Screening ad alta produttività dei composti chimici per chiarire i loro effetti sulla persistenza batterica

Riepilogo

In questo documento di metodo, presentiamo una strategia di screening ad alta produttività per identificare composti chimici, come gli osmoliti, che hanno un impatto significativo sulla persistenza batterica.

Abstract

I persister batterici sono definiti come una piccola sottopopolazione di varianti fenotipiche con la capacità di tollerare alte concentrazioni di antibiotici. Sono un'importante preoccupazione per la salute in quanto sono stati associati a infezioni croniche ricorrenti. Sebbene le dinamiche stocastiche e deterministiche dei meccanismi legati allo stress svolgano un ruolo significativo nella persistenza, i meccanismi alla base del passaggio fenotipico da/verso lo stato di persistenza non sono completamente compresi. Mentre i fattori di persistenza innescati dai segnali ambientali (ad esempio, l'esaurimento delle fonti di carbonio, azoto e ossigeno) sono stati ampiamente studiati, gli impatti degli osmoliti sulla persistenza devono ancora essere determinati. Utilizzando microarray (cioè 96 piastre di pozzo contenenti varie sostanze chimiche), abbiamo progettato un approccio per chiarire gli effetti di vari osmoliti sulla persistenza di Escherichia coli in modo ad alta produttività. Questo approccio è trasformativo in quanto può essere facilmente adattato per altri array di screening, come pannelli di farmaci e librerie di knockout genico.

Introduzione

Le colture batteriche contengono una piccola sottopopolazione di cellule persistenti che sono temporaneamente tolleranti a livelli insolitamente elevati di antibiotici. Le cellule persistenti sono geneticamente identiche ai loro parenti sensibili agli antibiotici e la loro sopravvivenza è stata attribuita all'inibizione transitoria della crescita¹. Le cellule persistenti sono state scoperte per la prima volta da Gladys Hobby^{2, ma} il termine è stato usato per la prima volta da Joseph Bigger quando le ha identificate nelle colture di Staphylococcus pyogenes trattate con penicillina³. ^Uno studio seminale pubblicato da Balaban et al. I persister sono rilevati da test di sopravvivenza clonogenici, in cui i campioni di coltura vengono prelevati a vari intervalli durante i trattamenti antibiotici, lavati e placcati su un tipico mezzo di crescita per contare le cellule sopravvissute che possono colonizzare in assenza di antibiotici. L'esistenza di persistenti in una coltura cellulare è valutata da una curva di uccisione bifasica^4,5 in cui il decadimento esponenziale iniziale indica la morte di cellule sensibili agli antibiotici. Tuttavia, la tendenza all'uccisione diminuisce nel tempo, portando infine a una regione di altopiano che rappresenta le cellule persistenti sopravvissute.

Le cellule persistenti sono state associate a varie malattie come la tubercolosi^6,la fibrosi cistica^7,la candidosi⁸ e le infezioni del tratto urinario⁹. Quasi tutti i microrganismi testati finora hanno generato fenotipi persistenti, tra cui Mycobacterium tuberculosis⁶ad alta patogenicità, Staphylococcus aureus^10, Pseudomonas aeruginosa⁷ e Candida albicans⁸. Studi recenti forniscono anche prove dell'ascesa di mutanti multirrogatori dalle sottopopolazioni persistenti^11,12. Notevoli sforzi in questo campo hanno rivelato che i meccanismi di persistenza sono molto complessi e diversificati; sia i fattori stocastico che deterministico associati ai sistemi di risposta SOS^13,14, specie reattive dell'ossigeno (ROS)¹⁵, tossina/antitossina (TA)¹⁶, autofagia o autodigestione^{17 e} risposta rigorosa correlata al ppGpp^{18 sono noti} per facilitare la formazione persister.

Nonostante i significativi progressi nella comprensione del fenotipo di persistenza, gli effetti degli osmoliti sulla persistenza batterica non sono stati pienamente compresi. Poiché il mantenimento di una pressione osmotica ottimale è una necessità per la crescita delle cellule, il corretto funzionamento e la sopravvivenza, uno studio approfondito degli osmoliti potrebbe portare a potenziali obiettivi per strategie anti-persistenti. Sebbene lo screening laborioso e ad alta produttività sia un approccio molto efficace per identificare metaboliti e altre sostanze chimiche che svolgono un ruolo cruciale nel fenotipo di persistenza^19,20. In questo lavoro, discuteremo il nostro metodo^{pubblicato 19}, dove abbiamo usato microarray, cioè 96 piastre di pozzo contenenti vari osmoliti (ad esempio, cloruro di sodio, urea, nitrito di sodio, nitrato di sodio, cloruro di potassio), per identificare gli osmoliti che influenzano significativamente la persistenza di E. coli.

Protocollo

1. Preparazione del mezzo di crescita, della soluzione di ofloxacina e delle scorte di cellule E. coli

1. Mezzo regolare Luria-Bertani (LB): Aggiungere 10 g/L di triptono, 10 g/L di cloruro di sodio (NaCl) e 5 g/L di estratto di lievito in acqua deionizzata (DI). Sterilizzare il mezzo con l'autoclave.
2. Piastre di agar LB: Aggiungere 10 g/L di triptono, 10 g/L di NaCl, 5 g/L di estratto di lievito e 15 g/L di agar in acqua DI e sterilizzare il mezzo mediante autoclave. Alla temperatura desiderata (~55 °C), versare ~30 mL di mezzo agar in piastre quadrate (10 x 10 cm). Asciugare i piatti e conservare a 4 °C.
3. Mezzo LB modificato: Aggiungere 10 g/L di triptono e 5 g/L di estratto di lievito in acqua DI. Sterilizzare il mezzo con l'autoclave.
4. Mezzo LB modificato incluso un osmolita: mescolare 2x mezzo LB modificato con una soluzione di osmolita 2x in volumi uguali. Per preparare 2x mezzo LB modificato, aggiungere 20 g/L di triptono e 10 g/L di estratto di lievito in acqua DI e sterilizzare mediante autoclave. Per preparare la soluzione di osmolita 2x, sciogliere l'osmolita di interesse (quantità 2x) in acqua DI, quindi filtrare sterilizzare la soluzione.
   NOTA: L'osmolita di interesse e le sue concentrazioni possono essere determinati dai test di screening del fenotipo microarray (cfr. protocollo 4). Tuttavia, l'osmolita testato e la concentrazione 2x associata possono essere regolati in base alla natura della ricerca. Ad esempio, per studiare l'impatto del cloruro di sodio da 1 mM, una soluzione di osmolita 2x sarebbe una soluzione di cloruro di sodio da 2 mM.
5. Soluzione di stock di ofloxacina (5 mg/mL): Aggiungere 5 mg di sale di ofloxacina (OFX) in 1 mL di acqua DI. Aggiungere 10 μL di idrossido di sodio 10 M per aumentare la solubilità dell'OFX in acqua, quindi filtrare sterilizzare la soluzione. Preparare le aliquote e conservare a -20 °C.
   NOTA: L'ofloxacina è un antibiotico del quinolone che è stato ampiamente utilizzato sia per le cellule batteriche in crescita che per quelle non in^{crescita 14,21}. La concentrazione inibitoria minima (MIC) di OFX per le cellule E. coli MG1655 rientra nell'intervallo 0,039-0,078 μg/mL^19,20. Si noti inoltre che altri antibiotici come l'ampicillina e la kanamicina sono comunemente usati nella ricerca persister. La scelta degli antibiotici dipende dalla natura dello studio.
6. E. coli Scorte cellulari MG1655: Inoculare 2 ml di mezzo LB regolare con una singola colonia in una provetta da 14 mL (snap-capped) e colturare le cellule in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C. Quando le cellule raggiungono la fase stazionaria, mescolare 500 μL della coltura cellulare con 500 μL di glicerolo 50% (sterile) in una fiala criogenica e conservare a -80 °C.

2. Propagazione delle cellule per eliminare i persister preesistenti

1. Per preparare una coltura notturna, raschiare una piccola quantità di cellule da un calcio cellulare congelato con una punta di pipetta sterile (non scongelare il materiale cellulare di glicerolo) e inoculare le cellule in 2 ml di mezzo LB modificato in una provetta con snap-capped da 14 ml. Coltura delle cellule in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C per 12 ore.
2. Prima propagazione
   1. Dopo 12 ore, trasferire 250 μL di coltura notturna a 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml coperto da un foglio di alluminio sterile.
   2. Far crescere la coltura cellulare in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C fino a quando le cellule non raggiungono la fase medio-esponenziale (OD₆₀₀ = 0,5).
   3. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) utilizzando un lettore di micropiatte ogni 30 minuti.
3. Seconda propagazione
   1. A₆₀₀ OD = 0,5, diluire 250 μL di coltura cellulare dal primo pallone in 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml.
   2. Far crescere la seconda coltura cellulare in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C fino a₆₀₀=0,5 OD.
   3. Misurare la densità ottica ogni 30 minuti.
      NOTA: una coltura notturna può avere una quantità significativa di celle persistenti^4,5,22. Il metodo del ciclo di^{diluizione/crescita 5} sopra descritto può essere utilizzato per eliminare questi persister preesistenti prima di trasferire le cellule in microarray. La loro eliminazione può essere convalidata quantificando i livelli persistenti di colture notturne con il saggio descritto nel protocollo n. 3. Questo metodo è già stato convalidato in uno studio precedente¹⁹.

3. Convalida dell'eliminazione delle celle persistenti preesistenti

1. Dopo la seconda propagazione (vedi fase 2.3), diluire 250 μL della coltura cellulare (OD₆₀₀ = 0,5) in 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml.
   NOTA: Per i comandi, diluire 250 μL di coltura notturna (vedi fase 2.1) in 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 ml. Prima di trasferire le cellule nel pallone, la densità cellulare della coltura notturna deve essere regolata in un mezzo LB fresco modificato per ottenere OD₆₀₀ = 0,5.
2. Aggiungere 25 μL di soluzione stock OFX (5 mg/mL) nella sospensione cellulare e agitare delicatamente il pallone per rendere omogenea la coltura del saggio. La concentrazione finale di OFX è di 5 μg/mL nella coltura del saggio.
3. Incubare la coltura del saggio in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C.
4. Ad ogni ora durante il trattamento (incluso 0 h, il punto di tempo prima di aggiungere OFX nella coltura del dosaggio), trasferire 1 ml della coltura di dosaggio dal pallone a un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.
5. Centrifugare la coltura di dosaggio nel tubo di microcentrifugo a 17.000 x g per 3 min.
6. Rimuovere con cura 950 μL del supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
7. Aggiungere 950 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nel tubo di microcentrifugo.
8. Ripetere i passaggi di lavaggio 3.5-3.7 per 3x in totale fino a quando la concentrazione antibiotica è inferiore alla concentrazione inibitoria minima (MIC).
9. Dopo il lavaggio finale, resuspend il pellet cellulare in 100 μL di soluzione PBS, con conseguente 10x campione concentrato.
10. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire serialmente sei volte in 90 μL di soluzione PBS utilizzando una piastra inferiore ben rotonda da 96.
11. Spot 10 μL di sospensioni cellulari diluite su piastre di agar fresche senza antibiotici. Per aumentare il limite di rilevamento, placcare i restanti 90 μL di sospensione cellulare su una piastra di agar fresca.
12. Incubare le piastre di agar a 37 °C per 16 ore, quindi contare le unità di formazione della colonia (CFC). Tenere conto dei tassi di diluizione durante il calcolo del numero totale di CFC in 1 mL di coltura di saggi. Le curve di uccisione vengono generate tracciando i valori logaritmici della CFU rispetto alla durata del trattamento antibiotico.
    NOTA: Un trattamento OFX di 6 ore è sufficiente per ottenere una curva di uccisione bifasica per le cellule E. coli ^19,20. Il livello più persistente di cellule propagate (misurato dal conteggio cfu a 6 ore) dovrebbe essere significativamente inferiore a quello della coltura overnight. Le procedure descritte nei protocolli 2 e 3 possono essere eseguite con LB regolare a seconda della progettazione della ricerca.

4. Screening delle piastre microarray

1. Preparazione delle colture microarray-cell
   1. Trasferire 250 μL di cellule in fase esponenziale a 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un tubo di centrifuga da 50 ml. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea.
      NOTA: Le cellule in fase esponenziale (OD₆₀₀ = 0,5) sono ottenute dal secondo passaggio di propagazione (vedere fase 2.3).
   2. Trasferire la sospensione cellulare diluita in un serbatoio sterile da 50 mL.
   3. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 150 μL della sospensione cellulare ad ogni pozzo di un microarray, cioè una piastra di 96 pouf contenente vari osmoliti.
      NOTA: I pozzi che non hanno osmoliti fungono da controlli.
   4. Coprire il microarray con una membrana di tenuta permeabile al gas.
   5. Incubare la piastra in uno shaker orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 24 ore.
      NOTA: In questi esperimenti sono state utilizzate piastre disponibili in commercio, come Phenotype Microarrays (PM-9 e PM-10) che includono una vasta gamma di osmoliti, tamponi di pH e altre sostanze chimiche in uno stato essiccato a varie concentrazioni. Questi microarray sono in formati a piastre a mezza area 96. I volumi di coltura devono essere regolati in base al tipo di piastre utilizzate. I microarray possono anche essere generati manualmente (vedi sotto).
2. Preparazione manuale di piastre microarray
   1. Trasferire 75 μL di soluzioni di osmoliti 2x nei pozzi di una piastra di pozzo 96 semi-area.
   2. Trasferire 500 μL di cellule in fase esponenziale a 25 ml di mezzo LB modificato 2x in un tubo di centrifuga da 50 ml. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea.
      NOTA: Il tasso di inoculazione è stato regolato in modo da essere coerente con il protocollo di screening microarray descritto al 4.1.
   3. Aggiungere 75 μL della sospensione cellulare in ogni pozzo della piastra del pozzo 96 a mezza area contenente soluzioni di osmoliti 2x.
   4. Incubare la piastra in uno shaker orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 24 ore.
3. Preparazione di piastre di dosaggio persistenti
   1. Preparare 25 ml di mezzo LB modificato contenente 5 μg/ml di OFX in un tubo di centrifuga da 50 ml e trasferire questo mezzo in un serbatoio sterile.
   2. Trasferire 190 μL di mezzo LB modificato con OFX dal serbatoio in ogni pozzo di una piastra generica a fondo piatto da 96 poggiale (piastra di dosaggio persister) utilizzando una pipetta multicanale.
   3. Rimuovere il microarray dallo shaker (dopo la coltivazione per 24 ore) e trasferire 10 μL di colture cellulari dal microarray ai pozzi della piastra di dosaggio persister, contenente mezzo LB modificato con OFX.
   4. Prendere 10 μL di sospensioni cellulari dalla piastra di dosaggio persister e diluire serialmente tre volte in 290 μL di soluzione PBS utilizzando una piastra di pozzo 96 a fondo rotondo e una pipetta multicanale.
   5. Dopo la diluizione seriale, individuare 10 μL di tutte le sospensioni cellulari diluite in serie su piastre di agar fresche senza antibiotici utilizzando una pipetta multicanale.
   6. Incubare la piastra di dosaggio persister (preparata al passaggio 4.3.3) in uno shaker orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 6 ore dopo aver coperto la piastra con una membrana di tenuta permeabile al gas.
   7. Dopo 6 ore di incubazione in uno shaker, estraere la piastra di dosaggio persister e ripetere i passaggi 4.3.4-4.3.5.
   8. Incubare le piastre di agar per 16 ore a 37 °C, quindi contare i CFC. I livelli di CFU prima e 6 ore dopo il trattamento antibiotico consentono di calcolare la frazione più persistente in ogni pozzo. Il CFU conta prima del trattamento OFX aiuta anche a valutare gli effetti degli osmoliti e sulla vitalità di E. coli.

5. Convalida delle condizioni identificate

1. Trasferire 250 μL delle cellule di fase esponenziale dal passaggio 2.3 a 25 mL di mezzo LB fresco modificato contenente l'osmolita identificato dallo screening del microarray (vedi protocollo 4).
2. Incubare il pallone in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 °C per 24 ore.
3. Dopo 24 ore, rimuovere il pallone dallo shaker e trasferire 250 μL della coltura cellulare a 25 ml di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 mL.
4. Aggiungere 25 μL di soluzione stock OFX (5 mg/mL) nella sospensione cellulare e agitare delicatamente il pallone per rendere omogenea la coltura del dosaggio. Incubare il pallone in uno shaker a 37 °C e 250 giri/min.
5. Ad ogni ora durante il trattamento, trasferire 1 ml della coltura del saggio dal pallone a un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.
6. Centrifugare la coltura di dosaggio nel tubo di microcentrifugo a 17.000 x g per 3 min.
7. Rimuovere 950 μL di supernatante e aggiungere 950 μL di PBS.
8. Ripetere i passaggi di lavaggio 5.6 e 5.7 per 3x.
9. Dopo il lavaggio finale, rimorsi il pellet cellulare in 100 μL di soluzione PBS.
10. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire serialmente 6x in 90 μL di soluzione PBS utilizzando una piastra inferiore ben rotonda 96.
11. Individuare 10 μL delle sospensioni cellulari diluite su una piastra di agar fresca priva di antibiotici. Per aumentare il limite di rilevamento, placcare i restanti 90 μL di sospensione cellulare su una piastra di agar fresca.
12. Incubare la piastra di agar a 37 °C per 16 ore, quindi contare i CFC.

Risultati

La figura 1 descrive il nostro protocollo sperimentale. Gli esperimenti del ciclo di diluizione/crescita (cfr. protocollo n. 2) sono stati adattati da uno studio condotto da Keren et^al. La figura 2A è un'immagine rappresentativa delle piastre di agar utilizzate per determinare i livelli di CFU delle colture cellulari prima e dopo il trattamento OFX. In questi esperimenti, le cellule sono state coltivate in mezzo LB modificato con osmolit...

Discussione

Il saggio persister ad alta produttività qui descritto è stato sviluppato per chiarire gli effetti di varie sostanze chimiche sulla persistenza di E. coli. Oltre alle piastre PM commerciali, i microarray possono essere costruiti manualmente come descritto al passaggio 4.2. Inoltre, il protocollo qui presentato è flessibile e può essere utilizzato per schermare altri microarray, come pannelli antidroga e librerie cellulari, che sono in 96 formati di piastra di pozzo. Le condizioni sperimentali, compresa la fa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-ml test tube	Fisher Scientific	14-959-1B
E. coli strain MG1655	Princeton University		Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate	USA Scientific	5665-5161
Gas permeable sealing membrane	VWR	102097-058	Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate	VWR	82050-062
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Molecular genetics grade
Ofloxacin salt	VWR	103466-232	HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)	Biolog	N/A	PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate	USA Scientific	5665-0161
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500	Certified ACS grade
Sodium nitrate	Fisher Scientific	AC424345000	ACS reagent grade
Sodium nitrite	Fisher Scientific	AAA186680B	98% purity
Square petri dish	Fisher Scientific	FB0875711A
Tryptone	Fisher Scientific	BP1421-500	Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0	Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-100	Molecular genetics grade