전신 스트레스 신호전달을 위한 구성 요소를 식별하기 위한 조직 특이적 RNAi 도구

요약

유기체 단백질체(organismal proteostasis)를 유지하려면 한 조직에서 다른 조직으로의 샤페론(chaperone) 발현과 같은 단백질 품질 관리 반응의 조정이 필요합니다. 여기에서는 특정 조직의 단백질 단백 능력을 모니터링하고 세포 간 신호 반응을 결정할 수 있는 예쁜꼬마선충에 사용되는 도구를 제공합니다.

초록

지난 10년 동안 단백질 품질 관리 프로세스의 조절을 둘러싼 지식이 혁신적으로 증가하여 세포-비자율 단백질체(cell-nonautonomous proteostasis) 조절에서 세포 간 신호 전달 과정의 중요성이 밝혀졌습니다. 최근 연구는 이제 한 조직에서 다른 조직으로 단백질 품질 관리를 조정하는 신호 구성 요소와 경로를 밝히기 시작했습니다. 따라서 세포-비자율 단백질화 네트워크(PN)의 메커니즘과 구성 요소, 그리고 노화, 스트레스 반응 및 단백질 잘못 접힘 질환에 대한 관련성을 식별하는 것이 중요합니다. 실험실에서는 조직 특이적 RNAi에 의한 유전자 녹다운(genetic knockdown)을 스트레스 리포터 및 조직 특이적 단백질화 센서와 함께 사용하여 이를 연구합니다. 우리는 스트레스 상태를 인식하는 조직과 보호 반응을 활성화하기 위해 반응하는 세포에서 작용할 수 있는 세포-비자율적 PN의 구성 요소를 조사하고 식별하는 방법론을 설명합니다. 먼저 특정 조직에서 구조적 유전자 녹다운을 위한 헤어핀 RNAi 구조를 생성하는 방법과 다양한 생활 단계에서 RNAi를 공급하여 조직 특이적 유전자 녹다운을 수행하는 방법을 설명합니다. 스트레스 리포터와 행동 분석은 전신 스트레스 신호 전달 과정을 수정하는 유전자 및 상태를 빠르게 스크리닝할 수 있는 귀중한 판독 자료로 기능합니다. 마지막으로, 서로 다른 조직에서 발현되는 단백질화 센서를 사용하여 다양한 발달 및 노화 단계에서 PN의 조직 특이적 용량의 변화를 결정합니다. 따라서 이러한 도구는 특정 조직에서 PN의 능력을 명확히 하고 모니터링할 수 있도록 하는 동시에 유기체에서 세포-비자율적 PN을 매개하기 위해 다른 조직에서 기능하는 구성 요소를 식별하는 데 도움이 되어야 합니다.

서문

세포 프로테오스타시스는 분자 샤페론, 스트레스 반응 및 유비퀴틴 프로테아좀 시스템(UPS) 및 자가포식 ^1,2를 포함한 분해 메커니즘과 같은 단백질 품질 관리 구성 요소의 복잡한 네트워크에 의해 모니터링됩니다. HSF-1 매개 열충격 반응(HSR), 소포체(UPR^ER) 및 미토콘드리아(UPR^mito)의 풀린 단백질 반응과 같은 스트레스 반응 경로의 활성화는 독성 단백질 응집을 유발하는 환경 문제 또는 단백질 잘못 접힘 질병에 대한 세포 적응 및 생존에 필수적입니다 ^{1,2,3,4,5, 6}.

세포 프로테오스타시스(cellular proteostasis)는 예쁜꼬마선충(C. elegans)과 같은 다세포 유기체의 추가 층에 의해 조정되며, 분자 샤페론(molecular chaperones)과 같은 보호 단백질 품질 관리 구성 요소를 활성화하기 위해 서로 다른 조직 전반에 걸친 세포 스트레스 반응의 오케스트레이션이 필요합니다⁷. 지난 10년 동안 열 충격 반응(HSR), UPR^ER 및 UPR^미토, 세포 간 샤페론 신호전달(TCS)에 대해 "세포" 스트레스 반응 경로의 세포 비자율적 활성화가 관찰되었습니다3,4,7,8,9,10 . 각각의 경우에서, 신경계와 장으로부터의 신호는 급성 및 만성 단백질 잘못 접힘 스트레스의 독성 결과로부터 보호하기 위해 조직 전반에 걸쳐 샤페론의 활성화를 제어하는 데 중요한 역할을 합니다 3,5,9,11. 뉴런에서 장 및 말초의 다른 세포로의 이러한 전달은 UPR^ER 및 HSR ^6,8,11의 경우와 같이 신경 전달 물질에 의해 달성될 수 있습니다. 뉴런에서 HSP-90의 발현 증가에 의해 활성화되는 세포 비자율적 스트레스 신호의 한 형태인 TCS에서 분비된 면역 펩타이드는 뉴런에서 근육으로의 hsp-90 샤페론 발현을 활성화하는 데 중요한 역할을 합니다⁵. TCS의 또 다른 형태로, 장에서 주요 분자 샤페론 hsp-90의 발현을 감소시키면 체벽 근육의 허용 온도에서 열 유도성 hsp-70의 발현이 증가합니다 ^5,10. 그러나 이 특별한 경우, 스트레스를 감지하는 장과 반응하는 근육 세포에서 활성화되는 특정 신호 분자는 알려져 있지 않습니다.

따라서 한 조직에서 다른 조직으로 샤페론 발현이 어떻게 활성화되는지 확인하기 위해서는 조직 특이적 수준에서 단백질화 네트워크(PN)의 용량과 스트레스 반응 활성화를 모니터링할 수 있는 접근 방식이 필요합니다. 개별 조직에서 어떤 스트레스 반응 경로가 활성화되는지 조사하기 위해 형광 단백질 태그에 융합된 사용 가능한 전사 샤프론 리포터를 활용할 수 있습니다(표 3 참조). 여기에는 HSR의 유도를 나타내는 형광 표지된 hsp-90, hsp-70 및 hsp-16.2 전사 리포터, UPR^ER의 활성화를 나타내는 hsp-4 및 UPR^mito를 나타내는 hsp-6이 포함됩니다. 이러한 리포터와 조직 특이적 스트레스 상태를 결합하면 스트레스를 감지하는 원위 "발신자" 조직에서 PN의 불균형에 반응하는 개별 조직을 정확히 찾아내는 강력한 판독을 할 수 있습니다. 특정 조직에서 스트레스 상태나 PN의 불균형을 유도하기 위해 다른 접근 방식을 취할 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 접근법 중 하나는 스트레스 전사 인자(예: xbp-1s)의 활성화된 형태의 이소성 발현에 의한 것이고, 또 다른 접근법은 조직 특이적 프로모터 ^8,10을 사용하여 필수 분자 샤페론(예: hsp-90)의 발현 수준을 줄이는 것입니다. 단 하나의 세포 유형에서 PN 성분을 고갈시키기 위해서는 RNAi에 의한 조직 특이적 녹다운(tissue-specific knockdown)이 유용한 도구입니다.

그러나 C. elegans에서 RNAi는 전신적입니다. 환경에 있는 이중 가닥 RNA는 표적 유전자를 침묵시키기 위하여 동물 전체에 들어가고 퍼질 수 있다^{12, 13}. 섭취된 dsRNA의 이러한 전신 확산은 dsRNA 수송체인 SID-1 및 SID-2 단백질과 같은 SID(전신 RNAi 결함) 단백질과 후기 엔도솜 단백질과 공동 국소화하고 섭취된 dsRNA 14,15,16의 수출에 관여하는 SID-5에 의해 매개됩니다. SID-1은 뉴런을 제외한 모든 세포에 있는 다중 통과 막관통 단백질(multi-pass transmembrane protein)이며, dsRNA를 세포로 반출하고 가져오는 데 필요합니다¹⁷. SID-2 발현은 장으로 제한되어 장 내강에서 장 세포질로 섭취된 dsRNA에 대한 내포세포 수용체로 기능합니다¹⁶. 뉴런은 전신 RNAi에 대한 반응이 부족하며, 이는 뉴런에서 막관통 단백질 SID-1의 발현 감소와 관련이 있으며, 이는 dsRNA를 가져오는 데 필수적입니다^15,18. 따라서 조직 특이적 RNAi가 하나의 세포 유형에서만 효과적이려면 dsRNA의 전신 확산을 방지해야 합니다. 이는 조직 전반에 걸쳐 dsRNA의 방출 및 흡수를 방지하는 RNAi 저항성 sid-1(pk3321) 돌연변이를 활용하여 달성할 수 있습니다¹⁵. 이 돌연변이에서 조직 특이적 헤어핀 RNAi 구축물의 발현 또는 특정 조직에서 SID-1의 이소성 발현은 돌연변이 sid-1의 기능을 보완할 수 있으며 조직 특이적 RNAi¹⁹를 가능하게 합니다.

그렇다면 dsRNA는 sid-1 기능 상실 돌연변이에서 장에 의해 어떻게 섭취되며, SID-1 구조체를 이소적으로 발현하는 뉴런 또는 근육 세포에 어떻게 도달할 수 있을까요? 이 메커니즘을 설명하는 하나의 현재 모델에서, 세포내이입된 dsRNA는 SID-2를 통해 장 세포질로 흡수된 다음 SID-5 및 transcytosis¹⁷을 포함하는 다른 SID-1 독립 메커니즘에 의해 pseudocoelom으로 내보내집니다. 따라서 SID-1은 dsRNA import¹⁷에 필요하기 때문에 야생형 SID-1을 발현하는 세포만이 장에서 방출된 dsRNA를 pseudocoelom으로 흡수할 수 있습니다.

여기에서는 조직 특이적 RNAi를 허용하는 일련의 도구를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 분자 샤페론 Hsp90의 예를 사용하여 특정 조직에서 유전자 발현을 구조적으로 녹다운하는 데 유용할 수 있는 헤어핀 RNAi의 구조를 설명합니다¹⁰. 기술된 접근법은 관심의 모든 표적 유전자에 사용될 수 있습니다. 조직 특이적 hsp-90 RNAi에 의해 야기된 단백질 불균형에 대한 다른 조직의 반응은 다른 조직에서 형광 표지된 스트레스 리포터의 발현을 모니터링하여 조사할 수 있습니다. 조직 특이적 RNAi에 대한 두 번째 방법으로, sid-1 돌연변이 시스템이 헤어핀 RNAi 구조체의 발현이 아닌 RNAi 발현 박테리아에 공급되도록 적응할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이는 조직 특이적 반응에 필요한 구성 요소를 식별하기 위해 후보 물질 또는 게놈 전체 RNAi 스크리닝을 수행할 때 유용할 수 있습니다. 마찬가지로, 중요한 PN 구성 요소의 고갈과 관련된 발달 결함은 발달의 후반 단계에서 특정 조직에서 RNAi 매개 녹다운을 필요로 합니다. 조직 특이적 TCS 변형자에 대한 후보 RNAi 스크리닝에서 SID-1 보체 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 예에서는 "스트레스를 감지하는" 발신자 조직(장)과 스트레스 유발 조직(근육)을 녹다운할 때 근육 세포에서 형광 태그가 지정된 hsp-70 리포터의 발현이 변경되는 신호 구성 요소를 식별하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

1. 두 가지 방식의 조직 특이적 RNAi: 헤어핀 RNAi 및 조직 특이적 SID-1 보완

1. sid-1 돌연변이에서 조직 특이적 발현을 위한 헤어핀 RNAi 구축물 생성
   1. PCR에 의해 타겟 유전자 서열(예: Ahringer RNAi 라이브러리²⁰의 hsp-90 RNAi 클론에서 분리된 hsp-90 서열)을 증폭합니다. hsp-90 서열의 3' 끝에 비회문 서열, 즉 SfiI 부위(ATCTA)²¹을 배치합니다.
      참고: SfiI 서열(밑줄이 그어진 부분)을 사용하여 hsp-90 을 클로닝하는 데 사용되는 프라이머는 다음과 같습니다.
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      AS-HSP90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
   2. 증폭된 염기서열을 상용 클로닝 키트 벡터(예: TOPO pCR BluntII)에 서브클로닝합니다.
   3. XbaI 및 PstI 제한 부위를 사용하여 제한 분해를 통해 hsp-90 RNAi 클론(Ahringer RNAi 라이브러리)²⁰에서 반전된 hsp-90 염기서열을 분리하고 벡터에서 hsp-90-SfiI 염기서열의 다운스트림에 배치하여(단계 1.1.1에서) hsp-90 헤어핀 구조를 생성합니다(그림 1).
   4. 헤어핀 구조체를 Gateway entry vector pDONR221로 서브클론하고 뉴런(rgef-1p) 에서 발현에 대한 조직 특이적 프로모터를 포함하는 Gateway entry 클론과 융합합니다.장내 (VHA-6P); 또는 공급자의 프로토콜에 설명된 대로 게이트웨이 반응에서 체벽 근육 (unc-54p) 및 unc-54 3'UTR (또는 선택한 기타 3'UTR).
   5. 코딩 염기서열 외부의 고유한 제한 부위를 사용하여 생성된 hairpin RNAi constructs(그림 1)를 선형화하고 1ng/μL hairpin RNAi constructs의 농도에서 복잡한 어레이로 microinject하고 100ng/μL N2 Bristol genomic DNA(ScaI로 분해됨)와 혼합하여 hsp-70p::RFP 리포터(균주 AM722)를 발현하고 sid-1(pk3321)의 유전적 배경으로 교차합니다. 돌연변이(균주 NL3321). 복잡한 어레이의 마이크로 주입을 수행하는 방법에 대한 프로토콜은²²를 참조하십시오.
   6. 음성 대조군으로, 조직 특이적 프로모터의 제어하에 비회문 SfiI 함유 서열(GGCCATCTAGGCC)을 발현하는 빈 벡터 헤어핀 구조를 사용합니다.
   7. hsp-90 hairpin RNAi를 발현하는 양성 형질전환체를 점수화하기 위해 리포터의 증가된 hsp-70p::RFP 발현을 판독값으로 사용합니다(그림 3). 관심 유전자의 조직 특이적 knock-down을 확인하기 위한 보다 일반적인 접근 방식을 위해 관심 유전자의 qRT-PCR을 사용하여 전체 동물 mRNA 수준을 측정하십시오.
   8. 감마선 조사에 의해 장 특이적 hsp-90 헤어핀 구조체(PVH2, 표 1 참조)를 발현하는 생성된 균주의 염색체 외 어레이를 통합합니다. 염색체 외 배열을 게놈에 통합하려면²²를 참조하십시오.
2. dsRNA 발현 박테리아를 공급하여 조직 특이적 RNAi를 허용하는 조직 특이적 SID-1 발현
   1. 벡터 TU867(unc-119p::SID-1)¹⁹의 sid-1 게놈 DNA를 Gateway entry vector pDONR221로 서브클론합니다. sid-1 DNA의 클로닝을 위한 프라이머는¹⁹에서 찾을 수 있습니다. 1.1.4에서 이전에 설명한 바와 같이 sid-1 pDONR221 구조체를 근육(myo-3p) 또는 장(vha-6p) 특이적 프로모터 및 unc-54 3'UTR(또는 선택한 기타 3'UTR)을 포함하는 Gateway entry 클론과 융합합니다.
   2. 생성된 vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR 또는 myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR 구조체를 적색 형광 인두 동시 주입 마커(예: myo-2p::RFP; 5ng/μL)와 함께 30ng/μL 농도로 sid-1(pk3321) 돌연변이에 미세주입합니다.
   3. 염색체외 장 또는 근육 특이적 sid-1 어레이를²²에 설명된 대로 게놈에 통합합니다. 여기서, 이로 인해 PVH5 균주[myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]가 생성되었습니다. sid-1(pk3321) 및 PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; SID-1(PK3321)입니다.
   4. sid-1(pk3321) 돌연변이에서 sid-1의 뉴런 특이적 발현을 위해 균주 TU3401 uIs3401[unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP]를 사용하십시오. sid-1(pk3321)은 이전에 Calixto et ^al.19에 의해 생성되었습니다.
   5. 1.1.7에서 언급했듯이 qRT-PCR로 원하는 타겟 유전자의 mRNA 수준을 측정하여 관심 유전자의 조직 특이적 knockdown을 보장합니다. 또는 동일한 조직에서 발현된 형광 단백질(예: GFP 또는 RFP)을 사용하여 조직 특이적 RNAi 민감도를 확인하고 GFP 또는 RFP RNAi로 기생충을 치료합니다. 선충을 동기화된 L1 단계 유충으로 GFP/RFP RNAi에 노출시키고 성체가 된 1일차까지 RNAi 박테리아에서 성장합니다(그림 2 참조). 우리의 경우, 뉴런, 근육 또는 장에서 SID-1을 발현하는 균주를 사용하였고, 뉴런(AM987), 장(AM986) 및 근육(AM988)에서 HSP-90::RFP를 발현하는 균주로 교차하였다.

2. 스트레스 리포터 및 프로테오스타시스 센서를 사용하여 세포 자율 및 세포 비자율 프로테오스타시스 모니터링

참고: 특정 조직에서 PN 용량을 모니터링하려면 조직 특이적 단백질 단백질화 센서(예: 장에서 Q44 또는 근육에서 Q35를 발현하는 균주 – 표 3 참조) 및 스트레스 리포터(예: 열 유도성 hsp-70p::mCherry 리포터; 표 3).

1. sid-1 (pk3321) 돌연변이 대립유전자를 proteostasis sensor strain으로 유전적으로 교차시키고 RNAi를 공급하여 sid-1(pk3321)의 존재를 확인
   1. 단백질분해 센서/스트레스 리포터 균주를 sid-1 (pk3321) 돌연변이 균주의 유전적 배경으로 유전적으로 교차합니다. 서로 다른 형질전환 균주 간의 유전적 교배를 확립하려면 자세한 프로토콜에 대해²³ 을 따르십시오.
      참고: sid-1(pk3321) 돌연변이는 RNAi를 먹이는 것에 내성이 있으므로 필수 유전자( 예: elt-2 또는 hsp-90)에 대해 RNAi로 배아를 처리하면 sid-1 유전자에 대한 이형접합 또는 야생형 균주에서 발달 정지 또는 유충 치사율만 유발됩니다.
   2. 10마리의 임신성 자웅동체가 elt-2 또는 hsp-90 에 대해 RNAi 플레이트에 알을 낳고 대조군(빈 벡터; EV) 20°C에서 RNAi 플레이트. 1 - 2시간 후에 어머니를 제거합니다. N2 Bristol과 sid-1(pk3321) 돌연변이를 대조군으로 사용합니다.
   3. 다음 2-3일 동안 RNAi 플레이트에서 유충의 발달을 관찰합니다. 엘트-2 RNAi는 L1 유충 정지를 초래하는 반면, hsp-90 RNAi는 N2 브리스톨에서 L3 유충 정지를 초래합니다. sid-1 돌연변이는 RNAi 처리의 영향을 받지 않으며 임신성 성체로 발달합니다.
      참고: sid-1(pk3321)에 대한 C. elegans homozygote는 성체로 발달하는 균일한 개체군을 보여줍니다. 이형접합체(Heterozygotes)는 일부 동물의 혼합 개체군이 유충 정지를 보이고 일부 동물이 성인으로 발달하는 것으로 표시됩니다.
2. 유전형 분석을 통한 sid-1(pk3321) 의 존재 여부 확인
   1. 15μL의 웜 용해 버퍼가 들어 있는 PCR 튜브에 선택한 후보 F2 균주 중 15-20개의 웜을 선택합니다(표 2).
   2. 튜브를 -80°C에서 최소 10분 또는 하룻밤 동안 놓습니다.
   3. 다음 프로그램을 사용하여 PCR 기계에서 튜브를 배양합니다.
   4. 65 ° C 60 분 (용해 웜); 95°C에서 15분 (Proteinase K 비활성화); 4 °C에서 유지하십시오.
   5. 2 μL의 웜 용해물을 "템플릿"으로 사용하여 sid-1에 대한 다음 프라이머를 사용하여 유전형 분석을 위한 PCR 반응을 수행합니다: sid-1 forw: 5'-agctctgtacttgtattcg-3' 및 sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
   6. PCR 유전형 분석을 위해 다음 프로그램을 사용하십시오 : 95 ° C에서 3 분 동안 1 사이클; 그런 다음 10 초 동안 95 ° C, 30 초 동안 55 ° C, 30 초 동안 72 ° C의 30 사이클; 72°C에서 10분 동안 1회 사이클, 4°C에서 유지합니다.
   7. PCR 정제 키트(Table of Materials)를 사용하여 ~650 bp PCR 산물을 정제하고 sid-1 PCR 산물을 염기서열분석하여 sid-1 (pk3321) 대립유전자의 G-to-A 점 돌연변이를 식별합니다. 대안적으로, G-to-A 점 돌연변이는 ApoI 제한 부위를 생성하며, 이는²⁴에 설명된 바와 같이 유전형 분석을 위해 PCR 산물에 사용할 수 있습니다.
3. iQ44::YFP를 장용 단백질 단백 센서로 사용
   1. ²⁵에 설명된 프로토콜에 따라 장에서 Q44::YFP를 발현하거나(균주 OG412) sid-1(pk3321) 돌연변이 배경으로 교차한 예쁜꼬마선충을 동기화합니다. OP50 박테리아가 포함된 9cm 선충 성장 배지(NGM)-한천 플레이트에 L1 유충을 동기화하고 20°C에서 L4 단계까지 성장합니다.
   2. 5mL의 M9 완충액을 사용하여 플레이트에서 벌레를 씻어내어 L4 동물을 수집합니다. 유리 피펫 또는 실리콘화 플라스틱 피펫을 사용하여 L4 웜이 포함된 M9 버퍼를 15mL 튜브로 옮기고 실온에서 1분 동안 1000 x g 에서 원심분리하여 웜을 부드럽게 펠릿화합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 웜 펠릿을 방해받지 않도록 하십시오.
   3. 중요 단계: 선충을 옮기거나 플레이트를 제거하려면, 제조업체의 지침에 따라 실리콘화제(예: SigmaCote)로 처리된 유리 피펫 또는 플라스틱 피펫 팁을 사용하십시오. 이것은 피펫 팁의 플라스틱 표면에 벌레가 달라붙는 것을 방지합니다.
   4. 2.3.2단계를 세 번 더 반복하여 웜에서 모든 OP50 박테리아를 씻어냅니다.
   5. 5mL의 M9 완충액에 있는 웜 펠릿을 취하고 10μL에 존재하는 웜의 수를 계산합니다.
   6. 플레이트당 10개의 웜 밀도로 빈 벡터 제어(EV) 또는 hsp-90 RNAi 박테리아를 포함하는 6cm NGM 한천 플레이트에 L4 동물을 플레이트하고 20°C에서 24-48시간 동안 배양합니다.
   7. 24시간(=1일차 성어) 및 48시간(=2일차 성어) 후 응집체를 나타내는 선충의 장에서 Q44 병소의 수를 계산합니다. 생물학적 복제물당 총 30-50개의 선충을 채점합니다.

3. 세포 비자율 단백질화(nonautonomous proteostasis)의 변형자에 대한 조직 특이적 후보 RNAi 스크리닝

참고: 조직 특이적 RNAi 스크리닝의 경우 RNAi 박테리아를 공급하여 장 특이적 RNAi를 허용하는 PVH172 균주와 근육 특이적 RNAi를 허용하는 균주 PVH171을 사용했습니다(유전자형은 표 1 참조).

1. 후보 RNAi 플레이트의 준비
   1. 표준 방법에 따라 100μg/mL 암피실린, 12.5μg/mL 테트라사이클린 및 1mM IPTG가 보충된 6cm NGM 한천 플레이트를 준비합니다²⁵.
   2. RNAi 스크리닝(²⁰)에 대한 후보 RNAi 클론을 얻기 위해 Ahringer RNAi 라이브러리를 사용한다.
   3. 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 원하는 RNAi 클론으로 15mL 튜브에 3mL의 LB-amp 매체(LB 매체의 50μg/mL 암피실린)를 접종합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 교반하여 성장시킵니다.
   4. 다음 날 Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid(IPTG)(1M 스톡에서)를 박테리아 야간 배양에서 최종 농도 1mM에 추가합니다.
   5. 37°C에서 3시간 더 교반합니다.
   6. 100μg/mL 암피실린, 12.5μg/mL 테트라사이클린 및 1mM IPTG가 보충된 6cm NGM 한천 플레이트에 300μL의 박테리아 RNAi 배양액을 플레이트합니다. 접시를 실온에서 2일 동안 벤치에서 건조시키고 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮습니다. 건조된 RNAi 플레이트는 4°C의 상자에 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
2. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 동기화와 RNAi 박테리아와의 치료
   1. 지렁이 균주를 동기화하려면 15마리의 임신 성체를 RNAi 플레이트에 올려놓고 1시간 동안 알을 낳습니다. 그런 다음 접시에서 성인을 제거하십시오.
   2. 중요한 단계: 이 경우 백화에 의한 동기화는 예쁜꼬마선충에게 스트레스가 많은 조건이므로 hsp-70p::RFP 리포터를 유도할 수 있으므로 피합니다.
   3. 동기화된 L4 단계 유충을 선택하고 새로운 RNAi 플레이트로 옮깁니다.
   4. dsRNA의 효율적인 흡수를 보장하기 위해 관련 RNAi에서 선충이 2세대에 걸쳐 성장할 수 있도록 하고 온도를 20°C로 유지합니다.
   5. 이미징 및 hsp-70p::RFP 형광 정량화의 경우 Day 1 adults를 사용합니다.
3. 현미경 슬라이드 준비
   1. ~250μL의 2% 아가로스 용액(M9 완충액)을 유리 현미경 슬라이드에 놓고 그 위에 두 번째 슬라이드를 놓아 평평한 디스크를 만들어 현미경 슬라이드를 준비합니다.
   2. 5μL의 5mM 레바미솔 용액(M9 완충액)을 세트 아가로스 패드에 놓고 5일 1마리의 성충을 레바미솔 드롭으로 옮깁니다. 선충을 5분 동안 마비시키도록 놔둡니다.
   3. 예쁜꼬마선충이 마비되면 백금 와이어 픽에 조심스럽게 정렬하고 커버슬립을 추가하기 전에 실험실 물티슈로 과도한 레바미솔을 제거합니다.
   4. 중요한 단계: 현미경 슬라이드를 준비한 후 30분 이내에 벌레의 이미지를 촬영해야 합니다. 현미경 슬라이드에서 마비된 선충은 건조되고 파열될 수 있으며, 이로 인해 형광 측정이 손상될 수 있습니다.
4. 현미경 설정 및 이미지 분석
   참고: 이미지는 EM-CCD 카메라와 현미경 이미지 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어가 장착된 컨포칼 현미경을 사용하여 얻습니다.
   1. RFP 형광 여기를 위해 561nm 레이저를 사용하여 10배 배율로 이미지를 촬영합니다. 비교를 위해 레이저 출력, 핀홀 크기 및 형광 게인에 대해 동일한 설정을 사용하여 모든 이미지를 촬영했는지 확인합니다.
   2. 모든 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다.
   3. ImageJ를 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 각 이미지의 형광 강도를 배경 형광을 뺀 단위 영역당 픽셀로 측정합니다. 각 이미지의 형광 강도를 이미지 영역과 웜의 길이로 정규화합니다.
   4. Analyze(분석) | ImageJ로 측정합니다. 결과 intensity 값을 영역별로 intensity를 나누어 이미지 영역에 대해 정규화합니다.
   5. 강도를 웜 길이로 정규화하려면 ImageJ에서 웜의 길이를 따라 선을 그리고 Analyze | 측정. 형광 강도를 웜 길이로 정규화하는 이유는 웜이 RNAi에 의해 녹다운된 유전자에 따라 크기가 다양할 수 있으며 이것이 평균 강도에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.
   6. 측정된 형광 강도를 처리되지 않은 대조군(즉, 형질전환 C. 대조군(EV) RNAi 플레이트에서 자란 예쁜꼬마선마선충). 정규화된 값을 풀링하여 각 RNAi 조건에 대한 평균 형광 강도를 비교합니다. 생물학적 복제물당 20개의 기생충을 이미지화하고 최소 3개의 생물학적 복제 이미지를 수집하는 것을 목표로 합니다.
   7. 스튜던트 t 검정을 사용하여 평균 형광 강도 값의 P-값을 계산하고 0.05의 거짓 발견률을 사용하여 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 검정에 대한 보정을 수행합니다.

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결과

두 가지 방식의 조직 특이적 RNAi: 헤어핀 구조체의 발현 또는 조직 특이적 SID-1 보완
조직 특이적 헤어핀 RNAi 구조체의 발현은 발달 전반에 걸쳐 유전자의 구조적 넉다운을 가능하게 합니다. 그러나, 이것은 조사된 유전자가 장의 발달에 필요한 elt-2 와 같은 특정 조직의 기관 형성에 필요한 경우 때때로 실용적이지 않을 수 있습니다²⁶

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토론

여기에 설명된 방법은 구성적 및 시간적 방식으로 PN 구성 요소의 조직 특이적 녹다운을 허용하는 도구의 사용을 보여줍니다. 우리는 이전에 Hsp90 발현 수준¹⁰의 조직 특이적 변경에 의해 유도되는 세포 비자율적 스트레스 반응 메커니즘인 TCS를 확인했습니다. 헤어핀 RNAi의 발현에 의한 hsp-90 의 조직 특이적 녹다운(knockdown)은 원위 조직에서 보호

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Merck	A0166-5G	Protocol Section 3.1.
DNA Clean & Concentrator-500	Zymo Research	D4031	Protocol Section 2.2.
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Merck	367-93-1	Protocol Section 3.1.
Multisite Gateway Cloning Kit	Thermo Fisher	12537100	Protocol Section 1.2.
SigmaCote	Merck	SL2-25mL	Protocol Section 2.3.
Tetracycline	Merck	T7660-5G	Protocol Section 3.1.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K280002	Protocol Section 1.1.