細菌の持続性に及ぼす影響を解明するための化学化合物のハイスループットスクリーニング

要約

本方法論文では、細菌の持続性に大きな影響を与える浸透性物質などの化合物を同定するためのハイスループットスクリーニング戦略を紹介する。

要約

細菌のパーシスターは、高濃度の抗生物質を容認する能力を有する表現型変異体の小さな亜集団として定義される。彼らは再発性慢性感染症に関連付けられているので、彼らは重要な健康上の懸念です。ストレス関連機構の確率的かつ決定論的なダイナミクスは持続性において重要な役割を果たしていることが知られているが、持続性状態との間でのフェロティピック切り替えの根底にあるメカニズムは完全には理解されていない。環境シグナルによって引き起こされる持続性因子(例えば、炭素、窒素、酸素源の枯渇)は広範囲に研究されているが、浸透性に及ぼす浸透率は未だ決定されていない。マイクロアレイ(すなわち、様々な化学物質を含む96ウェルプレート)を用いて、様々な浸透量体が 大腸菌 持続性に及ぼす影響を高スループットで解明するアプローチを設計しました。このアプローチは、薬物パネルや遺伝子ノックアウトライブラリなどの他のスクリーニングアレイに容易に適応できるため、変革的です。

概要

細菌培養は、異常に高いレベルの抗生物質に対して一時的に耐性があるパーシスター細胞の小さな亜集団を含む。パーシスター細胞は、抗生物質感受性の親族と遺伝的に同一であり、その生存は一過性の増殖阻害に起因する^1。パーシスター細胞はグラディスホビー²によって最初に発見されたが、ペニシリン処理ブドウ球菌培養³でそれらを同定したときにジョセフ・ビガーによって最初に使用された。Balabanら⁴が発表した精巧な研究では、主に定常相を通過して形成されるタイプI変異体と、指数成長の間に連続的に生成されるII型の2つのパーシスタータイプが発見された。パーシスターは、抗生物質治療中に様々な間隔で培養サンプルを採取し、洗浄し、典型的な成長培地上でメッキし、抗生物質の不在時にコロニー形成できる生き残った細胞を数えるクロノジェニック生存アッセイによって検出される。細胞培養におけるパーシスターの存在は、初期指数崩壊が抗生物質感受性細胞の死を示す二額殺し曲線^4、5によって評価される。しかし、殺死傾向は時間の経過とともに減少し、最終的には生き残ったパーシスター細胞を表す高原領域につながる。

パーシスター細胞は、結核^6、嚢胞性線維症^7、カンジダ症⁸および尿路感染症⁹などの様々な疾患に関連している。これまでに試験されたほとんどすべての微生物が、結核菌の高病原性抗酸菌^6、黄色ブドウ球^菌10、緑膿菌⁷およびカンジダ・アルビカンス⁸を含むパーシスター表現型を生成することが判明した。最近の研究はまた、パーシスター亜集団^11、12からの多剤耐性変異体の上昇の証拠を提供する。この分野での多くの努力は、持続性メカニズムが非常に複雑で多様であることを明らかにしました。SOS応答^13、14、活性酸素種(ROS)15、毒素/抗毒素(TA)系^16、オートファジーまたは自己消化¹⁷およびppGpp関連ストリンジェント応答¹⁸に関連する確率的および決定的因子の両方が、パーシスター形成を促進することが知られている。

持続性表現型の理解において有意な進歩を遂げたにもかかわらず、浸透性の細菌性持続性に及ぼす影響は十分に理解されていない。最適な浸透圧の維持は細胞の成長、適切な機能および生存のために必要であるため、浸透圧の詳細な研究は、抗姉妹戦略の潜在的な標的につながる可能性がある。面倒な、ハイスループットスクリーニングは、持続性表現型^19、20において重要な役割を果たす代謝産物および他の化学物質を同定するための非常に効果的なアプローチである。本研究では、マイクロアレイ、すなわち、各種浸透量体(例えば、塩化ナトリウム、尿素、亜硝酸ナトリウム、塩化カリウム)を含む96個のウェルプレートを用いた、大腸菌の持続性に大きな影響を与える浸透性を同定する方法¹⁹を紹介する。

プロトコル

1. 成長培地、フロキサシン溶液、 大腸菌 細胞株の調製

1. 通常のルリア・ベルタニ(LB)培地:トリプトン10g/L、塩化ナトリウム10g/L(NaCl)、酵母エキス5g/Lを脱イオン化(DI)水に添加します。オートクレーブ処理で培地を殺菌する。
2. LB寒天プレート:トリプトン10g/L、NaCl10g/L、酵母エキス5g/L、DI水中15g/L寒天を加え、オートクレーブ処理で培地を殺菌します。所望の温度(〜55°C)で、寒天培地の30mLを正方形のプレート(10 x 10cm)に注ぎます。プレートを乾かして4°Cで保管してください。
3. 変性LB培地:トリプトン10g/Lと5gの酵母エキスをDI水に加えます。オートクレーブ処理で培地を殺菌する。
4. 変性LB培地(浸透量を含む):2倍の変性LB培地と2倍の浸透量溶液を同量で混合する。2倍の変性LB培地を調製するには、トリプトン20g/Lと10gの酵母エキスをDI水中に加え、オートクレーブ処理で殺菌します。2x浸透液溶液を調製するには、目的の浸透量(2倍量)をDI水に溶解し、次いで溶液を殺菌してフィルター処理します。
   注:目的の浸透量とその濃度は、表現型マイクロアレイスクリーニングアッセイ(プロトコル4を参照)から決定することができます。しかし、試験済み浸透量および関連する2倍濃度は、研究の性質に応じて調整することができる。例えば、1 mMの塩化ナトリウムの影響を調べるために、2xの浸透液溶液は2mMの塩化ナトリウム溶液となる。
5. Ofloキサシンストック溶液(5 mg/mL):1mLのDI水に5mgのオフロキサシン(OFX)塩を加えます。10 M水酸化ナトリウム10μLを加えて、水中のOFXの溶解度を高め、次いで溶液を殺菌してフィルターします。アリコートを用意し、-20°Cで保管してください。
   注:Ofloキサシンは、成長し、非成長細菌細胞^14、21の両方に広く使用されているキノロン抗生物質です。大腸菌MG1655細胞のOFXの最小阻害濃度(MIC)は、0.039〜0.078 μg/mL^19,20の範囲内である。また、アンピシリンやカナマイシンなどの他の抗生物質は、一般的にパーシスター研究で使用されることに注意してください。抗生物質の選択は、研究の性質に依存します。
6. 大腸菌 MG1655細胞株:14mL試験管(スナップキャップ)に単一コロニーを有する通常LB培地2mLを接種し、250rpmおよび37°Cで軌道シェーカー中の細胞を培養する。 細胞が定常相に達したら、細胞培養500μLを500μLのグリセロール(無菌)を極低温バイアルに混ぜ、-80°Cで保存します。

2. 既存のパーシスターを排除する細胞の伝播

1. 一晩培養を調製するために、凍結した細胞ストックから少量の細胞を無菌ピペットチップ(グリセロール細胞ストックを解凍しない)で掻き取り、14mLスナップキャップ試験管内の2mLの改変LB培地中の細胞を接種する。250 rpmで軌道シェーカー中の細胞を培養し、37°Cで12時間培養します。
2. 最初の伝播
   1. 12時間後、滅菌アルミニウム箔で覆われた250mLのバッフルフラスコで25mLの新鮮な改変LB培地に一晩培養250 μLを移す。
   2. 細胞が指数位中相(OD₆₀₀ = 0.5)に達するまで、250 rpmおよび37°Cで軌道シェーカーで細胞培養を成長させます。
   3. マイクロプレートリーダーを30分ごとに使用して、光密度を600 nm(OD₆₀₀₎で測定します。
3. 2 番目の伝播
   1. OD₆₀₀₌ 0.5で、250 mLバッフルフラスコ中のフレッシュ改質LB培地の25mLに第1フラスコから細胞培養の250 μLを希釈した。
   2. 250 rpm で軌道シェーカーの 2 番目の細胞培養を、OD₆₀₀=0.5 まで 37 °C 成長させます。
   3. 光学密度を30分ごとに測定します。
      注: 一晩培養すると^{、4、5、22}個のパーシスター^セルが大量に含まれる場合があります。上記の希釈/増殖サイクル法⁵は、細胞をマイクロアレイに移す前に、これらの既存のパーシスターを排除するために使用することができる。それらの排除は、プロトコル3に記載されているアッセイを用いて、一晩培養のパーシスターレベルを定量化することによって検証することができる。この方法は、以前の研究ですでに検証されています¹⁹.

3. 既存のパーシスター細胞の排除の検証

1. 第2の伝播(ステップ2.3を参照)の後、250 mLバッフルフラスコ中の25mLの新鮮な改変LB培地中の細胞培養(OD₆₀₀ = 0.5)の250 μLを希釈した。
   注:コントロールの場合、250 mLバッフルフラスコに25mLのフレッシュ改変LB培地を25 mLで一晩培養(ステップ2.1を参照)の250 μLを希釈します。フラスコに細胞を移す前に、一晩培養した細胞密度を_、OD600=0.5 を得るために新たに改変したLB培地で調整すべきである。
2. 25 μLのOFXストック溶液(5 mg/mL)を細胞懸濁液に加え、フラスコを軽く振って、アッセイ培養を均質にします。OFXの最終濃度はアッセイ培養で5μg/mLです。
3. 250 rpm および 37 °C で軌道シェーカーにアッセイ培養をインキュベートします。
4. 治療中の1時間ごとに(0時間、OFXをアッセイ培養に添加する前の時点を含む)、フラスコから1.5mLマイクロ遠心チューブにアッセイ培養液の1mLを移す。
5. マイクロ遠心分離管内のアッセイ培養物を17,000xgで3分間遠心分離する。
6. 細胞ペレットを乱さずに上清の950μLを慎重に除去します。
7. 950 μL のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液をマイクロ遠心分離管に加えます。
8. 抗生物質濃度が最小阻害濃度(MIC)を下回るまで、合計で3倍の洗浄ステップ3.5〜3.7を繰り返します。
9. 最終洗浄後、細胞ペレットを100 μLのPBS溶液に再懸濁し、10倍の濃縮試料を得ます。
10. 細胞懸濁液を10μLとし、96ウェルラウンドボトムプレートを使用して90 μLのPBS溶液で6回連続希釈します。
11. 抗生物質を含まない新鮮な寒天プレートに希釈細胞懸濁液の10 μLをスポットします。検出の限界を高めるには、新鮮な寒天プレートに残りの90μLの細胞懸濁液をプレートします。
12. 寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートし、コロニー形成ユニット(CFUs)を数えます。アッセイ培養の1mLにおけるCFUsの総数を計算しながら希釈率を考慮する。殺し曲線は、抗生物質治療の持続時間に関して対数CFU値をプロットすることによって生成される。
    注:6時間OFX治療は、大腸菌細胞^19、20の二倍化キル曲線を得るのに十分です。伝播された細胞のパーシスターレベル(6時間でCFUカウントで測定)は、一晩培養のそれよりも有意に少なくすべきである。プロトコル 2 および 3 で説明されている手順は、研究の設計に応じて通常の LB で実行できます。

4. マイクロアレイプレートスクリーニング

1. マイクロアレイ細胞培養の準備
   1. 指数相細胞250μLを、50 mL遠心チューブで25mLの新しい改変LB培地に移します。細胞懸濁液を軽く混ぜて均質にします。
      注: 指数位相セル (OD₆₀₀ = 0.5) は、第 2 の伝搬ステップ (ステップ 2.3 を参照) から取得されます。
   2. 希釈した細胞懸濁液を無菌50 mLリザーバに移します。
   3. マルチチャネルピペットを用いて、150μLの細胞懸濁液をマイクロアレイの各ウェル、すなわち、様々な浸透量体を含む96ウェルプレートに移す。
      注: 浸透性を持たないウェルはコントロールとして機能します。
   4. マイクロアレイをガス透過性シール膜で覆います。
   5. プレートを37°Cで軌道シェーカーにインキュベートし、24時間250rpmでインキュベートします。
      注:これらの実験では、様々な濃度で乾燥状態で広範囲の浸透性、pHバッファーおよび他の化学物質を含むフェノタイプマイクロアレイ(PM-9およびPM-10)などの市販のプレートを使用しました。これらのマイクロアレイは、ハーフエリア96ウェルプレートフォーマットです。使用するプレートの種類に応じて、培養量を調整する必要があります。マイクロアレイは手動で生成することもできます(下記参照)。
2. マイクロアレイプレートの手動準備
   1. 75 μLの2x浸透液溶液をハーフエリア96ウェルプレートのウェルに移します。
   2. 指数相細胞500μLを、50 mL遠心チューブ内の2x改変LB培地25 mLに移します。細胞懸濁液を軽く混ぜて均質にします。
      注: 接種速度は、4.1で説明したマイクロアレイスクリーニングプロトコルと一致するように調整されました。
   3. 2x浸透液を含むハーフエリア96ウェルプレートの各ウェルに75μLの細胞懸濁液を加えます。
   4. プレートを37°Cで軌道シェーカーにインキュベートし、24時間250rpmでインキュベートします。
3. パーシスターアッセイプレートの準備
   1. 50 mL遠心分離管に5μg/mLのOFXを含む25mLの改変LB培地を調製し、滅菌貯留槽にこの培地を移します。
   2. 190 μLの修正されたLB培地を、多流ピペットを使用して、リザーバからOFXを用いて、一般的なフラットボトム96ウェルプレート(パーシスターアッセイプレート)の各ウェルに移します。
   3. シェーカーからマイクロアレイを取り除き(24時間培養した後)、10μLの細胞培養物をマイクロアレイからパーシスターアッセイプレートのウェルに移し、OFXを用いて改質したLB培地を含む。
   4. パーシスターアッセイプレートから10μLの細胞懸濁液を取り、ラウンドボトム96ウェルプレートとマルチチャンネルピペットを使用して、PBS溶液290 μLで3回連続希釈します。
   5. 連続希釈に続いて、マルチチャネルピペットを使用して、抗生物質を含まない新鮮な寒天プレート上のすべての連続希釈細胞懸濁液の10 μLをスポットします。
   6. パーシスターアッセイプレート(ステップ4.3.3で調製)をガス透過性の密閉膜でプレートを覆った後、37°Cで軌道シェーカーにインキュベートし、6時間250rpmでインキュベートします。
   7. シェーカーで6時間のインキュベーションを行った後、パーシスターアッセイプレートを取り出し、ステップ4.3.4-4.3.5を繰り返します。
   8. 寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートし、CFUsを数えます。抗生物質治療の前および6時間後のCFUレベルは、各井戸のパーシスター分画を計算することを可能にする。OfX治療前のCFUカウントはまた、浸透量体の効果と 大腸菌 の生存率を評価するのに役立ちます。

5. 特定された条件の検証

1. マイクロアレイスクリーニングから同定された浸透量を含む新たに改変されたLB培地のステップ2.3から25mLに指数位相細胞の250 μLを移す(プロトコル4を参照)。
2. 250 rpm で軌道シェーカーにフラスコをインキュベートし、37 °Cで 24 時間インキュベートします。
3. 24時間後、シェーカーからフラスコを取り出し、250 mLバッフルフラスコで25mLのフレッシュ改質LB培地に細胞培養液250μLを移します。
4. 25 μLのOFXストック溶液(5 mg/mL)を細胞懸濁液に加え、フラスコを軽く振ってアッセイ培養を均質にします。フラスコを37°Cおよび250rpmでシェーカーにインキュベートする。
5. 処理中の1時間ごとに、フラスコから1.5mLマイクロ遠心チューブにアッセイ培養液1mLを移す。
6. マイクロ遠心分離管内のアッセイ培養物を17,000xgで3分間遠心分離する。
7. 950 μLの上清を取り出し、950 μLのPBSを加えます。
8. 洗浄手順 5.6 と 5.7 を 3x に対して繰り返します。
9. 最終洗浄後、細胞ペレットを100μLのPBS溶液で再懸濁します。
10. 細胞懸濁液を10μLとし、96ウェルラウンドボトムプレートを使用して90μLのPBS溶液で6倍を連続して希釈します。
11. 抗生物質を含まない新鮮な寒天プレートに希釈された細胞懸濁液の10 μLを見つける。検出の限界を高めるには、新鮮な寒天プレートに残りの90μLの細胞懸濁液をプレートします。
12. 寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートし、CFUsを数えます。

結果

図 1 は、実験プロトコルについて説明しています。希釈/成長サイクル実験(プロトコル2参照)は、一晩培養に^{由来するパー} シスターを排除するためにKerenらら5によって行われた研究から適応した。 図2A は、OFX処理前後の細胞培養のCFUレベルを決定するために用いられる寒天プレートの代表的な画像である。これらの実験では、細?...

ディスカッション

ここで説明する高スループットパーシスターアッセイは、大 腸菌 の持続性に対する様々な化学物質の影響を解明するために開発されました。商用PMプレートに加えて、マイクロアレイはステップ4.2で説明されているように手動で構築することができます。さらに、ここで提示されるプロトコルは柔軟性があり、96ウェルプレート形式の薬物パネルや細胞ライブラリなどの他のマイクロ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-ml test tube	Fisher Scientific	14-959-1B
E. coli strain MG1655	Princeton University		Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate	USA Scientific	5665-5161
Gas permeable sealing membrane	VWR	102097-058	Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate	VWR	82050-062
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Molecular genetics grade
Ofloxacin salt	VWR	103466-232	HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)	Biolog	N/A	PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate	USA Scientific	5665-0161
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500	Certified ACS grade
Sodium nitrate	Fisher Scientific	AC424345000	ACS reagent grade
Sodium nitrite	Fisher Scientific	AAA186680B	98% purity
Square petri dish	Fisher Scientific	FB0875711A
Tryptone	Fisher Scientific	BP1421-500	Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0	Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-100	Molecular genetics grade