Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

Resumen

CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.

Resumen

Los mosquitos Culex son los principales vectores de varias enfermedades que afectan negativamente la salud humana y animal, incluido el virus del Nilo Occidental y las enfermedades causadas por nematodos filariales como el gusano del corazón canino y la elefantiasis. Recientemente, la edición del genoma CRISPR /Cas9 se ha utilizado para inducir mutaciones dirigidas al sitio mediante la inyección de una proteína Cas9 que ha sido complejada con un ARN guía (ARNg) en embriones recién puestos de varias especies de insectos, incluidos los mosquitos que pertenecen a los géneros Anopheles y Aedes. Manipular e inyectar mosquitos Culex es un poco más difícil ya que estos mosquitos ponen sus huevos en posición vertical en balsas en lugar de individualmente como otras especies de mosquitos. Aquí describimos cómo diseñar gRNAs, complejarlos con proteína Cas9, inducir a mosquitos hembra de Culex pipiens a poner huevos, y cómo preparar e inyectar embriones recién puestos para microinyección con Cas9/gRNA. También describimos cómo criar y detectar mosquitos inyectados para detectar la mutación deseada. Los resultados representativos demuestran que esta técnica se puede utilizar para inducir mutaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos Culex y, con ligeras modificaciones, también se puede utilizar para generar mutantes nulos en otras especies de mosquitos.

Introducción

Los mosquitos Culex se distribuyen por las regiones templadas y tropicales del mundo y transmiten varios virus mortales, incluidos el virus del Nilo Occidental^1,la encefalitis de San Luis^2, así como los nematodos filariales que causan el gusano del corazón canino³ y la elefantiasis^4. Los miembros del complejo Culex pipiens, que incluye Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens y Cx. pipiens molestus, muestran variaciones sorprendentes en muchos aspectos de su biología. Por ejemplo, mientras que Cx. quinquefasciatus y Cx. pipiens molestus son incapaces de entrar en una latencia invernante^5,6, Cx. pipiens pipiens muestran respuestas estacionales robustas y entran en diapausa en respuesta a días cortos^7,8. Además, Cx. pipiens molestus tienden a ser más antropófilos, mientras que Cx. pipiens y Cx. quinquefasciatus son más zoofílicos⁶. Sin embargo, en los Estados Unidos y en muchos otros lugares del mundo, estas especies se cruzan, lo que tiene fuertes implicaciones para la transmisión de enfermedades, ya que los híbridos de Cx. pipiens pipiens y Cx. pipiens molestus son alimentadores oportunistas y morderán tanto a aves como a humanos^9,sirviendo así como vectores puente para el virus del Nilo Occidental. El estudio de estos y otros aspectos fascinantes de la biología de los mosquitos Culex se ha visto obstaculizado, en parte, porque los mosquitos Culex son un poco más difíciles de criar en el laboratorio que los mosquitos Aedes, que producen huevos inactivos y resistentes a la desecación¹⁰ y porque las herramientas moleculares funcionales no están tan bien desarrolladas para las especies de Culex.

La edición del genoma CRISPR/Cas9 es una poderosa tecnología que se ha utilizado para evaluar la biología de varias especies importantes de mosquitos^11,12,13,incluido el mosquito doméstico del sur, Culex quinquefasciatus^14,15,16. Esta tecnología, desarrollada por Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier, explota una defensa bacteriana natural contra los virus mediante endonucleasas asociadas a CRISPR derivadas de bacterias (proteínas Cas; ver revisión de Van der Oost et al.¹⁷). Cuando se inyectan en embriones animales, las proteínas Cas9 en combinación con un ARN guía apropiado pueden producir roturas de doble cadena dentro del genoma. Esto se hace con mayor frecuencia mediante el uso de la proteína Cas9 que se compleja con ARN guía, que dirige la actividad de la endonucleasa a una región específica del genoma. Después de que la proteína Cas9 ha creado una rotura de doble cadena específica del sitio, la maquinaria celular intenta reparar la ruptura utilizando uno de dos mecanismos. El primero implica ligar los dos extremos juntos a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ), que es propensa a errores y a menudo produce inserciones y deleciones fuera de marco en el genoma que pueden resultar en proteínas no funcionales, generando así una mutación knock-out. Alternativamente, la maquinaria celular podría usar la reparación dirigida por homología (HDR) encontrando secuencias similares para reparar correctamente la rotura. La secuencia similar puede ser proporcionada por el segundo cromosoma dentro del organismo (ver revisión¹⁸). Sin embargo, si la secuencia reparada coincide exactamente con la secuencia original, la proteína Cas9 podrá volver a cortar el ADN. Alternativamente, los investigadores también pueden incluir un plásmido donante que contenga secuencias homólogas a cada lado del sitio de corte de la secuencia objetivo con una secuencia de reparación alternativa, a menudo una proteína marcador fluorescente, una versión modificada del gen original u otra modificación, que se puede copiar e insertar en el genoma, o "knocked-in".

El tiempo es crítico cuando se inyectan embriones, y este es especialmente el caso cuando se utiliza la edición del genoma CRISPR / Cas9 para crear mutaciones en insectos. Esto se debe a que la proteína Cas9 y los gRNAs tienen la mayor capacidad de generar mutaciones solo cuando el embrión está en su estado sincitial, antes de que se hayan formado las membranas celulares y cuando múltiples núcleos son accesibles dentro del embrión. Para los mosquitos, los núcleos alcanzan la periferia ~ 2-4 horas después de la oviposición, dependiendo de la temperatura^19,y por lo tanto la microinyección exitosa debe ocurrir antes de este tiempo. Además, la proteína Cas9 cortará cualquier ADN nuclear al que pueda acceder, de modo que el individuo resultante de la inyección contendrá un mosaico de células, algunas con la mutación deseada y otras no. Para que estas mutaciones se hereden con éxito, la proteína Cas9 debe cortar el ADN que reside en la línea germinal que dará lugar a los futuros óvulos y espermatozoides. Para garantizar que se generen mutaciones en la línea germinal, es mejor inyectar todos los materiales cercanos a la ubicación de las células polares dentro del embrión, que son los progenitores de la línea germinal del insecto. Las células polares se encuentran cerca del extremo posterior de los embriones de Culex ²⁰. Además de inyectar embriones, es imperativo desarrollar un plan cuidadoso para cruzar y examinar a la descendencia con el fin de detectar la mutación deseada.

Este protocolo describe cómo generar gRNAs y complejarlos con proteína Cas9 para preparar mezclas de inyección, así como cómo inducir a los mosquitos hembra de Culex pipiens a poner huevos y cómo preparar e inyectar esos huevos para la edición del genoma mediada por CRISPR / Cas9. Además, describimos cómo criar, cruzar y examinar embriones inyectados y su progenie para confirmar que se ha obtenido la mutación deseada. Utilizando este protocolo, generamos mutaciones nulas para un gen de interés, ciclo,en la cepa Buckeye de Culex pipiens. Esta cepa se estableció originalmente en 2013 a partir de mosquitos recolectados en el campo en Columbus, Ohio y es mantenida por el laboratorio Meuti. Este protocolo se puede utilizar para estudios adicionales que requieren la edición del genoma CRISPR / Cas9 en mosquitos Culex, así como otras especies de mosquitos, y, más en general, es relevante para emplear la edición del genoma CRISPR / Cas9 para cualquier especie de insecto.

Protocolo

En la mayoría de las instituciones de investigación, debe estar en vigor un Protocolo de Bioseguridad aprobado antes de que se generen o mantengan insectos transgénicos para garantizar que los organismos genéticamente modificados no escapen o sean retirados de las instalaciones del laboratorio. También podrían aplicarse regulaciones gubernamentales adicionales. Antes de comenzar un proyecto de esta naturaleza, verifique todas las políticas y procedimientos institucionales para determinar qué documentos y aprobaciones se requieren.

1. Diseño de gRNAs y preparación de mezclas inyectables

1. Diseñe 2-5 gRNAs para cada gen objetivo, ya que algunos gRNAs funcionan mejor que otros. Los gRNAs que se dirigen a un gen de interés pueden diseñarse manualmente o se pueden usar programas gratuitos, como Chop-Chop.
2. Diseñe y ordene cebadores que amplificarán fragmentos de 100-200 pb alrededor de cada ARNg. Idealmente, el sitio de corte debe ubicarse aproximadamente en el tercio medio a la mitad del producto de PCR. Tenga en cuenta cuántos bp en cada sitio del corte se producirán.
3. Obtener gRNAs.
   1. Compre gRNAs de compañías comerciales como Integrated DNA Technologies, Fisher Scientific, Genescript y otras. Esta es la opción más fácil.
   2. Alternativamente, cree gRNAs en el laboratorio utilizando la amplificación por PCR para generar las plantillas para la síntesis isotérmica posterior. Véase el protocolo descrito por Port et al.²¹ y Kistler et al.^22.
   3. Proporcionar ARNs a través del plásmido que se inyecta en los embriones. En este caso, el ARNg debe ser impulsado por el promotor U6 (ver ^23,24 para más detalles).
4. Obtener la proteína Cas9.
   1. Ordene Cas9 comercialmente de varias compañías, incluida Fisher Scientific. Esta es la opción más fácil.
   2. Hacer proteína Cas9 y purificar en el laboratorio de acuerdo con Basu et al.²⁵ y Kistler et al.²².
   3. Inyectar ARNm Cas9 en embriones, donde posteriormente se traducirá en proteína Cas9 activa. El ARNm de Cas9 puede sintetizarse en el laboratorio utilizando la transcripción in vitro²² o comprarse a proveedores como Sigma.
      NOTA: La proteína Cas9 traducida debe contener una señal de localización nuclear (NLS) en el extremo C y, por lo tanto, la NLS también debe estar presente en el ARNm Cas9 inyectado.
   4. Expresar la proteína Cas9 in vivo a través de la expresión basada en plásmidos. En este caso, lo mejor es tener la expresión de Cas9 en el plásmido impulsada por un promotor embrionario que haya sido bien caracterizado en la especie objetivo.
      NOTA: Hasta la fecha, los promotores embrionarios no han sido bien caracterizados en los mosquitos Culex, por lo que se recomienda inyectar proteína purificada o ARNm Cas9.
5. Complejo de los gRNAs con la proteína Cas9, adaptada de Kistler et al.²².
   1. Si inyecta la proteína Cas9 con el ARNg juntos (recomendado), asegúrese de que las concentraciones finales de la proteína Cas9 son de 300 ng/μL y la concentración final de un solo ARNg es de 80 μg/μL. Mezcle la proteína y un ARNb individual en un tubo de PCR de 0,2 ml.
   2. Incubar durante 20 min sobre hielo.
6. Probar los ARNs con un ensayo in vitro (por ejemplo, Guide-it sgRNA Screening Kit).
   1. Amplificar los fragmentos alrededor del sitio de corte para cada ARNg usando PCR.
   2. Ejecute los productos de PCR en un gel para asegurarse de que tienen el tamaño correcto. Luego, purifique los productos de PCR y secuenciarlos para asegurarse de que se dirijan a la región genética correcta.
   3. Mezclar 200 ng del producto de PCR purificado sobrante con 1 μL de tampón de reacción Cas9, 1 μL de BSA, 1,5 μL de Cas9:gRNA complejado y llevar el volumen total de reacción a 15 μL. Incubar durante 5 min a 37°C.
   4. Vuelva a ejecutar el producto en un gel. Si la proteína Cas9 corta con éxito el producto de PCR, la banda primaria debe parecer más débil y deben estar presentes bandas adicionales más pequeñas. Tenga en cuenta la reducción en el tamaño del producto original de PCR y, si lo desea, calcule la reducción en la intensidad de la banda para aproximarse a la eficiencia de corte.
7. Preparación de la mezcla de inyección final
   1. Para cada ARNg que corte con éxito su producto de PCR dirigido, mezcle los volúmenes de cada Cas9 y gRNA en un tubo de 0,5 ml de tal manera que el volumen final permanezca 300 ng / μL de proteína Cas9 y 80 ng / μL de cada gRNA.
   2. Guarde el Cas9 y los gRNAs complejados a -80 °C hasta que sean necesarios para la inyección.

2. Tirar y biselar agujas

NOTA: Las inyecciones exitosas y la supervivencia de los embriones requieren agujas afiladas (Figura 1).

1. Utilice microcapilarios de borosilicato de 1 mm de diámetro exterior o de vidrio de cuarzo. Siliconar los microcapilares en una campana de humos químicos antes de ser tirados.
   1. En resumen, coloque 3 ml de Sigmacote en un vaso de precipitados de vidrio y extraiga al vacío en un segundo vaso de precipitados que contenga los microcapilarios de vidrio durante al menos 4 h, permitiendo que la solución de siliconización se vaporize y se asiente en todas las superficies de los microcapilarios.
   2. Después, permita que la cámara de vacío se iguale lentamente a la presión ambiental abriendo gradualmente la válvula de llave de paso y permitiendo que el aire regrese a la cámara. Las agujas están listas para ser tiradas.
   3. Siempre lea el manual de instrucciones de los manipuladores de agujas antes de usarlos.
      NOTA: Las instrucciones a continuación detallan cómo usar un P-2000 Laser Needle Puller para tirar de agujas de vidrio. Es importante tener en cuenta que todos los tiradores de agujas, incluso de la misma marca, no están calibrados para tirar exactamente de la misma aguja en diferentes unidades. La clave para obtener buenas agujas es comenzar en un conjunto dado de parámetros y luego tirar de las agujas utilizando parámetros que están por encima y por debajo de estos valores. Pruebe las agujas en cada uno de estos parámetros evaluando qué tan bien la aguja perfora los embriones y qué tan bien fluye la mezcla de inyección de la aguja. Refinar los parámetros hasta obtener una aguja que sea fácil de abrir o biselar, que perfore los embriones suavemente y que entregue la mezcla de inyección fácilmente.
2. Tirar de agujas con el arrancador de agujas láser P-2000
   1. Encienda el arrancador de agujas láser y permita que el láser se caliente durante 15 minutos antes del primer tirón.
   2. Programe la máquina para el tipo de tubo microcapilar de vidrio (recuerde que cualquier parámetro del arrancador de agujas es un punto de partida ya que los extracdores de agujas no están calibrados para producir la misma aguja en todos los tiradores):
      Cuarzo: Calor = 730; Fil = 4; Vel = 40; Del = 122; Pul = 156
   3. Después de programar el tirón de la aguja, cargue un microcapilary y sujete en su lugar, teniendo cuidado de tocar solo el extremo del tubo microcapilar y no el área que será calentada por el láser.
   4. Después de sujetar el microcapilar, coloque el pulgar y el índice en las barras de los dedos y luego suelte las barras de tracción presionando las liberaciones de resorte de una en una.
   5. Apriete el pulgar y el índice para unir completamente las barras.
   6. Coloque el otro lado del tubo microcapilar en su abrazadera de modo que una pequeña porción del tubo se extienda desde ambos lados. Apriete las abrazaderas asegurándose de que ambas abrazaderas estén apretadas a los dedos y que mantengan las "barras de tracción" firmemente en su lugar.
   7. Cierre la cubierta protectora del arrancador.
   8. Presione el botón Pull y el láser comenzará a calentar el vidrio, indicado por la luz roja "laser on" ubicada debajo de la cubierta. El tirón se completa cuando las barras de tracción están completamente separadas, acompañadas de un golpe metálico.
   9. Asegúrese de que la luz "láser encendida" no esté iluminada antes de levantar el sudario.
   10. Sostenga el extremo pequeño del tubo microcapilar que se extiende más allá de la abrazadera con el pulgar y el índice y afloje la abrazadera. A continuación, levante el tubo microcapilar fuera de la abrazadera.
   11. Use bórceps para colocar cuidadosamente el tubo microcapilar en una placa de Petri cuadrada forrada con cinta adhesiva de doble cara. Asegúrese de que al colocar la aguja en la caja de sujeción el extremo posterior de la aguja toque primero y que la aguja se baje suavemente en su lugar para que la punta afilada no se dañe.
3. Tirar de agujas con un arrancador de agujas PC-10/PC-100
   1. Configure el arrancador PC-10 con 4 pesos y fije la temperatura en 50,4 °C para un tirón de un solo paso.
   2. Coloque un microcapilar de vidrio de borosilicato en la abrazadera superior. Luego levante la abrazadera inferior ponderada en su posición y sujete la parte inferior del microcapilar, asegurándose de que el capilar esté en posición de tirar de dos buenas agujas. Este es un ciclo de tracción bastante largo, pero produce buenas agujas para biselar.
4. Agujas biselantes.
   NOTA: Este método de biseles húmedos proporciona información en tiempo real sobre el tamaño relativo de apertura de la aguja.
   1. Ensamble la placa abrasiva y el anillo de retención del biselador de la aguja. Asegúrese de que el lado gris de la placa abrasiva esté orientado hacia arriba entre el anillo de retención superior e inferior. Apriete los tornillos en el anillo de retención, alternando de un tornillo a otro para asegurarse de que cada tornillo se apriete uniformemente. La placa abrasiva y los anillos de retención se denominarán en lo sucesivo el conjunto de molienda.
   2. Coloque 13 gotas (~ 520 μL) de aceite de pedestal sobre la superficie plana óptica y luego coloque el conjunto de molienda en la parte superior de la placa. Coloque el conjunto debajo de un microscopio de disección y luego encienda el biselador. Se utiliza un poco de aceite extra en comparación con la recomendación de Sutter, ya que esto mantiene la placa abrasiva girando durante un período más largo cuando se usa junto con este método de biselado húmedo.
   3. Agregue una solución Photo-Flo al 1% a la superficie de molienda y mueva la mecha a su posición para que se sumerja en la solución Photo-Flo.
   4. Encienda el aire en la fuente principal. Luego coloque una aguja de borosilicato tirada en el soporte y apriete el anillo de retención. Encienda el aire en el regulador y aumente hasta que la presión haya alcanzado los 26 PSI.
   5. Observando desde un lado, baje la aguja usando la perilla de ajuste gruesa hasta que casi toque la superficie líquida de Photo-Flo.
   6. Ajuste el microscopio para localizar la aguja en el campo de visión. Comience con el aumento más bajo y aumente el aumento. Ajuste cuidadosamente la posición de la aguja usando la perilla de ajuste gruesa hasta que toque la superficie del líquido Photo-Flo.
   7. Usando la perilla de ajuste gruesa y continuando buscando bajo el microscopio, baje la aguja hasta que esté cerca de la superficie abrasiva pero sin tocarla.
   8. Usando la perilla de ajuste fino, baje cuidadosa y lentamente la aguja, prestando mucha atención a la aguja y la sombra que deja en la superficie abrasiva del biselador. Cuando la aguja y su sombra parezcan que están a punto de tocar la superficie abrasiva, continúe bajando la aguja aún más lenta y cuidadosamente.
   9. Alterne entre dejar que la aguja "bisel" la baje sobre la superficie abrasiva y luego subirla. Antes de levantar la aguja, anote rápidamente el ajuste en el micrómetro en la perilla de ajuste fino para que la aguja se pueda bajar a la misma posición o, si es necesario, a una posición ligeramente más baja. Recuerde mantener la aguja debajo de la capa líquida de Photo-Flo. Una vez que la aguja se haya elevado por encima de la superficie abrasiva, detenga y reinicie rápidamente la rotación del biselador para verificar si hay burbujas. Si la aguja ha sido biselada adecuadamente, las burbujas de aire deben fluir desde la aguja hacia el Photo-Flo. Si la placa no se detiene, es probable que las burbujas no se vuelvan visibles hasta que la abertura de la aguja sea demasiado grande.
   10. Si no aparecen burbujas cuando la aguja se eleva por encima de la superficie abrasiva y el biselador se ha detenido, repita el procedimiento de biselado, bajando la aguja a una posición ligeramente más baja en el micrómetro ubicado en la perilla de ajuste fino, levantando la aguja, deteniendo la placa de biselado y verificando si hay burbujas de aire. Repita hasta que aparezca un flujo pequeño pero constante de burbujas.
   11. Una vez que las burbujas de aire están presentes, verifique el tamaño relativo de la abertura deteniendo la placa abrasiva y bajando la presión del aire, observando el PSI en el que se detiene la formación de burbujas, ya que esta es una indicación relativa del tamaño de la abertura de las agujas biseladas. Cuanto menor sea la presión a la que el aire deja de escapar de la punta de la aguja, mayor será la abertura de la aguja. Las agujas biseladas hasta el punto en que las burbujas dejan de escapar de la aguja a 18-20 PSI indican que la aguja tiene una abertura relativamente pequeña y debe causar un daño mínimo a un embrión cuando se usa para microinyecciones.
   12. Después de verificar la abertura de la aguja, aumente la presión del aire a 26 PSI para evitar que el líquido ingrese a la aguja. Luego levante la aguja hacia arriba y fuera de la capa Photo-Flo usando la perilla de ajuste gruesa. Es importante tener en cuenta que mientras el aire fluya fuera de la aguja, el Photo-Flo no entra en la aguja y, por lo tanto, el interior de la aguja está protegido de la contaminación.
   13. Una vez que la aguja esté fuera del Photo-Flo, apague el aire y retire la aguja del soporte de la aguja.
   14. Usando fórceps, coloque la aguja recién bisecada en una placa de Petri que tenga cinta adhesiva de doble cara o arcilla de modelado para mantenerla en su lugar. Repita el proceso hasta que se hayan producido 10-20 agujas biseladas.

3. Alimentación con sangre de la generación parental de mosquitos

1. Larvas traseras de mosquitos Cx. pipiens en condiciones inequívocas de día largo (>13 h de luz / día) a 25-27 ° C para garantizar que los mosquitos no entren en su latencia o diapausa durante el invierno.
2. De siete a diez días después del pico de emergencia adulta, prepare el sistema de alimentación por membrana Hemotek conectando las unidades de calefacción a la fuente de alimentación. Ajuste la temperatura de cada unidad a 37 °C (temperatura interna del cuerpo humano) o 41 °C (temperatura corporal interna del pollo) utilizando el tornillo de ajuste en la parte superior de la unidad. Asegúrese de que se ha alcanzado la temperatura correcta utilizando un termómetro eléctrico.
3. Prepare el reservorio de harina de sangre para la alimentación.
   1. Corte un cuadrado de parafilm para cada cilindro de alimentación de sangre y frote el parafilm contra los pies descalzos. Esto proporciona aromas que son atractivos para los mosquitos.
   2. Estire la parapelícula lo más finamente posible y envuelva los bordes firmemente alrededor del depósito de harina. Si lo desea, asegúrelo en su lugar con una junta tórica de goma.
   3. Agregue aproximadamente 200 μL de solución de ATP de 0,1 M a 15 ml de sangre de pollo fresca o descongelada entera tratada con citrato de sodio. El ATP ayuda a estimular la alimentación de la sangre, y el citrato de sodio evita que la sangre se coagule.
   4. Sostenga el depósito de modo que el lado de la parapelícula esté hacia abajo y use cuidadosamente una pipeta desechable para llenar el depósito. Cada reservorio contiene ~ 3 ml de sangre. Selle los puertos de llenado con tapones de plástico.
   5. Atornille los depósitos de harina en las unidades de calefacción y colóquelos encima de la jaula para mosquitos de modo que el lado de la parapelícula esté hacia abajo y los mosquitos puedan alimentarse a través de la malla.
4. Cubra las jaulas con bolsas de basura negras para simular el anochecer y sople vigorosamente en cada jaula a medida que el aumento de la concentración de CO₂ estimula la alimentación de sangre.
5. Mantenga el comedero en la jaula durante 2-8 h para maximizar la alimentación de sangre. Verifique periódicamente y observe la proporción de mujeres que han tomado una comida de sangre (evidente por su abdomen rojo y distendido).

4. Inducir la puesta de huevos en mosquitos adultos

1. De cuatro a cinco días después de la alimentación con sangre, prepare un tubo cónico de 50 ml para la oviposición de mosquitos.
   1. Cree un orificio de ~ 20 mm cerca de la parte inferior del tubo cónico.
   2. Cubra el orificio con dos cuadrados (35 mm²) de goma de presa dental, uno con una hendidura horizontal y otro con una hendidura vertical. Use cinta adhesiva para unir los cuadrados de la presa dental al tubo cónico.
   3. Coloque un trozo de papel de filtro de 4,25 cm sobre una placa de Petri de 35 mm x 10 mm y humedezca el papel de filtro con 750 μL de agua destilada.
   4. Invierta el tubo cónico sobre el papel de filtro y gire hacia adelante y hacia atrás varias veces para asegurarse de que esté seguro.
2. Use un aspirador bucal para retirar cuidadosamente ~ 10 hembras de Cx. pipiens de su jaula y transfiéralas al tubo cónico preparado.
3. Coloque un cilindro opaco sobre el tubo cónico para proporcionar oscuridad a los mosquitos, ya que esto estimula la puesta de huevos, y espere de 20 a 25 minutos.

5. Micro-manipulación de huevos Culex recién puestos

1. Prepare el portaobjetos para unir los embriones de mosquitos para la microinyección.
   1. Coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara al ancho de un vidrio de cubierta.
   2. Coloque una tira delgada de apósito médico transparente (por ejemplo, Tegaderm, 2-3 mm de ancho) a la cinta de doble cara de modo que corra paralela al extremo corto del vidrio de la cubierta y se coloque aproximadamente a 5 mm del extremo del vidrio de la cubierta.
   3. Retire el exceso de cinta adhesiva de doble cara con una cuchilla de afeitar afilada y retire 2-3 mm de apósito médico y cinta de doble cara de cada extremo del vidrio de la cubierta. Esto permite que una capa de aceite permanezca en la corredera después de que los huevos se hayan montado en el vidrio de la cubierta.
   4. Con un lápiz de cera, dibuje una forma de "D" alrededor de la cinta de doble cara y la tira de apósito médico. Esto actuará como una barrera para mantener el agua alrededor de los huevos después de la inyección.
2. Después de que se haya preparado el tobogán y hayan transcurrido 20-25 minutos, retire el tubo opaco y determine si los mosquitos han puesto o no algún huevo.
   1. Si no es así, cúbralos durante otros 5-10 minutos.
   2. Si los mosquitos han puesto huevos, levante con cuidado pero rápidamente el tubo cónico y cúbralo con una tapa. Coloque los mosquitos en una jaula separada y registre el tiempo en que se recolectaron los huevos en una hoja de cálculo. Luego agregue 50-100 μL de agua DI al papel de filtro que contiene las balsas de huevos.
3. Bajo un microscopio de disección, alinee los huevos.
   1. Coloque un trozo de papel de filtro (rectángulos de 10 mm x 30 mm cortados de papel de filtro grueso con caudal rápido) debajo de un vidrio de cubierta de 24 mm x 40 mm de modo que el vidrio de la cubierta cubra el 50-60% del lado izquierdo del papel de filtro.
   2. Humedezca el papel de filtro con 50 μL de agua DI. El agua se extenderá lentamente debajo del vidrio de la cubierta, creando un depósito para mantener el papel de filtro y los huevos húmedos durante la micromanipulación. Se formará un menisco entre el vidrio de la cubierta y el papel de filtro cuando se aplique la cantidad correcta de agua.
   3. Separe los huevos de sus balsas de huevos con un pincel fino, y colóquelos de modo que el extremo estrecho y posterior del embrión toque el vidrio de la cubierta (izquierda) y el extremo anterior más ancho esté a la derecha.
   4. Alinee los huevos durante 20 minutos, observando cuidadosamente el cambio de su color de un blanco lechoso a un gris muy claro. Inspeccione rutinariamente la película de agua debajo del vidrio de la cubierta para asegurarse de que haya una cantidad adecuada de agua. Si los huevos parecen estar secándose, agregue una pequeña cantidad de agua DI (20-30 μL) al papel de filtro.
   5. Después de 20 minutos, deseche todos los huevos restantes.
4. Transfiera los huevos al portaobjetos de microinyección.
   1. Use un pedazo pequeño (10 mm x 30 mm) de papel de filtro grueso para absorber el agua del lado del papel de filtro saturado y retire el papel de filtro absorbente con fórceps. Repita 2-3 veces para asegurarse de que el papel de filtro con los huevos esté lo más seco posible.
   2. Coloque un rectángulo fresco y seco de papel de filtro y manténgalo en su lugar con un par de forrceps. Retire con cuidado el vidrio de la cubierta hacia la izquierda, lejos de los huevos alineados.
   3. Seque el exceso de agua en el escenario sin molestar el pequeño papel de filtro que contiene los huevos alineados. Continúe secando el papel de filtro húmedo con los huevos varias veces más, presionando los pequeños rectángulos de papel de filtro con pulgares y / o forrórceps, para asegurarse de que los huevos estén lo más secos posible antes de transferirlos al portaobjetos de inyección.
   4. Con las esrórceps, retire el papel que se retira de la tira de apósito médico de la corredera de montaje.
   5. Sostenga la diapositiva de montaje con el pulgar y el dedo medio y el apósito médico expuesto hacia abajo, y baje en un ángulo de 45 ° sobre la línea de huevos alineados. Coloque la diapositiva de tal manera que el extremo anterior más ancho de los huevos (izquierda) cuelgue ligeramente del extremo del apósito médico, ya que esto mejora la capacidad de las larvas de Culex para eclosionar con éxito de los huevos montados.
   6. Presione el dedo índice en la parte inferior del vidrio de la cubierta, mientras continúa manteniendo el vidrio de la cubierta entre el pulgar y el dedo medio, para asegurarse de que todos los huevos alineados estén firmemente unidos al apósito médico.
   7. Invierta inmediatamente el vidrio de la cubierta para que los huevos estén hacia arriba y aplique una capa delgada de aceite de halocarbono (2-3 gotas; ~ 20 μL) a los huevos. Esto evita que los huevos se descaven durante la microinyección. Retire los huevos que no estén adheridos al apósito médico o que no estén cubiertos por el aceite.
   8. Coloque la cubierta de vidrio con los huevos montados hacia arriba dentro de una placa de Petri cuadrada con un cuadrado grande de papel de filtro húmedo para el transporte para microinyección.

6. Inyección de embriones de Culex

1. Rellenar las agujas de inyección con la mezcla de inyección
   1. Elija un relleno de aguja o una punta de carga de gel que se ajuste fácilmente en el extremo posterior de la aguja de inyección seleccionada y que tenga un poco de espacio entre el extremo del relleno de la aguja y la aguja de inyección.
   2. Coloque cuidadosamente una gota única y pequeña de mezcla de inyección (~ 0.5-1 μL) en la aguja de inyección, usando el relleno de la aguja para rellenar la aguja. Coloque la gota de mezcla de inyección cerca de donde la aguja de inyección comienza a disminuir.
2. Conecte la aguja de inyección al microinyectores.
3. Coloque el portaobjetos que contiene los embriones en la etapa del microscopio.
4. Abrir la aguja
   NOTA: Si usa agujas biseladas, esto no es necesario.
   1. Utilice una presión de inyección inicial de ~ 30 PSI y ajuste según sea necesario para entregar un volumen apropiado de mezcla de inyección.
   2. Bajo un microscopio de disección, coloque la aguja sobre el embrión y use cuidadosamente el micromanipulador para bajar la aguja sobre el embrión. Una vez que la aguja apenas esté tocando el embrión, mueva rápidamente el embrión perpendicular al eje largo de la aguja.
   3. Para determinar si la aguja se abrió correctamente, presione el gatillo de inyección y vea si alguna burbuja / mezcla de inyección escapa de la aguja. De lo contrario, repita moviendo el embrión contra la aguja hasta que la aguja esté abierta y la mezcla de inyección se escape cuando se presiona el gatillo.
5. Inyección de los embriones
   1. Coloque el primer embrión en línea en el centro de visión en el microscopio y asegúrese de que esté enfocado.
   2. Coloque la aguja sobre el primer huevo, también dentro del centro del campo de visión dentro del microscopio.
   3. Aumente progresivamente la ampliación en el microscopio, bajando cuidadosamente la aguja para mantenerla justo por encima del primer embrión, centrada y enfocada. Proceda hasta que el microscopio haya alcanzado su mayor aumento y tanto el embrión como la aguja estén enfocados.
   4. Mueva con cuidado el embrión en el escenario ligeramente hacia la izquierda y baje la aguja ligeramente para que la aguja y el embrión estén ahora en el mismo plano de visión.
   5. Usando la etapa de microscopio para mover el embrión, toque cuidadosa y suavemente el embrión hasta la punta de la aguja. El extremo estrecho y posterior del embrión debe desviarse ligeramente. Ajuste la altura de la aguja si es demasiado alta o demasiado baja.
   6. Usando la etapa de microscopio, mueva el extremo posterior del embrión sobre la aguja y observe la aguja penetrando en el corion del huevo del mosquito. La aguja debe penetrar en la membrana en la ubicación aproximada de las células polares dentro de los embriones de Culex. Una vez que esto ocurra, tire del gatillo de inyección 1-3 veces para disparar la mezcla de inyección en el embrión. Administrar una pequeña cantidad de mezcla de inyección, lo suficiente como para que se pueda detectar una pequeña limpieza en el embrioplasma.
   7. Usando el escenario, mueva el embrión hacia la derecha, lejos y fuera de la punta de la aguja. Si la inyección salió bien, poco o ningún líquido debe filtrarse del embrión.
   8. Mueva la etapa hacia abajo para que el siguiente embrión en la línea se coloque frente a la aguja. Por otra parte, mueva el escenario hacia la izquierda, colocando el embrión en la aguja de inyección y aprieta el gatillo de inyección.
   9. Si la mezcla de inyección no parece estar saliendo y/o si una gran cantidad de líquido se escapa del embrión después de retirar la aguja, reemplace la aguja de inyección y comience de nuevo.
   10. Destruya los huevos no inyectados o dañados.
6. Atención a los embriones después de la inyección
   1. Después de que se hayan inyectado todos los embriones en el portaobjetos, lave el aceite de halocarbono aplicando agua de ósmosis inversa con una botella de chorro, de modo que la corriente de agua se dirija a la parte superior de la cubierta de vidrio por encima de los embriones inyectados y permita que el agua fluya por la cubierta y sobre los embriones para enjuagar el aceite. Asegúrese de no dirigir la corriente de agua directamente sobre los embriones, ya que esto puede dañarlos o separarlos del apósito médico. Este proceso elimina la mayoría, pero no todo, del aceite de halocarbono.
   2. Cubra el portaobjetos con 150 μL de agua DI.
   3. Coloque el portaobjetos con los embriones inyectados en papel de filtro húmedo dentro de una placa de Petri cuadrada.
   4. Coloque la placa de Petri que contiene los embriones inyectados en una cámara ambiental a 25-27 ° C, 70-80% HR con un fotoperíodo de día largo (> 13 h luz / día).

7. Cría de embriones inyectados (F₀₎hasta la edad adulta y establecimiento de cruces

1. Examine las diapositivas de los embriones inyectados diariamente, esperando que^1ª larva de instar emerja 1,5 días después de la inyección.
2. Cuente el número de larvas de 1^st instar y coloque 100-200 larvas en un recipiente Tupperware del tamaño de una caja de zapatos con 450 ml de agua DI y 50 mg de alimento para peces molido. En este momento, cree de 1 a 5 veces más recipientes que contengan larvas de tipo silvestre o no inyectadas que se utilizarán para cruzar con los mosquitos inyectados.
3. Alimente a las larvas diariamente, aumentando ligeramente la cantidad de alimento que reciben cada día hasta alcanzar los 300-500 mg en el^6º día de vida larvaria.
4. Una vez que aparezcan las pupas, use una pipeta de transferencia para colocar una pupa en un tubo de microcentrífuga de 2 ml lleno al 50-75% de agua DI. Repita para todas las pupas, tanto las pupas que se inyectaron como embriones como las pupas no inyectadas de tipo silvestre. Presione cuidadosamente las tapas para que estén ligeramente entreabiertas, evitando que los mosquitos escapen, pero aún permitiendo una pequeña cantidad de intercambio de gases.
5. Una vez que los mosquitos adultos emergen dentro de sus tubos de microcentrífuga, libere los mosquitos hembra inyectados en una jaula que contiene mosquitos machos vírgenes de tipo silvestre, logrando una proporción de al menos 1 macho de tipo silvestre por cada hembra inyectada. Del mismo modo, libere mosquitos machos inyectados en una jaula que contenga hembras vírgenes de tipo silvestre, logrando una proporción de aproximadamente 5-10 hembras vírgenes de tipo silvestre por cada macho inyectado. Se recomienda una mayor proporción de hembras de tipo silvestre con los machos inyectados, ya que cada mosquito macho puede aparearse varias veces. Por lo tanto, tener un mayor número de hembras de tipo salvaje que se aparean con machos inyectados aumenta el número de progenie F1 que se puede producir.

8. Obtención y cría de mosquitos F₁ y detección de mutaciones

1. De siete a diez días después de la emergencia adulta, ofrezca una comida de sangre a las hembras en cada jaula como se describió anteriormente (paso 3).
2. Cuatro días después de la alimentación con sangre, coloque agua de oviposición en cada jaula. Cada balsa de huevos representa la progenie de un solo mosquito hembra y, por lo tanto, debe colocarse en su propio recipiente de cría de plástico del tamaño de una caja de zapatos poco después de la oviposición. Etiquete cada recipiente con un identificador único e indique también que las larvas pertenecen a la generación F₁ para el gen de interés, si se inyectó al padre macho o hembra, la fecha en que se estableció la sartén, las condiciones de crianza y las iniciales del experimentador.
3. Controle las sartenes de larvas diariamente. Tan pronto como las larvas eclosionen en las sartenes, proporcione 50 mg de alimento para peces molidos. Aumente la comida diariamente durante 6 días como se describió anteriormente (paso 7.3).
4. Transfiera pupas individuales a tubos de microcentrífuga de 2 ml que contengan entre 1-1.5 ml de agua DI, etiquete cada tubo y rompa las tapas.
5. Una vez que los mosquitos adultos emergen, abra cuidadosamente el tubo de microcentrífuga de 2 ml, cubriendo con un dedo índice, y con la otra mano, coloque un vial de vidrio de 3 dram sobre la parte superior del tubo de microcentrífuga. El instinto natural del mosquito debe ser volar hacia arriba y hacia el vial de vidrio. Una vez que esto suceda, deslice un dedo sobre la abertura del vial de vidrio y invierta rápidamente, colocando una pequeña bola de algodón que se haya humedido ligeramente con una solución de sacarosa al 10% en la parte superior del vial. Esto evita que el mosquito escape y proporciona una fuente necesaria de alimento y agua.
6. Etiquete tanto el tubo que contiene la exuvia pupal como el vial de vidrio que contiene el mosquito adulto para indicar la sartén larvaria de la que se originó, el sexo del mosquito y el identificador único para ese individuo. Ej: II.C.M32, donde "II" representa que el padre macho fue inyectado, "C" representa la balsa de sartén / huevo de la que se originó el individuo, y "M32" designa que fue el 32º macho en emerger de ese contenedor de cría de larvas.
7. Coloque los mosquitos adultos dentro de sus viales de vidrio individuales de nuevo en la cámara ambiental y agregue una pequeña cantidad (~ 20 μL) de solución de sacarosa al 10% a su algodón diariamente. Asegúrese de no sobrealimentar o saturar el algodón, ya que los mosquitos se atascarán en la solución de sacarosa y morirán.
8. Detección de mosquitos para detectar la mutación deseada
   1. Extraiga ADN genómico de 5-10 exuvias pupales de cada balsa de huevos / bandeja de larvas utilizando el kit de PCR directo Phire de acuerdo con las instrucciones del fabricante, así como 1-2 individuos de tipo salvaje que servirán como control.
      NOTA: Como la descendencia de cada balsa es probablemente hermanos completos, la detección de 5-10 larvas de cada sartén determinará si la mutación se ha transmitido a la descendencia. Si ninguna de las larvas examinadas de una sartén tiene la mutación deseada, no evalúe a adultos adicionales. Si algunas de las larvas tienen la mutación, entonces cada individuo de esa sartén debe ser examinado.
   2. Usando los cebadores de PCR previamente diseñados (paso 1.2), amplifique el fragmento alrededor de la ubicación predicha de su mutación utilizando el kit de PCR Phire tanto en la progenie de tipo salvaje como en la F1 y ejecute fragmentos de PCR en un gel de agarosa al 3-4% para determinar si hay inserciones o deleciones visibles (indels).
      NOTA: Cualquier individuo que tenga la mutación deseada será heterocigoto y debe mostrar 2 bandas, un tipo salvaje y otra ligeramente más corta o más larga en la posición deseada. Para distinguirlos, compare la posición y el grosor de las bandas de los individuos de tipo salvaje con las de las bandas de la progenie F1. Idealmente, 2 bandas discretas serán visibles, pero si el indel es muy pequeño, la banda puede parecer más ancha y / o más borrosa.
   3. Purificar el producto de PCR ya sea extircando la banda que contiene los indels sospechosos (recomendado) o purificando el producto de PCR restante que no se cargó en el gel. Envíe la PCR purificada para su secuenciación para determinar si la mutación deseada está presente.

9. Obtención y cría de mosquitos F₂ y F₃ y detección de mutaciones

1. Libere todos los mosquitos adultos F₁ para los que se encontró la mutación deseada mediante la detección de su exuvia pupal de sus viales de vidrio individuales y en una jaula que contenga mosquitos de tipo silvestre no inyectados del sexo opuesto. El retrocruzamiento para esta segunda generación debería eliminar todos los efectos nocivos de la inyección y la endogamia.
2. La sangre alimenta las jaulas de los mosquitos mutantes F₁ y sus contrapartes de tipo salvaje como se describió anteriormente. Cuatro o cinco días después, recoja las balsas de huevos F₂ resultantes.
3. Etiquete y repare las larvas F₂ como se describió anteriormente, colocando cada balsa de huevos en un recipiente separado y etiquetado. Tras la pupación, separe nuevamente las pupas individuales en tubos de microcentrífuga individuales de 2 ml y transfiera a cada adulto en viales de vidrio separados cubiertos con algodón empapado en sacarosa al emerger. A continuación, examinar la exuvia pupal de cada individuo F₂ la mutación deseada como se describió anteriormente (pasos 8.5-8.8).
   NOTA: Aquí todos los individuos que tienen la mutación deseada serán heterocigotos, y por lo tanto el producto de PCR idealmente debe producir 2 bandas distintas cuando se ejecuta en un gel de agarosa al 3-4%.
4. Una vez que se hayan identificado las larvas mutantes F_2, coloque a todos los machos y hembras que tienen la mutación en la misma jaula para aparearse. La alimentación sanguínea 7-10 días después de la emergencia adulta, y 4-5 días después, recoja las balsas de huevos F_3.
5. Coloque cada balsa de huevos F₃ en un recipiente de cría de larvas separado, y etiquete y alimente como se describió anteriormente.
6. Separe las pupas F₃ en tubos de microcentrífuga individuales de 2 ml. Una vez que los adultos emergen, transfiéralos a viales de vidrio individuales cubiertos con algodón empapado en sacarosa al 10%. Examinar la exuvia pupal como se describió anteriormente. Esta vez, aproximadamente el 25% de la descendencia en cada sartén debe ser homocigota para la mutación nula. Coloque a estos individuos en una sola jaula y úselos para crear y mantener la línea mutante de mosquitos recién generada.
   NOTA: Si hay un bajo número de mosquitos homocigotos presentes, los machos y hembras heterocigotos F₃ se pueden cruzar entre sí para generar mosquitos homocigotos nulos adicionales en la generación F_4.

Resultados

Utilizando el protocolo descrito, pudimos inyectar con éxito embriones de Cx. pipiens,y observamos una alta tasa de supervivencia entre los embriones inyectados (~55%, Figura 1). Los ensayos anteriores tuvieron un porcentaje más bajo de supervivencia, probablemente porque la parte anterior del folículo del óvulo estaba unida a la tira de apósito médico, evitando que las larvas de mosquitos escaparan del corion y nadaran con éxito en el agua. Asegurar que el extremo anterior s...

Discusión

Este protocolo presenta métodos para introducir mutaciones específicas en el genoma de los mosquitos Culex y también se puede utilizar para editar el genoma de otros mosquitos. El protocolo es significativo porque proporciona detalles específicos no solo de cómo preparar los materiales de inyección, sino también una descripción detallada en video de cómo inducir a los mosquitos a poner huevos, así como cómo preparar e inyectar esos huevos. También resumimos cómo aprovechar la biología de la hembra ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Membrane Feeder	Hemotek	SP5W1-3	Company location: Blackburn, UK
ATP	Invitrogen	18330019	Company location: Carlsbad, CA, USA
Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	World Precision Instruments	1B100-6	Company Location: Sarasota, FL, USA
BV10 Needle Beveler	Sutter Instruments	BV-10-B	Company Location: Nobato, CA, USA
Whatman Circular filter paper (12.5 cm)	Sigma Aldrich	WHA1001125	Company Location: St. Louis, MO, USA
Conical tube (50 mL)	Thermo Fisher Scientific	339652	Company Location: Waltham, MA, USA
Fisherbrand course filter paper with fast flow rate	Thermo Fisher Scientific	09-800	Company Location: Waltham, MA, USA
Cover glass (24 x 40 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	Company Location: Waltham, MA, USA
Dental dam	Henry Schein Inc	1010171	Company Location: Melville, NY USA
Scotch double-sided tape	Thermo Fisher Scientific	NC0879005	Company Location: Waltham, MA, USA
FemtoJet 4i microinjector	Eppendorf	5252000021	Company Location: Hamburg, Germany
Glass vial (2 dram)	Thermo Fisher Scientific	033401C	Company Location: Waltham, MA, USA
Halocarbon oil	Sigma Aldrich	H8898-50ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle Puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Company Location: Nobato, CA, USA
Parafilm	Thermo Fisher Scientific	50-998-944	Company Location: Waltham, MA, USA
PC-100 Weighted Needle Puller	Narishige	PC-100	This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F140WH	Company Location: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%)	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	Company Location: Waltham, MA, USA
Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	Capillary Tube Supplies Limited	QGCT 1.0	Company Location: Cornwall, UK
Guide-it™ sgRNA Screening Kit	Takara, Bio USA	632639	This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
Small petri dishes (35X10 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-190-0273	Company Location: Waltham, MA, USA
Sodium citrate chicken blood	Lampire biologicals	7201406	Company Location: Everett, PA, USA
Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875711A	Company Location: Waltham, MA, USA
Tegaderm	Henry Schein Inc.	7771180	Company Location: Melville, NY USA
Tropical fish food	Tetramin	N/A
Whatman filter paper	Thermo Fisher Scientific	09-927-826	Company Location: Waltham, MA, USA
Whatman filter paper, 4.25 cm	Sigma Aldrich	1001-042	Company Location: St. Louis, MO, USA