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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

En este documento de método, presentamos una estrategia de cribado de alto rendimiento para identificar compuestos químicos, como los osmolitos, que tienen un impacto significativo en la persistencia bacteriana.

Resumen

Los persistentes bacterianos se definen como una pequeña subpoblación de variantes fenotípicas con la capacidad de tolerar altas concentraciones de antibióticos. Son un problema de salud importante, ya que se han asociado con infecciones crónicas recurrentes. Aunque se sabe que la dinámica estocástica y determinista de los mecanismos relacionados con el estrés juega un papel significativo en la persistencia, los mecanismos subyacentes al cambio fenotípico hacia / desde el estado de persistencia no se entienden completamente. Si bien los factores de persistencia desencadenados por las señales ambientales (por ejemplo, el agotamiento de las fuentes de carbono, nitrógeno y oxígeno) han sido ampliamente estudiados, los impactos de los osmolitos en la persistencia aún no se han determinado. Utilizando microarrays (es decir, 96 placas de pozo que contienen diversos productos químicos), hemos diseñado un enfoque para dilucidar los efectos de varios osmolitos en la persistencia de Escherichia coli de una manera de alto rendimiento. Este enfoque es transformador, ya que se puede adaptar fácilmente para otras matrices de cribado, como paneles de medicamentos y bibliotecas de eliminación de genes.

Introducción

Los cultivos bacterianos contienen una pequeña subpoblación de células persistentes que son temporalmente tolerantes a niveles inusualmente altos de antibióticos. Las células persistentes son genéticamente idénticas a sus parientes sensibles a los antibióticos, y su supervivencia se ha atribuido a la inhibición transitoria del crecimiento1. Las células persistentes fueron descubiertas por primera vez por Gladys Hobby2, pero el término fue utilizado por primera vez por Joseph Bigger cuando las identificó en cultivos de Staphylococcus pyogenes tratados con penicilina3. Un estudio seminal publicado por Balaban et al.4 descubrió dos tipos persistentes: variantes de tipo I que se forman principalmente por paso a través de la fase estacionaria, y variantes de tipo II que se generan continuamente durante el crecimiento exponencial. Los persistentes son detectados por ensayos clonogénicos de supervivencia, en los que se toman muestras de cultivo a varios intervalos durante los tratamientos con antibióticos, se lavan y se platean en un medio de crecimiento típico para contar las células sobrevivientes que pueden colonizarse en ausencia de antibióticos. La existencia de persistientes en un cultivo celular se evalúa mediante una curva de muerte bifásica4,5 donde la desintegración exponencial inicial indica la muerte de células sensibles a los antibióticos. Sin embargo, la tendencia a matar disminuye con el tiempo, lo que eventualmente conduce a una región de meseta que representa las células persistentes sobrevivientes.

Las células persistentes se han asociado con diversas enfermedades como la tuberculosis6,la fibrosis quística7,la candidiasis8 y las infecciones del tracto urinario9. Se encontró que casi todos los microorganismos analizados hasta el momento generan fenotipos persistentes, incluyendo Mycobacterium tuberculosis6altamente patógena, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 y Candida albicans8. Estudios recientes también proporcionan evidencia del aumento de mutantes multirresistentes de subpoblaciones persistentes11,12. Los esfuerzos sustanciales en esta esfera han revelado que los mecanismos de persistencia son muy complejos y diversos; Se sabe que tanto los factores estocásticos como los deterministas asociados con la respuesta SOS13,14,las especies reactivas de oxígeno (ROS)15,los sistemas toxina/antitoxina (TA)16,la autofagia o autogestión17 y la respuesta rigurosa relacionada con ppGpp18 son conocidos por facilitar la formación de persistidores.

A pesar del progreso significativo en la comprensión del fenotipo de persistencia, los efectos de los osmolitos sobre la persistencia bacteriana no se han entendido completamente. Dado que el mantenimiento de la presión osmótica óptima es una necesidad para el crecimiento, el funcionamiento adecuado y la supervivencia de las células, un estudio en profundidad de los osmolitos podría conducir a posibles objetivos para las estrategias anti-persistentes. Aunque laborioso, la detección de alto rendimiento es un enfoque muy eficaz para identificar metabolitos y otras sustancias químicas que desempeñan un papel crucial en el fenotipo de persistencia19,20. En este trabajo, discutiremos nuestro método publicado19,donde hemos utilizado microarrays, es decir, 96 placas de pozo que contienen varios osmolitos (por ejemplo, cloruro de sodio, urea, nitrito de sodio, nitrato de sodio, cloruro de potasio), para identificar osmolitos que influyen significativamente en la persistencia de E. coli.

Protocolo

1. Preparación de medio de crecimiento, solución de ofloxacina y acciones de células de E. coli

  1. Medio regular Luria-Bertani (LB): Añadir 10 g/L de triptona, 10 g/L de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g/L de extracto de levadura en agua desionizada (DI). Esterilizar el medio por autoclave.
  2. Placas de agar LB: Añadir 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura y 15 g/L de agar en agua DI y esterilizar el medio por autoclave. A la temperatura deseada (~55 °C), verter ~30 mL de agar medio en placas cuadradas (10 x 10 cm). Secar las placas y conservar a 4 °C.
  3. Medio LB modificado: Añadir 10 g/L de triptona y 5 g/L de extracto de levadura en agua DI. Esterilizar el medio por autoclave.
  4. Medio LB modificado incluyendo un osmolito: Mezcle 2x medio LB modificado con una solución de osmolito 2x en volúmenes iguales. Para preparar 2x medio LB modificado, añadir 20 g/L de triptona y 10 g/L de extracto de levadura en agua DI y esterilizar por autoclave. Para preparar la solución de osmillo 2x, disuelva el osmolito de interés (cantidad 2x) en agua DI y luego filtre la solución.
    NOTA: El osmolito de interés y sus concentraciones pueden determinarse a partir de los ensayos de cribado de microarrays de fenotipo (véase el Protocolo 4). Sin embargo, el osmolito probado y la concentración 2x asociada se pueden ajustar dependiendo de la naturaleza de la investigación. Por ejemplo, para estudiar el impacto del cloruro de sodio de 1 mM, una solución de osmolito 2x sería una solución de cloruro de sodio de 2 mM.
  5. Solución común de ofloxacina (5 mg/mL): Añadir 5 mg de sal de ofloxacina (OFX) en 1 mL de agua di. Añadir 10 μL de hidróxido de sodio 10 M para aumentar la solubilidad de OFX en agua, y luego filtrar esterilizar la solución. Preparar las alícuotas y conservar a -20 °C.
    NOTA: La ofloxacina es un antibiótico quinolona que ha sido ampliamente utilizado tanto para células bacterianas en crecimiento como para células bacterianas en crecimiento14,21. La concentración inhibitoria mínima (MIC) de OFX para las células mg1655 de E. coli está dentro del rango de 0,039–0,078 μg/mL19,20. También tenga en cuenta que otros antibióticos como la ampicilina y la kanamicina se utilizan comúnmente en la investigación persistente. La elección de los antibióticos depende de la naturaleza del estudio.
  6. E. coli Poblaciones celulares MG1655: Inocular 2 mL de medio LB regular con una sola colonia en un tubo de ensayo de 14 mL (a presión) y cultivar las células en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C. Cuando las células alcancen la fase estacionaria, mezcle 500 μL del cultivo celular con 500 μL de glicerol al 50% (estéril) en un vial criogénico y guárdelo a -80 °C.

2. Propagación de células para eliminar persistidores preexistentes

  1. Para preparar un cultivo nocturno, raspe una pequeña cantidad de células de una culata de células congeladas con una punta de pipeta estéril (no descongele la culata de células de glicerol) e inoculte las células en 2 mL de medio LB modificado en un tubo de ensayo de 14 mL con tapa a presión. Cultite las células en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C durante 12 h.
  2. Primera propagación
    1. Después de 12 h, transferir 250 μL de cultivo nocturno a 25 mL de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 ml cubierto con un papel de aluminio estéril.
    2. Crezca el cultivo celular en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C hasta que las células alcancen la fase exponencial media (OD600 = 0,5).
    3. Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600)utilizando un lector de microplacas cada 30 min.
  3. Segunda propagación
    1. A600 OD = 0,5, diluir 250 μL de cultivo celular del primer matraz en 25 mL de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 ml.
    2. Cultivar el segundo cultivo celular en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C hasta OD600=0,5.
    3. Mida la densidad óptica cada 30 min.
      NOTA: Un cultivo nocturno puede tener una cantidad significativa de células persistentes4,5,22. El método de ciclo de dilución/crecimiento5 descrito anteriormente se puede utilizar para eliminar estos persistentes preexistentes antes de transferir las células a microarrays. Su eliminación puede validarse cuantificando los niveles persistentes de cultivos nocturnos con el ensayo descrito en el Protocolo 3. Este método ya ha sido validado en un estudio anterior19.

3. Validación de la eliminación de celdas persistentes preexistentes

  1. Después de la segunda propagación (véase el paso 2.3), diluir 250 μL del cultivo celular (OD600 = 0,5) en 25 ml de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 ml.
    NOTA: Para los controles, diluya 250 μL de cultivo nocturno (véase el paso 2.1) en 25 mL de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 ml. Antes de transferir las células al matraz, la densidad celular del cultivo nocturno debe ajustarse en medio LB fresco modificado para obtener OD600 = 0,5.
  2. Añadir 25 μL de solución madre de OFX (5 mg/mL) en la suspensión celular y agitar suavemente el matraz para que el cultivo ensay sea homogéneo. La concentración final de OFX es de 5 μg/mL en el cultivo de ensayo.
  3. Incubar el cultivo de ensayo en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C.
  4. En cada hora durante el tratamiento (incluyendo 0 h, el punto de tiempo antes de agregar OFX en el cultivo de ensayo), transfiera 1 mL del cultivo de ensayo desde el matraz a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  5. Centrífuga el cultivo de ensayo en el tubo de microcentrífuga a 17.000 x g durante 3 min.
  6. Retire cuidadosamente 950 μL del sobrenadante sin alterar el pellet celular.
  7. Añadir 950 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en el tubo de microcentrífuga.
  8. Repita los pasos de lavado 3.5-3.7 por 3x en total hasta que la concentración de antibióticos esté por debajo de la concentración inhibitoria mínima (MIC).
  9. Después del lavado final, resuspend el pellet celular en 100 μL de solución de PBS, resultando en una muestra concentrada 10x.
  10. Tomar 10 μL de la suspensión celular y diluir en serie seis veces en 90 μL de solución de PBS usando una placa inferior redonda de 96 pozos.
  11. Detecte 10 μL de suspensiones de células diluidas en placas de agar fresco sin antibióticos. Para aumentar el límite de detección, platee los 90 μL restantes de suspensión celular en una placa de agar fresco.
  12. Incubar las placas de agar a 37 °C durante 16 h, y luego contar las unidades formadoras de colonias (UFC). Tenga en cuenta las tasas de dilución mientras calcula el número total de UFC en 1 mL de cultivo de ensayo. Las curvas de muerte se generan trazando los valores logarítmicos de UFC con respecto a la duración del tratamiento con antibióticos.
    NOTA: Un tratamiento ofx de 6 h es suficiente para obtener una curva de muerte bifásica para las células de E. coli 19,20. El nivel persistente de células propagadas (según lo medido por las cuentas de CFU en 6 h) debe ser perceptiblemente menos que el de la cultura de noche. Los procedimientos descritos en los Protocolos 2 y 3 se pueden realizar con LB regular dependiendo del diseño de la investigación.

4. Cribados de placas de microarrays

  1. Preparación de cultivos celulares de microarrays
    1. Transferir 250 μL de células en fase exponencial a 25 mL de medio LB fresco modificado en un tubo centrífugo de 50 mL. Mezcle suavemente la suspensión celular para hacerla homogénea.
      NOTA: Las celdas de fase exponencial (OD600 = 0.5) se obtienen a partir del segundo paso de propagación (ver paso 2.3).
    2. Transfiera la suspensión de la célula diluida a un depósito estéril de 50 mL.
    3. Usando una pipeta multicanal, transfiera 150 μL de la suspensión celular a cada pozo de un microarray, es decir, una placa de 96 pozos que contiene varios osmolitos.
      NOTA: Los pozos que no tienen osmolitos sirven como controles.
    4. Cubra el microarray con una membrana de sellado permeable al gas.
    5. Incubar la placa en una coctelera orbital a 37 °C y 250 rpm durante 24 h.
      NOTA: En estos experimentos, se utilizaron placas disponibles en el mercado, como los microarrays de fenotipo (PM-9 y PM-10) que incluyen una amplia gama de osmolitos, tampones de pH y otros productos químicos en un estado seco a diversas concentraciones. Estos microarrays están en formatos de placa de medio área 96 pozos. Los volúmenes de cultivo deben ajustarse en función del tipo de placas que se utilicen. Los microarrays también se pueden generar manualmente (ver más abajo).
  2. Preparación manual de placas de microarrays
    1. Transfiera 75 μL de 2x soluciones de osmolito a los pozos de una placa de medio área de 96 pozos.
    2. Transferir 500 μL de células en fase exponencial a 25 mL de medio LB modificado 2x en un tubo centrífugo de 50 mL. Mezcle suavemente la suspensión celular para hacerla homogénea.
      NOTA: La tasa de inoculación se ajustó para ser consistente con el protocolo de cribado de microarrays descrito en 4.1.
    3. Añadir 75 μL de la suspensión celular en cada pozo de la placa de medio área 96 pozos que contiene 2x soluciones de osmolito.
    4. Incubar la placa en una coctelera orbital a 37 °C y 250 rpm durante 24 h.
  3. Preparación de placas de ensayo persistentes
    1. Preparar 25 mL de medio LB modificado que contenga 5 μg/mL de OFX en un tubo centrífugo de 50 mL y transferir este medio a un depósito estéril.
    2. Transferir 190 μL de medio LB modificado con OFX desde el depósito a cada pozo de una placa genérica de fondo plano de 96 pozos (placa de ensayo persistente) utilizando una pipeta multicanal.
    3. Retire el microarray de la coctelera (después de cultivar durante 24 h) y transfiera 10 μL de cultivos celulares del microarray a los pozos de la placa de ensayo persistente, que contiene el medio LB modificado con OFX.
    4. Tome 10 μL de suspensiones celulares de la placa de ensayo persistente y diluya en serie tres veces en 290 μL de solución de PBS utilizando una placa de 96 pozos de fondo redondo y una pipeta multicanal.
    5. Después de la dilución en serie, detecte 10 μL de todas las suspensiones celulares diluidas en serie en placas de agar fresco sin antibióticos utilizando una pipeta multicanal.
    6. Incubar la placa de ensayo persistente (preparada en el paso 4.3.3) en una coctelera orbital a 37 °C y 250 rpm durante 6 h después de cubrir la placa con una membrana de sellado permeable al gas.
    7. Después de la incubación de 6 h en una coctelera, saque la placa de ensayo persistente y repita los pasos 4.3.4-4.3.5.
    8. Incubar las placas de agar durante 16 h a 37 °C, y luego contar las UFC. Los niveles de UFC antes y 6 h después del tratamiento antibiótico permiten calcular la fracción persistente en cada pozo. Los recuentos de UFC antes del tratamiento con OFX también ayudan a evaluar los efectos de los osmolitos y sobre la viabilidad de E. coli.

5. Validación de las condiciones identificadas

  1. Transferir 250 μL de las células de fase exponencial del paso 2,3 a 25 mL de medio LB fresco modificado que contiene el osmlito identificado a partir del cribado de microarrays (ver Protocolo 4).
  2. Incubar el matraz en una coctelera orbital a 250 rpm y 37 °C durante 24 h.
  3. Después de 24 h, retire el matraz de la coctelera y transfiera 250 μL del cultivo celular a 25 mL de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 ml.
  4. Añadir 25 μL de solución madre de OFX (5 mg/mL) en la suspensión celular y agitar suavemente el matraz para que el cultivo ensay sea homogéneo. Incubar el matraz en una coctelera a 37 °C y 250 rpm.
  5. En cada hora durante el tratamiento, transfiera 1 mL del cultivo de ensayo desde el matraz a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  6. Centrífuga el cultivo de ensayo en el tubo de microcentrífuga a 17.000 x g durante 3 min.
  7. Retire 950 μL de sobrenadante y agregue 950 μL de PBS.
  8. Repita los pasos de lavado 5.6 y 5.7 para 3x.
  9. Después del lavado final, resuspend el pellet celular en 100 μL de solución de PBS.
  10. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya en serie 6x en 90 μL de solución de PBS usando una placa inferior redonda de 96 pozos.
  11. Detecte 10 μL de las suspensiones de células diluidas en una placa de agar fresco libre de antibióticos. Para aumentar el límite de detección, platee los 90 μL restantes de suspensión celular en una placa de agar fresco.
  12. Incubar la placa de agar a 37 °C durante 16 h, y luego contar las UFC.

Resultados

La Figura 1 describe nuestro protocolo experimental. Los experimentos del ciclo de dilución/crecimiento (ver Protocolo 2) fueron adaptados de un estudio realizado por Keren et al.5 para eliminar los persistidores originarios de los cultivos nocturnos. La Figura 2A es una imagen representativa de las placas de agar utilizadas para determinar los niveles de UFC de los cultivos celulares antes y después del tratamiento con OFX. En estos ex...

Discusión

El ensayo persistente de alto rendimiento descrito aquí se desarrolló para dilucidar los efectos de varios productos químicos sobre la persistencia de E. coli. Además de las placas PM comerciales, los microarrays se pueden construir manualmente como se describe en el paso 4.2. Además, el protocolo presentado aquí es flexible y se puede utilizar para examinar otros microarrays, como paneles de medicamentos y bibliotecas celulares, que están en formatos de placa de 96 pozos. Las condiciones experimentales, ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a los miembros de Orman Lab por sus valiosos aportes durante este estudio. Este estudio fue financiado por el premio de transición profesional K22AI125468 de los NIH/NIAID y una beca de inicio de la Universidad de Houston.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
14-ml test tubeFisher Scientific14-959-1B
E. coli strain MG1655Princeton UniversityObtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plateUSA Scientific5665-5161
Gas permeable sealing membraneVWR102097-058Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plateVWR82050-062
LB agarFisher ScientificBP1425-2Molecular genetics grade
Ofloxacin saltVWR103466-232HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)BiologN/APM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plateUSA Scientific5665-0161
Sodium chlorideFisher ScientificS271-500Certified ACS grade
Sodium nitrateFisher ScientificAC424345000ACS reagent grade
Sodium nitriteFisher ScientificAAA186680B98% purity
Square petri dishFisher ScientificFB0875711A
TryptoneFisher ScientificBP1421-500Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate readerThermo Fisher ScientificVLBL00D0Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extractFisher ScientificBP1422-100Molecular genetics grade

Referencias

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  2. Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
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