Triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana

Resumo

Neste artigo de método, apresentamos uma estratégia de triagem de alto rendimento para identificar compostos químicos, como osmolitos, que têm um impacto significativo na persistência bacteriana.

Resumo

Persisters bacterianos são definidos como uma pequena subpopulação de variantes fenotípicas com a capacidade de tolerar altas concentrações de antibióticos. São uma importante preocupação para a saúde, pois têm sido associadas a infecções crônicas recorrentes. Embora a dinâmica estocástica e determinística dos mecanismos relacionados ao estresse seja conhecida por desempenhar um papel significativo na persistência, os mecanismos subjacentes à mudança fenotípica para/do estado de persistência não são completamente compreendidos. Embora os fatores de persistência desencadeados por sinais ambientais (por exemplo, esgotamento das fontes de carbono, nitrogênio e oxigênio) tenham sido extensivamente estudados, os impactos dos osmólises sobre a persistência ainda estão para ser determinados. Usando microarrays (ou seja, 96 placas de poço contendo vários produtos químicos), projetamos uma abordagem para elucidar os efeitos de vários osmólises na persistência de Escherichia coli de forma de alto rendimento. Essa abordagem é transformadora, pois pode ser prontamente adaptada para outras matrizes de triagem, como painéis de drogas e bibliotecas de genes knockout.

Introdução

Culturas bacterianas contêm uma pequena subpopulação de células persisteras que são temporariamente tolerantes a níveis extraordinariamente altos de antibióticos. As células persisteras são geneticamente idênticas aos seus parentes sensíveis a antibióticos, e sua sobrevivência tem sido atribuída à inibição transitória do crescimento¹. Células persisteres foram descobertas pela primeira vez por Gladys Hobby^2, mas o termo foi usado pela primeira vez por Joseph Bigger quando ele as identificou nas culturas Staphylococcus pyogenes tratadas com penicilina³. Um estudo seminal publicado por Balaban et al.⁴ descobriu dois tipos de persistência: variantes tipo I que são formadas principalmente por passagem através da fase estacionária, e variantes tipo II que são geradas continuamente durante o crescimento exponencial. Persisters são detectados por ensaios de sobrevivência clonogênico, nos quais amostras de cultura são colhidas em vários intervalos durante tratamentos com antibióticos, lavadas e banhadas em um meio de crescimento típico para contar as células sobreviventes que podem colonizar na ausência de antibióticos. A existência de persisters em uma cultura celular é avaliada por uma curva de morte bifásica^4,5 onde a decadência exponencial inicial indica a morte de células sensíveis a antibióticos. No entanto, a tendência de morte diminui com o tempo, eventualmente levando a uma região platô que representa as células persisteres sobreviventes.

As células persisteres têm sido associadas a várias doenças como tuberculose^6,fibrose cística^7,candidíase⁸ e infecções do trato urinário⁹. Quase todos os microrganismos testados até agora foram encontrados para gerar fenótipos persisteres, incluindo mycobacterium tuberculosis⁶, Staphylococcus aureus¹⁰, Pseudomonas aeruginosa⁷ e Candida albicans⁸. Estudos recentes também fornecem evidências do surgimento de mutantes multidroga resistentes a subpopulações^{persistentes 11,12}. Esforços substanciais neste campo revelaram que os mecanismos de persistência são altamente complexos e diversos; tanto fatores estocásticos quanto determinísticos associados à resposta SOS^13,14, espécies reativas de oxigênio (ROS)^15,sistemas toxina/antitoxina (TA)^16,autofagia ou auto-digestão¹⁷ e resposta rigorosa relacionada ao PPGPP¹⁸ são conhecidos por facilitar a formação de persister.

Apesar dos progressos significativos na compreensão do fenótipo persistência, os efeitos dos osmólises sobre a persistência bacteriana não foram totalmente compreendidos. Uma vez que a manutenção da pressão osmótica ideal é uma necessidade para o crescimento das células, o bom funcionamento e a sobrevivência, um estudo aprofundado dos osmólises poderia levar a potenciais alvos para estratégias anti-persistência. Embora a triagem laboriosa e de alto rendimento seja uma abordagem muito eficaz para identificar metabólitos e outros produtos químicos que desempenham um papel crucial no fenótipo de persistência^19,20. Neste trabalho, discutiremos nosso método publicado¹⁹, onde usamos microarrays, ou seja, 96 placas de poço contendo vários osmólises (por exemplo, cloreto de sódio, ureia, nitrito de sódio, nitrato de sódio, cloreto de potássio), para identificar osmólitos que influenciam significativamente a persistência de E. coli.

Protocolo

1. Preparação de estoques médios de crescimento, solução de deloxacina e estoques de células E. coli

1. Meio regular luria-bertani (LB): Adicione 10 g/L de triptona, 10 g/L de cloreto de sódio (NaCl) e 5 g/L de extrato de levedura em água desionizada (DI). Esterilize o meio autoclavando.
2. Placas de ágar LB: Adicione 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de extrato de levedura e 15 g/L de ágar em água DI e esterilize o meio por autoclavagem. Na temperatura desejada (~55 °C), despeje ~30 mL de ágar médio em placas quadradas (10 x 10 cm). Seque as placas e armazene a 4 °C.
3. Meio LB modificado: Adicione 10 g/L de triptona e 5 g/L de extrato de levedura em água DI. Esterilize o meio autoclavando.
4. Meio LB modificado incluindo um osmólise: Misture 2x meio LB modificado com uma solução de osmólitos de 2x em volumes iguais. Para preparar 2x médio LB modificado, adicione 20 g/L de triptona e 10 g/L de extrato de levedura em água DI e esterilize por autoclavagem. Para preparar a solução de osmólise 2x, dissolva o osmólise de interesse (quantidade 2x) em água DI e, em seguida, o filtro esterilize a solução.
   NOTA: O osmólito de interesse e suas concentrações pode ser determinado a partir dos ensaios de triagem de Microarray do Fenótipo (ver Protocolo 4). No entanto, o osmólito testado e a concentração 2x associada podem ser ajustados dependendo da natureza da pesquisa. Por exemplo, para estudar o impacto do cloreto de sódio de 1 mM, uma solução de osmólito 2x seria uma solução de cloreto de sódio de 2 mM.
5. Solução de estoque de ofloxacina (5 mg/mL): Adicione 5 mg de sal de ofloxacina (OFX) em 1 mL de água DI. Adicione 10 μL de hidróxido de sódio de 10 M para aumentar a solubilidade do OFX na água e, em seguida, o filtro esterilizar a solução. Prepare as alíquotas e armazene a -20 °C.
   NOTA: A ofloxacina é um antibiótico de quinolone que tem sido amplamente utilizado para células bacterianas em crescimento e não crescimento^14,21. A concentração inibitória mínima (MIC) de OFX para células E. coli MG1655 está dentro da faixa de 0,039-0,078 μg/mL^19,20. Observe também que outros antibióticos como ampicillina e kanamicina são comumente usados em pesquisas per persister. A escolha dos antibióticos depende da natureza do estudo.
6. E. coli Estoques de células MG1655: Inoculam 2 mL de meio LB normal com uma única colônia em um tubo de ensaio de 14 mL (snap-capped) e cultural as células em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C. Quando as células chegarem à fase estacionária, misture 500 μL da cultura celular com 500 μL de 50% de glicerol (estéril) em um frasco criogênico e armazene a -80 °C.

2. Propagação de células para eliminar persisters pré-existentes

1. Para preparar uma cultura durante a noite, raspe uma pequena quantidade de células de um estoque de células congeladas com uma ponta de pipeta estéril (não descongele o estoque de células glicerol), e inocular as células em 2 mL de meio LB modificado em um tubo de ensaio com tampa de snap de 14 mL. Cultue as células em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C por 12 h.
2. Primeira propagação
   1. Após 12 h, transfira 250 μL de cultura durante a noite para 25 mL de meio LB modificado fresco em um frasco de 250 mL perplexo coberto com uma folha de alumínio estéril.
   2. Cresça a cultura celular em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C até que as células atinjam a fase exponencial média (OD₆₀₀ = 0,5).
   3. Meça a densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) usando um leitor de microplacas a cada 30 minutos.
3. Segunda propagação
   1. Em OD₆₀₀ = 0,5, dilui 250 μL de cultura celular do primeiro frasco em 25 mL de meio LB modificado fresco em um frasco de 250 mL perplexo.
   2. Cresça a segunda cultura celular em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C até OD₆₀₀=0,5.
   3. Meça a densidade óptica a cada 30 minutos.
      NOTA: Uma cultura noturna pode ter uma quantidade significativa de células persistência^4,5,22. O método de ciclo de diluição/crescimento⁵ descrito acima pode ser usado para eliminar esses persistências pré-existentes antes de transferir as células para microarrays. Sua eliminação pode ser validada quantificando níveis persistência de culturas noturnas com o ensaio descrito no Protocolo 3. Este método já foi validado em um estudo anterior¹⁹.

3. Validando a eliminação de células persisteres pré-existentes

1. Após a segunda propagação (ver passo 2.3), diluir 250 μL da cultura celular (OD₆₀₀ = 0,5) em 25 mL de meio LB modificado fresco em um frasco de 250 mL perplexo.
   NOTA: Para controles, diluir 250 μL de cultura durante a noite (ver passo 2.1) em 25 mL de meio LB modificado fresco em um frasco de 250 mL perplexo. Antes de transferir as células para o frasco, a densidade celular da cultura overnight deve ser ajustada em meio LB modificado fresco para obter OD₆₀₀ = 0,5.
2. Adicione 25 μL de solução de estoque OFX (5 mg/mL) na suspensão celular e agite o frasco suavemente para tornar a cultura do ensaio homogênea. A concentração final de OFX é de 5 μg/mL na cultura de ensaio.
3. Incubar a cultura do ensaio em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C.
4. A cada hora durante o tratamento (incluindo 0h, o ponto de tempo antes de adicionar OFX na cultura de ensaio), transfira 1 mL da cultura de ensaio do frasco para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL.
5. Centrifugar a cultura de ensaio no tubo de microcentrifuuge a 17.000 x g por 3 min.
6. Remova cuidadosamente 950 μL do supernatante sem perturbar a pelota celular.
7. Adicione 950 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) no tubo de microcentrifuuge.
8. Repita as etapas de lavagem 3,5-3,7 por 3x no total até que a concentração de antibióticos esteja abaixo da concentração inibitória mínima (MIC).
9. Após a lavagem final, resuspenja a pelota celular em 100 μL de solução PBS, resultando em uma amostra concentrada de 10x.
10. Tome 10 μL da suspensão da célula e dilua-se seis vezes em 90 μL de solução PBS usando uma placa inferior bem redonda de 96.
11. Local 10 μL de suspensões de células diluídas em placas de ágar frescas sem antibióticos. Para aumentar o limite de detecção, aplaque os 90 μL restantes de suspensão celular em uma placa de ágar fresca.
12. Incubar as placas de ágar a 37 °C por 16 h e, em seguida, contar as unidades formadoras de colônias (UFC). Conta as taxas de diluição enquanto calcula o número total de UFC em 1 mL de cultura de ensaio. As curvas de morte são geradas pelo plotagem dos valores da UFC logarítmica em relação à duração do tratamento com antibióticos.
    NOTA: Um tratamento OFX de 6 h é suficiente para obter uma curva de morte bifásica para células E. coli ^19,20. O nível persistente de células propagadas (medida pela CFU em 6h) deve ser significativamente menor do que o da cultura da noite para o dia. Os procedimentos descritos nos Protocolos 2 e 3 podem ser realizados com LB regular, dependendo do desenho da pesquisa.

4. Triagens de placas de microarray

1. Preparando culturas de microarray-cell
   1. Transfira 250 μL de células de fase exponencial para 25 mL de meio LB modificado fresco em um tubo de centrífuga de 50 mL. Misture suavemente a suspensão da célula para torná-la homogênea.
      NOTA: As células de fase exponencial (OD₆₀₀ = 0,5) são obtidas a partir da segunda etapa de propagação (ver passo 2.3).
   2. Transfira a suspensão da célula diluída para um reservatório estéril de 50 mL.
   3. Utilizando uma pipeta multicanal, transfira 150 μL da suspensão celular para cada poço de microarray, ou seja, uma placa de 96 poços contendo vários osmólises.
      NOTA: Poços que não possuem osmólises servem como controles.
   4. Cubra a microarray com uma membrana de vedação permeável a gás.
   5. Incubar a placa em um agitador orbital a 37 °C e 250 rpm por 24 h.
      NOTA: Nestes experimentos, foram utilizadas placas comercialmente disponíveis, como Phenotype Microarrays (PM-9 e PM-10) que incluem uma ampla gama de osmólises, tampões de pH e outros produtos químicos em estado seco em várias concentrações. Essas microarrays estão em formatos de placas de meia área 96. Os volumes de cultura devem ser ajustados dependendo do tipo de placas que estão sendo utilizadas. Microarrays também podem ser gerados manualmente (veja abaixo).
2. Preparação manual de placas de microarray
   1. Transfira 75 μL de soluções de osmólise 2x para os poços de uma placa de meio-campo 96.
   2. Transfira 500 μL de células de fase exponencial para 25 mL de meio LB modificado de 2x em um tubo centrífuga de 50 mL. Misture suavemente a suspensão da célula para torná-la homogênea.
      NOTA: A taxa de inoculação foi ajustada para ser consistente com o protocolo de triagem de microarray descrito em 4.1.
   3. Adicione 75 μL da suspensão da célula em cada poço da placa de meio-campo 96 bem contendo soluções de osmólito 2x.
   4. Incubar a placa em um agitador orbital a 37 °C e 250 rpm por 24 h.
3. Preparando placas de ensaio de periáscrito
   1. Prepare 25 mL de meio LB modificado contendo 5 μg/mL de OFX em um tubo de centrífuga de 50 mL e transfira este meio para um reservatório estéril.
   2. Transfira 190 μL de meio LB modificado com OFX do reservatório para cada poço de uma placa de poço de fundo plano genérico 96 (placa de ensaio persistente) usando uma pipeta multicanal.
   3. Remova a microarray do agitador (após a colheita por 24 h) e transfira 10 μL de culturas celulares da microarray para os poços da placa de ensaio persister, contendo meio LB modificado com OFX.
   4. Pegue 10 μL de suspensões celulares da placa de ensaio periculoso e dilua-se em série três vezes em 290 μL de solução PBS usando uma placa de poço de fundo redondo 96 e uma pipeta multicanal.
   5. Após a diluição seriada, local 10 μL de todas as suspensões celulares diluídas em série em placas de ágar fresco sem antibióticos usando uma pipeta multicanal.
   6. Incubar a placa de ensaio persister (preparada na etapa 4.3.3) em um agitador orbital a 37 °C e 250 rpm por 6h depois de cobrir a placa com uma membrana de vedação permeável a gás.
   7. Após a incubação de 6 h em um agitador, retire a placa de ensaio persister e repita os passos 4.3.4-4.3.5.
   8. Incubar as placas de ágar por 16 h a 37 °C e, em seguida, contar CFUs. Os níveis de UFC antes e 6 h após o tratamento antibiótico permitem calcular a fração persistência em cada poço. A CFU conta antes do tratamento OFX também ajudar a avaliar os efeitos dos osmólises e na viabilidade de E. coli.

5. Validação das condições identificadas

1. Transfira 250 μL das células de fase exponencial da Etapa 2.3 para 25 mL de meio LB modificado fresco contendo o osmólise identificado a partir da triagem de microarray (ver Protocolo 4).
2. Incubar o frasco em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C por 24 h.
3. Após 24 h, remova o frasco do agitador e transfira 250 μL da cultura celular para 25 mL de meio LB modificado fresco em um frasco de 250 mL perplexo.
4. Adicione 25 μL de solução de estoque OFX (5 mg/mL) na suspensão celular e agite o frasco suavemente para tornar a cultura do ensaio homogênea. Incubar o frasco em um shaker a 37 °C e 250 rpm.
5. A cada hora durante o tratamento, transfira 1 mL da cultura de ensaio do frasco para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
6. Centrifugar a cultura de ensaio no tubo de microcentrifuuge a 17.000 x g por 3 min.
7. Remova 950 μL de supernascente e adicione 950 μL de PBS.
8. Repita as etapas de lavagem 5.6 e 5.7 para 3x.
9. Após a lavagem final, resuspenja a pelota de célula em 100 μL de solução PBS.
10. Tome 10 μL da suspensão da célula e diluir em 6x em 90 μL de solução PBS usando uma placa inferior bem redonda de 96.
11. Local 10 μL das suspensões celulares diluídas em uma placa de ágar fresca sem antibióticos. Para aumentar o limite de detecção, aplaque os 90 μL restantes de suspensão celular em uma placa de ágar fresca.
12. Incubar a placa de ágar a 37 °C por 16 h e, em seguida, contar CFUs.

Resultados

A Figura 1 descreve nosso protocolo experimental. Os experimentos do ciclo de diluição/crescimento (ver Protocolo 2) foram adaptados de um estudo conduzido por Keren et al.⁵ para eliminar os persisters originários das culturas noturnas. Figura 2A é uma imagem representativa das placas de ágar usadas para determinar os níveis de CFU de culturas celulares antes e depois do tratamento OFX. Nesses experimentos, as células foram cultiva...

Discussão

O alto ensaio de persistência de rendimento descrito aqui foi desenvolvido para elucidar os efeitos de vários produtos químicos na persistência de E. coli. Além das placas comerciais da PM, as microarrays podem ser construídas manualmente conforme descrito na etapa 4.2. Além disso, o protocolo aqui apresentado é flexível e pode ser usado para tela de outras microarrays, como painéis de drogas e bibliotecas celulares, que estão em 96 formatos de placas de poço. As condições experimentais, incluindo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-ml test tube	Fisher Scientific	14-959-1B
E. coli strain MG1655	Princeton University		Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate	USA Scientific	5665-5161
Gas permeable sealing membrane	VWR	102097-058	Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate	VWR	82050-062
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Molecular genetics grade
Ofloxacin salt	VWR	103466-232	HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)	Biolog	N/A	PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate	USA Scientific	5665-0161
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500	Certified ACS grade
Sodium nitrate	Fisher Scientific	AC424345000	ACS reagent grade
Sodium nitrite	Fisher Scientific	AAA186680B	98% purity
Square petri dish	Fisher Scientific	FB0875711A
Tryptone	Fisher Scientific	BP1421-500	Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0	Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-100	Molecular genetics grade