター(熱誘導性 hsp-70p :: mCherry レポーターなど)を使用します。 表3)。

  1. sid-1(pk3321)変異対立遺伝子を遺伝的に交配してプロテオスタシスセンサー株に移植し、RNAiを供給することでsid-1(pk3321)の存在を確認
    1. 遺伝的に、プロテオスタシスセンサー/ストレスレポーター株を sid-1 (pk3321) 変異株の遺伝的背景に交差させます。異なるトランスジェニック株間の遺伝的交配を確立するには、詳細なプロトコルについて23 に従ってください。
      注: sid-1(pk3321)変異体はRNAiの摂食に耐性があるため、必須遺伝子( elt-2 や hsp-90など)に対するRNAiによる胚の処理は、 sid-1 遺伝子のヘテロ接合型または野生型の株の発生停止または幼虫の致死につながるだけです。
    2. 10人の妊娠した雌雄同体に、 elt-2 または hsp-90 に対してRNAiプレートに卵を産ませ、制御します(空のベクター;EV) RNAiプレートを20°Cで保存します。 1〜2時間後に母親を取り外し、N2ブリストルと sid-1(pk3321) 変異体をコントロールとして使用します。
    3. 次の2〜3日間でRNAiプレート上の幼虫の発達を観察します。 ELT-2 RNAiはL1幼虫の停止を引き起こし、 hsp-90 RNAiはN2ブリストルのL3幼虫の停止をもたらします。 SID-1 変異体はRNAi処理の影響を受けず、妊娠した成体に成長します。
      注:シド-1(pk3321)のC.エレガンスホモ接合体は、成人期に発達する均一な集団を示します。ヘテロ接合体は、幼虫の停止を示す一部の動物と成虫に成長する一部の動物の混合集団によって示されます。
  2. ジェノタイピングによる sid-1(pk3321) の存在確認
    1. 選択した候補F2株の15〜20個の線虫を、15 μLの線虫溶解バッファーを含むPCRチューブに取り込みます(表2)。
    2. チューブを-80°Cに少なくとも10分間または一晩置きます。
    3. 以下のプログラムを使用して、PCRマシンでチューブをインキュベートします。
    4. 65°Cで60分間(リセワーム);95°Cで15分間(プロテイナーゼKを不活性化する)。4°Cで保持します。
    5. 2 μLの線虫溶解物を「テンプレート」として使用し、 シド-1のプライマーである sid-1 forw:5'-agctctgtacttgtattattcg-3'および sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'を使用して、ジェノタイピングのためのPCR反応を行います。
    6. PCRジェノタイピングには、次のプログラムを使用します:95°Cで1サイクル、3分間。次に、95°Cで10回、55°Cで30秒、72°Cで30秒の30サイクル。72°Cで1サイクル10分間、4°Cで保持します。
    7. PCR精製キット(Table of Materials)を使用して~650 bp PCR産物を精製し、 sid-1 PCR産物の配列決定により、 sid-1(pk3321) 対立遺伝子のG-to-A点変異を同定します。あるいは、G-to-A点変異は、ApoI制限部位を作成し、24に記載されているように、ジェノタイピングのためにPCR産物上で使用することができる。
  3. iQ44::YFPを腸のプロテオスタシスセンサーとして使用
    1. 腸内でQ44::YFPを発現する C.エレガンス (OG412株)または漂白によって sid-1(pk3321) 変異体背景に交配したC.エレガンスを、25に記載されているプロトコルに従って同期させます。L1幼虫をOP50細菌を含む9cmの線虫増殖培地(NGM)寒天プレートに同期させ、20°CでL4段階まで増殖させます。
    2. 5 mLのM9バッファーを使用してプレートからワームを洗い流し、L4動物を回収します。L4線虫を含むM9バッファーをガラスピペットまたはシリコン処理プラスチックピペットを使用して15 mLチューブに移し、1000 x g で室温で1分間遠心分離して、線虫を穏やかにペレット化します。上清を慎重に取り除き、ワームペレットが邪魔されないようにします。
    3. 重要なステップ:線虫を移すまたはプレートアウトするには、製造元の指示に従って、シリコン化剤(SigmaCoteなど)で処理されたガラスピペットまたはプラスチックピペットチップを使用します。これにより、ピペットチップのプラスチック表面にワームが付着するのを防ぎます。
    4. 手順2.3.2をさらに3回繰り返して、ワームからすべてのOP50細菌を洗い流します。
    5. 5 mLのM9バッファーにワームペレットを取り込み、10 μL中に存在するワームの数を数えます。
    6. エンプティベクターコントロール(EV)または hsp-90 RNAi細菌を含む6 cm NGM寒天プレート上にL4動物をプレート10匹の線虫の密度でプレート化し(各時点につき5枚のプレートを調製し、生物学的複製)、20°Cで24〜48時間インキュベートします。
    7. 24時間後(=成体1日目)と48時間後(=成虫2日目)に、凝集体を示す線虫の腸内のQ44病巣の数を数えます。生物学的複製ごとに合計30〜50の線虫をスコアリングします。

3. 細胞非自律的プロテオスタシスの修飾因子のための組織特異的候補RNAiスクリーニング

注:組織特異的RNAiスクリーニングには、RNAi細菌を供給することで腸特異的RNAiを可能にするPVH172株と、筋肉特異的RNAiを可能にするPVH171株を使用しました(遺伝子型については表1を参照)。

  1. 候補RNAiプレートの調製
    1. 標準的な方法に従って、100 μg/mL アンピシリン、12.5 μg/mL テトラサイクリン、および 1 mM IPTG を添加した 6 cm NGM 寒天プレートを調製します25。
    2. Ahringer RNAiライブラリを使用して、RNAiスクリーニング20の候補RNAiクローンを取得する。
    3. プラスチック製ピペットチップを使用して、3 mLのLB-amp培地(LB培地中の50 μg/mLアンピシリン)を15 mLチューブに目的のRNAiクローンで接種します。攪拌しながら一晩37°Cで成長させます。
    4. 翌日、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)(1 Mストックから)を最終濃度1 mMまで細菌で一晩培養します。
    5. 培養物を37°Cでさらに3時間撹拌します。
    6. 100 μg/mL アンピシリン、12.5 μg/mL テトラサイクリン、1 mM IPTG を添加した 6 cm NGM 寒天プレートに 300 μL の細菌 RNAi 培養物をプレートします。プレートを室温で2日間ベンチで乾燥させ、光から保護するためにアルミホイルで覆います。乾燥後、RNAiプレートは4°Cの箱に数週間保存できます。
  2. C.エレガンスの同期とRNAi細菌による治療
    1. 線虫株を同期させるには、15匹の妊娠した成虫をRNAiプレートに選び、1時間産卵させます。次に、大人をプレートから取り出します。
    2. 重要なステップ:この場合、漂白による同期は、C.エレガンスにとってストレスの多い状態であるため、hsp-70p::RFPレポーターを誘発する可能性があるため、避けられます。
    3. 同期したL4ステージの幼虫をピックし、新鮮なRNAiプレートに移します。
    4. 線虫が関連するRNAi上で2世代にわたって増殖するのを許し、dsRNAの効率的な取り込みを確保し、温度が20°Cに保たれるようにします。
    5. イメージングおよび hsp-70p::RFP 蛍光定量には、1日目の成人を使用してください。
  3. 顕微鏡スライドの準備
    1. 2% アガロース溶液 (M9 バッファー中) を ~250 μL の 2% 顕微鏡スライドに置き、その上に 2 つ目のスライドを載せてフラットディスクを作成し、顕微鏡スライドを調製します。
    2. 5 μLの5 mMレバミゾール溶液(M9バッファー中)をセットしたアガロースパッドに置き、1日目の成虫5匹をレバミゾールドロップに移します。線虫を5分間麻痺させます。
    3. C.エレガンスが麻痺したら、プラチナワイヤーピックで慎重に位置合わせし、カバースリップを追加する前に実験室のワイプで余分なレバミゾールを取り除きます。
    4. 重要なステップ: 顕微鏡スライドの調製後30分以内に線虫の画像を撮影するようにしてください。顕微鏡スライド上の麻痺した線虫は、乾燥して破裂し、蛍光測定に支障をきたす可能性があります。
  4. 顕微鏡の設定と画像解析
    注:画像は、EM-CCDカメラと顕微鏡画像自動化および画像分析ソフトウェアを備えた共焦点顕微鏡を使用して取得されます。
    1. RFP蛍光励起には、561 nmレーザーを使用して10倍の倍率で画像を撮影します。すべての画像がレーザー出力、ピンホールサイズ、蛍光ゲインの同じ設定を使用して撮影されていることを確認して、比較できるようにします。
    2. すべての画像をTIFFファイルとして保存します。
    3. ImageJ を使用して画像解析を実行します。各画像の蛍光強度を単位面積あたりのピクセル数で測定し、背景蛍光を差し引いて測定します。各画像の蛍光強度を画像領域と線虫の長さに合わせて正規化します。
    4. Analyze | ImageJで測定します。強度を面積で割ることにより、結果の強度値を画像領域に正規化します。
    5. 強度をワームの長さに正規化するには、ImageJ でワームの長さに沿って線を引いてワームを測定し、 Analyze |測定します。蛍光強度を線虫の長さに正規化する理由は、RNAiによってノックダウンされる遺伝子によって線虫のサイズが異なる可能性があり、これが平均強度に影響を与える可能性があるためです。
    6. 測定された蛍光強度を未処理のコントロール(すなわち、トランスジェニック C) に正規化します。コントロール(EV)RNAiプレートで成長したエレガンス)。正規化された値をプールして、各RNAi条件の平均蛍光強度を比較します。生物学的複製ごとに 20 匹の線虫を画像化し、少なくとも 3 つの生物学的複製画像を収集することを目指します。
    7. スチューデントのt検定を使用して平均蛍光強度値のP値を計算し、Benjamini-Hochberg法を使用して、0.05の偽発見率を使用して多重検定の補正を実行します。

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結果

2つの方法での組織特異的RNAi:ヘアピンコンストラクトの発現または組織特異的SID-1相補
組織特異的ヘアピンRNAiコンストラクトの発現により、発生全体を通じて遺伝子の構成的ノックダウンが可能になります。しかし、これは、調査対象の遺伝子が、腸の発達に必要な elt−2 のような特定の組織の器官形成に必要とされる場合には、時に非現実的...

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ディスカッション

ここで説明する方法は、PN成分の組織特異的なノックダウンを構成的および時間的に行うことを可能にするツールの使用を示しています。私たちは以前に、Hsp90発現レベルの組織特異的な変化によって誘発される細胞の非自律的ストレス応答メカニズムであるTCSを特定しました10。ヘアピンRNAiの発現による hsp-90 の組織特異的ノックダウンは、...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

AM722株を提供してくださったRichard I. Morimoto博士に感謝いたします。この研究で使用された一部のC.エレガンス株は、NIH研究インフラストラクチャープログラムオフィス(P40 OD010440)によって資金提供されているCaenorhabditis遺伝学センターによって提供されました。P.v.O.-H.は、NC3Rs(NC/P001203/1)からの助成金とWellcome Trust Seed Award(200698/Z/16/Z)から資金提供を受けました。J.M.は、MRC DiMeN博士課程研修パートナーシップ(MR/N013840/1)の支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinMerckA0166-5GProtocol Section 3.1.
DNA Clean & Concentrator-500Zymo ResearchD4031Protocol Section 2.2.
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosideMerck367-93-1Protocol Section 3.1.
Multisite Gateway Cloning KitThermo Fisher12537100Protocol Section 1.2.
SigmaCoteMerckSL2-25mLProtocol Section 2.3.
TetracyclineMerckT7660-5GProtocol Section 3.1.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning KitThermo FisherK280002Protocol Section 1.1.

参考文献

  1. Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 76, 91-99 (2011).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 421-435 (2019).
  3. Imanikia, S., Özbey, N. P., Krueger, C., Casanueva, M. O., Taylor, R. C. Neuronal XBP-1 Activates Intestinal Lysosomes to Improve Proteostasis in C. elegans. Current Biology. 29, 2322-2338 (2019).
  4. Berendzen, K. M., et al. Neuroendocrine Coordination of Mitochondrial Stress Signaling and Proteostasis. Cell. 166, 1553-1563 (2016).
  5. O'Brien, D., et al. A PQM-1-Mediated Response Triggers Transcellular Chaperone Signaling and Regulates Organismal Proteostasis. Cell Reports. 23, 3905-3919 (2018).
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