세균성 지속성에 미치는 영향을 밝히기 위해 화학 화합물의 높은 처리량 선별

요약

이 방법 논문에서, 우리는 세균성 지속성에 중대한 영향을 미치는 삼투병과 같은 화학 화합물을 확인하기 위하여 고처리량 검열 전략을 제시합니다.

초록

세균성 퍼시스터는 항생제의 고농도를 용인하는 기능을 가진 현상변이의 작은 하위 집단으로 정의됩니다. 그(것)들은 재발하는 만성 감염과 연관되었기 때문에 중요한 건강 관심사입니다. 스트레스 관련 메커니즘의 금욕적이고 결정적인 역학은 지속성에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있지만, 지속성 상태에서 페노티픽 스위치의 기본 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 환경 신호(예: 탄소, 질소 및 산소 소스의 고갈)에 의해 유발되는 지속성 요인이 광범위하게 연구되었지만, 지속성에 대한 삼투석의 영향은 아직 결정되지 않았습니다. 마이크로어레이(즉, 다양한 화학 물질을 함유한 96개의 웰 플레이트)를 사용하여, 우리는 높은 처리량 방식으로 대장균 지속성에 대한 다양한 삼투석의 효과를 해명하는 접근법을 설계했습니다. 이 접근법은 약물 패널 및 유전자 녹아웃 라이브러리와 같은 다른 스크리닝 어레이에 쉽게 적응할 수 있으므로 변형적입니다.

서문

세균성 배양은 항생제의 비정상적으로 높은 수준에 일시적으로 관대 하는 persister 세포의 작은 하위 인구를 포함. Persister 세포는 그들의 항생제 에 민감한 친척과 유전적으로 동일하고, 그들의 생존은 일시적인 성장 억제^1에기인했습니다. Persister 세포는 글래디스 취미^2에 의해 처음 발견되었지만, 용어는 그가 페니실린 처리 황색포도상구균 pyogenes 배양^3에서그(것)들을 확인했을 때 조셉 더 크에 의해 처음 이용되었습니다. 발라반 외^4에 의해 간행된 정액 연구 결과는 2개의 persister 모형을 찾아냈습니다: 정지단계를 통해 통과하여 주로 형성되는 타입 I 변이체, 및 기하급수적인 성장 도중 지속적으로 생성되는 타입 II 변종. Persisters는 항생제 치료 중 다양한 간격으로 배양 샘플을 채취하여 항생제가 없는 경우 식민지화 할 수있는 생존 세포를 계산하기 위해 전형적인 성장 매체에 도금되는 clonogenic 생존 분석서에 의해 검출됩니다. 세포 배양에서 persisters의 존재는 초기 기하급수성 부패가 항생제에 민감한 세포의 죽음을 나타내는 biphasic 킬 곡선^4,5에 의해 평가됩니다. 그러나, 살인 추세는 시간이 지남에 따라 감소, 결국 살아남은 persister 세포를 나타내는 고원 지역으로 이어지는.

퍼시스터 세포는 결핵^6,낭포성 섬유증^7,칸디다증⁸ 및 요로 감염^9와같은 다양한 질병과 관련이 있다. 지금까지 테스트된 거의 모든 미생물은 고병원성 진균결핵^6, 황색포도상구균^10, 슈도모나스 아에루기노사⁷ 및 칸디다 알비칸스^8을포함하여 퍼시스터 현상형을 생성하는 것으로 나타났다. 최근 연구는 또한 persister 하위 집단에서 다중 약물 내성 돌연변이의 상승의 증거를 제공합니다^11,12. 이 분야에서 상당한 노력은 지속성 메커니즘이 매우 복잡하고 다양하다는 것을 밝혔습니다. SOS^{응답(13,14,}반응성 산소 종(ROS)^15,독소/항독소(TA)^{시스템(16),}자가식 또는 자가소화(17) 및 ppGpp 관련 엄격한^{반응(18)과} 관련된 관면 및 결정적 인자 모두 관음 형성을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다.

지속성 표현형을 이해하는 중요한 진전에도 불구하고, 세균성 지속성에 대한 삼투병의 효력은 완전히 이해되지 않았습니다. 최적의 삼투압의 유지는 세포의 성장, 적절한 기능 및 생존에 필요한 이유이기 때문에 삼투석에 대한 심층연구는 반퍼 자매 전략에 대한 잠재적 인 대상으로 이어질 수 있습니다. 힘들지만, 고처리량 스크리닝은^19,20에서중요한 역할을 하는 대사 산물 및 기타 화학 물질을 식별하기 위한 매우 효과적인 접근법이다. 이 작품에서는, 우리는 우리가 마이크로 어레이를 사용한 우리의 간행된 방법^19,즉, 96 각종 삼투엽소를 포함하는 96 개의 잘 플레이트 (예를 들어, 염화나트륨, 우레아, 아질산나트륨, 나트륨 아질산염, 칼륨 염화) 대장균 지속성에 현저하게 영향을 미치는 osmolytes를 규명하기 위하여 토론할 것입니다.

프로토콜

1. 성장 배지, 용액 및 대장균 세포 주식의 준비

1. 일반 Luria-Bertani (LB) 매체: 트라이프톤 10 g/L, 염화 나트륨 10g/L(NaCl) 및 5g/L의 효모 추출물을 탈온화(DI) 물에 넣습니다. 자동 적으로 매체를 살균합니다.
2. LB 한천 플레이트: 트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 효모 추출물 5g/L, DI 물에 15g/L 천사를 넣고 오토클레이빙으로 배지를 살균합니다. 원하는 온도(~55°C)에서 천배지의 ~30mL를 정사각형 플레이트(10 x 10cm)에 붓습니다. 접시를 말리고 4 °C에서 보관하십시오.
3. 수정된 LB 매체: DI 물에 트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L을 추가합니다. 자동 적으로 매체를 살균합니다.
4. 삼투압을 포함한 수정된 LB 배지: 2x 변형된 LB 배지를 동일한 볼륨으로 2배 의 osmolyte 용액으로 혼합합니다. 2x 변형 된 LB 매체를 준비하려면 DI 물에 20 g /L의 트립톤과 효모 추출물 10 g /L을 추가하고 오토클레이빙으로 살균하십시오. 2x osmolyte 용액을 준비하려면 DI 수에서 관심있는 삼투리테 (2배)를 용인한 다음 용액을 살균합니다.
   참고: 관심의 삼투압과 그 농도는 표현형 마이크로어레이 스크리닝 분석서에서 결정될 수 있다(프로토콜 4 참조). 그러나, 시험된 삼투석 및 관련 2x 농도는 연구의 특성에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 염화 나트륨 1m의 영향을 연구하기 위해 2x osmolyte 용액은 2mM 염화 나트륨 용액이 될 것입니다.
5. Ofloxacin 재고 용액 (5 mg / mL): 디 워터 1 mL에 5 mg의 ofloxacin (OFX) 소금을 넣습니다. 10M 수산화 나트륨의 10 μL을 추가하여 물 속에서 OFX의 용해도를 높이고 용액을 살균하는 필터를 넣습니다. 알리쿼트 준비 및 -20 °C에서 저장합니다.
   참고: Ofloxacin은 성장 및 비성장^{세균세포(14,21)}모두에 널리 사용되는 퀴놀론 항생제이다. 대장균 MG1655 세포에 대한 OFX의 최소 억제 농도(MIC)는 0.039-0.078 μg/mL^19,20의범위 내에 있다. 또한 암피실린과 카나마이신과 같은 다른 항생제는 일반적으로 persister 연구에서 사용됩니다. 항생제의 선택은 연구 결과의 본질에 달려 있습니다.
6. 대장균 MG1655 세포 주: 14mL 시험관(snap-capped)에서 단일 콜로니를 가진 일반 LB 배지의 접종 2mL및 250rpm 및 37°C에서 궤도 셰이커에서 세포를 배양한다. 세포가 고정 된 상에 도달하면, 셀 배양의 500 μL을 500 μL의 500 μL과 50 % 글리세롤 (멸균)을 저온 성 유리병에 혼합하고 -80 °C에 저장하십시오.

2. 기존의 퍼시스터를 제거하기 위해 세포의 전파

1. 야간 배양을 준비하기 위해, 멸균 파이펫 팁(글리세롤 셀 스톡을 해동하지 않음)으로 냉동 셀 스톡으로부터 소량의 세포를 긁어내고, 14mL 스냅 캡 테스트 튜브에서 변형된 LB 배지의 2mL에서 세포를 접종한다. 12h에 대해 250 rpm 및 37°C에서 궤도 셰이커에서 세포를 배양한다.
2. 첫 번째 전파
   1. 12h 후, 멸균 알루미늄 호일로 덮인 250mL 의 당황 플라스크에서 25mL의 신선한 변형 LB 배지25mL로 야간 배양 250 μL을 전송한다.
   2. 세포가 중간 지수 상에 도달할 때까지 250 rpm 및 37°C에서 궤도 셰이커에서 세포 배양을 성장시다(OD₆₀₀ = 0.5).
   3. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 600nm(OD_600)에서광학 밀도를 측정합니다.
3. 두 번째 전파
   1. OD₆₀₀ = 0.5에서, 250mL 당황 플라스크에서 250mL의 신선한 변형 LB 배지의 25mL로 첫 번째 플라스크에서 세포 배양의 250 μL을 희석시킨다.
   2. OD₆₀₀=0.5까지 250 rpm 및 37°C에서 궤도 셰이커에서 제2 세포 배양을 성장시다.
   3. 30분마다 광학 밀도를 측정합니다.
      참고: 야간 배양은 상당한 양의 세포세포를 가질 수 있다^4,5,22. 전술한 희석/성장 주기 방법^5는 세포를 마이크로어레이로 옮기기 전에 이러한 기존 퍼시스터를 제거하는 데 사용될 수 있다. 이들의 제거는 프로토콜 3에 설명된 분석으로 하룻밤 문화의 인시더 수준을 정량화하여 검증될 수 있다. 이 메서드는 이전 스터디^19에서이미 유효성을 검사했습니다.

3. 기존 퍼시누이 세포의 제거 유효성 검사

1. 제2 전파 후(단계 2.3 참조), 250mL의 신선한 변형 LB 배지의 25mL에서 세포 배양(OD₆₀₀ = 0.5)의 250 μL을 250mL의 pask를 희석시킨다.
   참고: 컨트롤의 경우 250mL 당황한 플라스크에서 25mL의 신선한 변형 LB 배지에서 25mL의 야간 배양(단계 2.1 참조)을 희석합니다. 플라스크로 세포를 전송하기 전에, 하룻밤 배양의 세포 밀도는 OD₆₀₀ = 0.5를 얻기 위해 신선한 변형 된 LB 배지로 조정되어야한다.
2. OFX 스톡 용액(5 mg/mL)의 25μL을 셀 서스펜션에 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 분석 배양을 균일하게 만듭니다. OFX의 최종 농도는 분석 문화에서 5 μg/mL입니다.
3. 250 rpm 및 37°C에서 궤도 셰이커에서 분석 문화를 배양합니다.
4. 치료 중 매 시간마다(0h 포함, 분석 문화에 OFX를 추가하기 전에 시간 지점), 플라스크에서 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 분석 문화의 1 mL를 전송한다.
5. 3 분 동안 17,000 x g에서 미세 원심 분리기 튜브의 분석 문화를 원심 분리합니다.
6. 셀 펠릿을 방해하지 않고 상퍼의 950 μL을 조심스럽게 제거하십시오.
7. 미산염 완충식식염(PBS) 용액950μL을 미세원심분리기 튜브에 넣습니다.
8. 항생제 농도가 최소 억제 농도(MIC) 이하일 때까지 총 3배-3배의 세척 단계를 반복한다.
9. 최종 세척 후, PBS 용액의 100 μL에서 세포 펠릿을 다시 분리하여 10배 농축 시료를 생성합니다.
10. 셀 서스펜션의 10 μL을 복용하고 96 개의 잘 둥근 바닥 플레이트를 사용하여 PBS 용액의 90 μL에서 6 번 연속적으로 희석하십시오.
11. 항생제없는 신선한 한천 접시에 희석 된 세포 현탁액의 10 μL을 발견하십시오. 검출 한계를 높이기 위해, 신선한 한천 판에 나머지 90 μL의 셀 서스펜션을 플레이트.
12. 16h에 대해 37°C에서 한천 판을 배양한 다음 콜로니 형성 유닛(CFU)을 계산합니다. 분석 문화 1mL에서 총 CfU 수를 계산하는 동안 희석률을 고려합니다. 킬 커브는 항생제 치료 기간과 관련하여 로그산학 CFU 값을 플로팅하여 생성됩니다.
    참고: 6h OFX 치료는 대장균 세포^19,20에대한 이중축 킬 곡선을 얻기에 충분하다. 전파된 세포의 인시누이 수준(CFU 카운트 6h로 측정)은 하룻밤 배양보다 현저히 적어야 합니다. 프로토콜 2 및 3에 기재된 절차는 연구 설계에 따라 일반 LB로 수행할 수 있다.

4. 마이크로어레이 플레이트 스크리닝

1. 마이크로어레이 세포 배양 준비
   1. 50mL 원심분리기 튜브에서 25mL의 신선한 변형 LB 배지로 250 μL의 기하급수체 상세포를 이송한다. 셀 서스펜션을 부드럽게 혼합하여 균일하게 만듭니다.
      참고: 지수상 세포(OD₆₀₀ = 0.5)는 제2 전파 단계에서 얻어진다(단계 2.3 참조).
   2. 희석된 세포 현탁액을 멸균 50mL 저수지로 옮기다.
   3. 멀티채널 파이펫을 사용하여, 셀 현탁액의 150 μL을 마이크로어레이의 각 웰, 즉 다양한 삼투리테를 포함하는 96개의 웰 플레이트로 이송한다.
      참고: 삼투압이 없는 우물은 컨트롤역할을 합니다.
   4. 가스 투과성 밀봉 멤브레인으로 마이크로어레이를 덮습니다.
   5. 플레이트를 37°C, 250rpm에서 24시간 동안 궤도 셰이커에 배양한다.
      참고: 이러한 실험에서, 다양한 농도에서 건조 된 상태에서 다양한 양의 삼투석, pH 버퍼 및 기타 화학 물질의 넓은 범위를 포함하는 표현형 마이크로 어레이 (PM-9 및 PM-10)와 같은 시판 가능한 플레이트가 사용되었습니다. 이러한 마이크로 어레이는 하프 영역 96 웰 플레이트 형식으로 되어 있습니다. 배양 볼륨은 사용되는 플레이트유형에 따라 조정되어야 합니다. 마이크로 어레이는 수동으로 생성할 수도 있습니다(아래 참조).
2. 마이크로어레이 플레이트의 수동 준비
   1. 2x osmolyte 용액 75μL을 하프 영역 96 웰 플레이트의 우물로 옮긴다.
   2. 50mL 원심분리기 튜브에서 2x 변형 LB 배지의 25mL로 지수 상 세포 500 μL을 전달한다. 셀 서스펜션을 부드럽게 혼합하여 균일하게 만듭니다.
      참고: 접종 비율은 4.1에 기재된 마이크로어레이 스크리닝 프로토콜과 일치하도록 조정되었다.
   3. 2배 osmolyte 용액을 함유한 반면적 96웰 플레이트의 각 웰에 셀 서스펜션75μL을 추가합니다.
   4. 플레이트를 37°C, 250rpm에서 24시간 동안 궤도 셰이커에 배양한다.
3. 어누이 분석 플레이트 준비
   1. 50mL 원심분리기 튜브에 OFX의 5 μg/mL을 함유한 수정된 LB 배지 25mL을 준비하고 이 매체를 멸균 저수지로 이송한다.
   2. 190 μL의 변형된 LB 배지를 저수지에서 각 우물로 옮기는 일반 플랫-하텀 96 웰 플레이트(persister-assay plate)를 멀티채널 파이펫을 사용한다.
   3. 셰이커에서 마이크로어레이를 제거하고(24시간 동안 배양한 후) 마이크로어레이에서 PERsister-assay 플레이트의 우물로 세포 배양 10 μL을 전송하여 OFX를 사용하여 수정된 LB 배지를 함유한다.
   4. 퍼시누이 분석 플레이트에서 셀 서스펜션 10μL을 복용하고 라운드 하부 96 웰 플레이트와 멀티 채널 파이펫을 사용하여 PBS 용액의 290 μL에서 세 번 연속적으로 희석하십시오.
   5. 직렬 희석에 따라 다중 채널 파이펫을 사용하여 항생제 가없는 신선한 한천 플레이트에 모든 직렬 희석 된 세포 현탁액의 10 μL을 발견하십시오.
   6. 퍼시스터-분석 플레이트(4.3단계에서 제조)를 37°C에서 궤도 셰이커에, 250rpm에서 가스 투과성 밀봉 막을 장착한 후 6시간 동안 250rpm으로 배양한다.
   7. 쉐이커에서 6시간 동안 잠복한 후, 퍼시자매-분석 판을 꺼내 4.3.4-4.3.5단계를 반복한다.
   8. 37°C에서 16h의 천판을 배양한 다음 CfU를 계산합니다. 항생제 치료 전후 6시간 전과 6시간 의 CFU 수준은 각 우물에서 퍼시누의 분획을 계산할 수 있게 한다. CFU는 OFX 처리의 앞에 또한 삼투석및 대장균 생존가능성에 의하여 효력을 평가하는 것을 돕습니다.

5. 확인된 조건 의 유효성 검사

1. 마이크로어레이 스크리닝에서 확인된 삼투압을 함유하는 신선한 변형 LB 배지의 2.3~25mL 단계로부터 지수상 세포의 250 μL을 전송한다(프로토콜 4 참조).
2. 플라스크를 250rpm및 37°C에서 24시간 동안 궤도 셰이커에 배양한다.
3. 24시간 후, 셰이커로부터 플라스크를 제거하고 250mL의 플래스크에서 250mL의 신선한 변형 LB 배지로 세포 배양의 250 μL을 이송한다.
4. 세포 현탁액에 OFX 스톡 용액(5 mg/mL)의 25μL을 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 분석 배양을 균질하게 만듭니다. 37°C 및 250 rpm에서 셰이커에 플라스크를 배양합니다.
5. 치료 중 매 시간마다 플라스크에서 1.5 mL 미세 센세리분리기 튜브로 분석 문화의 1 mL을 전송합니다.
6. 3 분 동안 17,000 x g에서 미세 원심 분리기 튜브의 분석 문화를 원심 분리합니다.
7. 950 μL의 상체를 제거하고 PBS의 950 μL을 추가합니다.
8. 3x에 대해 5.6 및 5.7 단계를 반복하십시오.
9. 최종 세척 후, PBS 용액의 100 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
10. 셀 서스펜션의 10 μL을 복용하고 96 개의 잘 둥근 바닥 플레이트를 사용하여 PBS 용액의 90 μL에서 6 배연속 희석하십시오.
11. 항생제없는 신선한 한천 접시에 희석 된 세포 현탁액의 10 μL을 반점하십시오. 검출 한계를 높이기 위해, 신선한 한천 판에 나머지 90 μL의 셀 서스펜션을 플레이트.
12. 16h에 대해 37°C에서 한천 판을 배양한 다음 CFU를 계산합니다.

결과

그림 1은 실험 프로토콜을 설명합니다. 희석/성장 주기 실험(프로토콜 2 참조)은 케렌 외^5가 실시한 연구에서 하룻밤 문화에서 유래한 퍼시스터를 제거하기 위해 조정하였다. 도 2A는 OFX 치료 전후세포 배양의 CFU 수준을 결정하는 데 사용되는 한천 플레이트의 대표적인 이미지이다. 이러한 실험에서, 세포는 4.2단계에서 설명된 바와 같?...

토론

여기에 설명된 높은 처리량 퍼시스터 분석은 대장균 지속성에 대한 다양한 화학 물질의 효과를 해명하기 위해 개발되었다. 상용 PM 플레이트 외에도 마이크로어레이는 4.2 단계에서 설명된 대로 수동으로 시공할 수 있습니다. 더욱이, 여기에 제시된 프로토콜은 유연하고 96개의 웰 플레이트 형식으로 약물 패널 및 세포 라이브러리와 같은 다른 마이크로어레이를 선별하는 데 사용될 수 있다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-ml test tube	Fisher Scientific	14-959-1B
E. coli strain MG1655	Princeton University		Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate	USA Scientific	5665-5161
Gas permeable sealing membrane	VWR	102097-058	Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate	VWR	82050-062
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Molecular genetics grade
Ofloxacin salt	VWR	103466-232	HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)	Biolog	N/A	PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate	USA Scientific	5665-0161
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500	Certified ACS grade
Sodium nitrate	Fisher Scientific	AC424345000	ACS reagent grade
Sodium nitrite	Fisher Scientific	AAA186680B	98% purity
Square petri dish	Fisher Scientific	FB0875711A
Tryptone	Fisher Scientific	BP1421-500	Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0	Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-100	Molecular genetics grade