Подготовка и инъекция эмбрионов комаров Culex для генерации нулевых мутаций с использованием CRISPR/Cas9

Резюме

CRISPR/Cas9 все чаще используется для характеристики функции генов в немоделизованных организмах. Этот протокол описывает, как генерировать нокаутирующие линии Culex pipiens,от приготовления инъекционных смесей до получения и инъекции эмбрионов комаров, а также как заводить, скрещивать и проверять введенных комаров и их потомство на желаемые мутации.

Аннотация

Комары Culex являются основными переносчиками нескольких заболеваний, которые негативно влияют на здоровье человека и животных, включая вирус Западного Нила и заболевания, вызванные филярными нематодами, такими как собачий сердечный червь и слоновост. В последнее время редактирование генома CRISPR / Cas9 было использовано для индуцирования мутаций, направленных на сайт, путем введения белка Cas9, который был комплексован с направляющей РНК (гРНК), в недавно отложенные эмбрионы нескольких видов насекомых, включая комаров, принадлежащих к родам Anopheles и Aedes. Манипулировать комарами Culex и вводить их немного сложнее, так как эти комары откладывают яйца вертикально в плотах, а не индивидуально, как другие виды комаров. Здесь мы описываем, как проектировать гРНК, комплексовать их с белком Cas9, побуждать самок комаров Culex pipiens откладывать яйца, а также как готовить и вводить недавно отложенные эмбрионы для микроинъекции Cas9 / gRNA. Мы также описываем, как выводить и проверять введенных комаров на желаемую мутацию. Репрезентативные результаты показывают, что этот метод может быть использован для индуцирования мутаций, направленных на сайт, в геноме комаров Culex и, с небольшими изменениями, может быть использован для генерации нулевых мутантов у других видов комаров.

Введение

Комары Culex распространены по всем умеренным и тропическим регионам мира и передают несколько смертельных вирусов, включая вирус Западного Нила^1,энцефалит Сент-Луиса^2, а также филярные нематоды, которые вызывают собунского сердечного червя³ и слоновость^4. Члены комплекса Culex pipiens, который включает Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens и Cx. pipiens molestus,демонстрируют поразительные различия во многих аспектах своей биологии. Например, в то время как Cx. quinquefasciatus и Cx. pipiens molestus не способны войти в зимующее спячку^5,6, Cx. pipiens pipiens демонстрируют устойчивые сезонные реакции и входят в диапаузу в ответ на короткие^{дни 7,8.} Кроме того, Cx. pipiens molestus, как правило, более антропофильны, в то время как Cx. pipiens и Cx. quinquefasciatus более зоофильны^6. Однако в Соединенных Штатах и во многих других местах мира эти виды скрещиваются, что имеет серьезные последствия для передачи болезни, поскольку гибриды Cx. pipiens pipiens и Cx. pipiens molestus являются оппортунистическими кормушками и будут кусать как птиц, так и людей^9,тем самым служа мостиками для вируса Западного Нила. Изучение этих и других увлекательных аспектов биологии комаров Culex было затруднено, отчасти потому, что комаров Culex немного сложнее вырастить в лаборатории, чем комаров Aedes, которые производят устойчивые к покоям и высыханию яйца^10, и потому, что функциональные молекулярные инструменты не так хорошо разработаны для видов Culex.

Редактирование генома CRISPR / Cas9 является мощной технологией, которая была использована для оценки биологии нескольких важных видов комаров^{11, 12,13,}включая южного домашнего комара, Culex quinquefasciatus^14,15,16. Эта технология, разработанная Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье, использует естественную бактериальную защиту от вирусов бактериальными эндонуклеазами, связанными с CRISPR (белки Cas; см. обзор Van der Oost et al.^17). При введении в эмбрионы животных белки Cas9 в сочетании с соответствующей направляющей РНК могут производить двухцепочечные разрывы в геноме. Чаще всего это делается с помощью белка Cas9, который комплексуется с направляющими РНК, которые направляют активность эндонуклеазы в определенную область генома. После того, как белок Cas9 создал специфический для сайта двухцепочечный разрыв, клеточный механизм пытается восстановить разрыв, используя один из двух механизмов. Первый влечет за собой лигирование двух концов вместе через негомологичные концевое соединение (NHEJ), которое подвержено ошибкам и часто производит внерамочные вставки и делеции в геноме, которые могут привести к нефункциональным белкам, тем самым генерируя нокаут-мутацию. В качестве альтернативы, клеточный механизм может использовать гомологическое восстановление (HDR), находя аналогичные последовательности для правильного восстановления разрыва. Аналогичная последовательность может быть обеспечена второй хромосомой в организме (см. обзор^18). Однако, если восстановленная последовательность точно соответствует исходной последовательности, белок Cas9 сможет снова разрезать ДНК. В качестве альтернативы исследователи могут также включить донорскую плазмиду, которая содержит гомологичные последовательности по обе стороны от места разреза целевой последовательности с альтернативной последовательностью репарации — часто флуоресцентным маркерным белком, модифицированной версией исходного гена или другой модификацией — которая может быть скопирована и вставлена в геном или «выбита».

Время имеет решающее значение при инъекции эмбрионов, и это особенно актуально при использовании редактирования генома CRISPR / Cas9 для создания мутаций у насекомых. Это связано с тем, что белок Cas9 и гРНК обладают наибольшей способностью генерировать мутации только тогда, когда эмбрион находится в синцитиальном состоянии, до образования клеточных мембран и когда в эмбрионе доступны несколько ядер. У комаров ядра достигают периферии ~2-4 часа после яйцекладки, в зависимости от температуры^19,и поэтому успешная микроинъекция должна произойти до этого времени. Кроме того, белок Cas9 отрежет любую ядерную ДНК, к которым он может получить доступ, так что человек, полученный в результате инъекции, будет содержать мозаику клеток, некоторые из них имеют желаемую мутацию, а другие нет. Чтобы эти мутации были успешно унаследованы, белок Cas9 должен разрезать ДНК, которая находится в зародышевой линии, которая даст начало будущим яйцеклеткам и сперматозоидам. Чтобы гарантировать, что мутации генерируются в зародышевой линии, лучше всего вводить все материалы, близкие к расположению клеток полюса внутри эмбриона, которые являются прародителями зародышевой линии насекомых. Полюсные клетки расположены вблизи заднего конца эмбрионов Culex ^20. Помимо инъекций эмбрионов, крайне важно разработать тщательный план скрещивания и скрининга потомства с целью выявления желаемой мутации.

Этот протокол описывает, как генерировать гРНК и комплексовать их с белком Cas9 для приготовления инъекционных смесей, а также как побудить самок комаров Culex pipiens откладывать яйца и как подготовить и ввести эти яйца для редактирования генома, опосредованного CRISPR / Cas9. Кроме того, мы описываем, как воспитать, скрестить и экранировать введенные эмбрионы и их потомство, чтобы подтвердить, что желаемая мутация была получена. Используя этот протокол, мы генерировали нулевые мутации для интересуемого гена, цикла,в штамме Buckeye Culex pipiens. Этот штамм был первоначально создан в 2013 году из комаров, собранных в полевых условиях в Колумбусе, штат Огайо, и поддерживается лабораторией Meuti. Этот протокол может быть использован для дополнительных исследований, которые требуют редактирования генома CRISPR / Cas9 у комаров Culex, а также других видов комаров, и, в более общем плане, имеет отношение к использованию редактирования генома CRISPR / Cas9 для любых видов насекомых.

протокол

В большинстве научно-исследовательских учреждений до того, как трансгенные насекомые будут созданы или сохранены, должен быть разработан утвержденный Протокол по биобезопасности, с тем чтобы генетически измененные организмы не сбежали или не были удалены из лабораторного объекта. Также могут применяться дополнительные правительственные постановления. Прежде чем начать проект такого рода, проверьте все институциональные политики и процедуры, чтобы определить, какие документы и разрешения требуются.

1. Проектирование гРНК и приготовление инъекционных смесей

1. Разработайте 2-5 гРНК для каждого гена-мишени, так как некоторые гРНК работают лучше, чем другие. gРНК, которые нацелены на интересующих ген, могут быть разработаны вручную или могут использоваться свободные программы, такие как Chop-Chop.
2. Спроектируйте и закажите праймеры, которые будут усиливать 100-200 фрагментов bp вокруг каждой гРНК. В идеале участок разреза должен располагаться примерно в средней трети – половине продукта ПЦР. Обратите внимание, сколько bp на каждом участке разреза будет произведено.
3. Получение гРНК.
   1. Покупайте гРНК у коммерческих компаний, таких как Integrated DNA Technologies, Fisher Scientific, Genescript и других. Это самый простой вариант.
   2. Альтернативно, создают гРНК в лаборатории с использованием амплификации ПЦР для генерации шаблонов для последующего изотермического синтеза. См. протокол, описанный Port et al.²¹ и Kistler et al.^22.
   3. Обеспечивают гРНК через плазмиду, которая вводится эмбрионам. В этом случае гРНК должна управляться промотором U6 (подробнее см. ^23,24).
4. Получите белок Cas9.
   1. Закажите Cas9 коммерчески у нескольких компаний, включая Fisher Scientific. Это самый простой вариант.
   2. Производят белок Cas9 и очищают в лаборатории в соответствии с Basu et al.²⁵ и Kistler et al.^22.
   3. Вводят мРНК Cas9 в эмбрионы, где она позже будет переведена в активный белок Cas9. МРНК Cas9 может быть либо синтезирована в лаборатории с использованием транскрипции in vitro^22, либо приобретена у таких поставщиков, как Sigma.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переведенный белок Cas9 должен содержать сигнал ядерной локализации (NLS) на С-конце, и поэтому NLS также должен присутствовать в введенной мРНК Cas9.
   4. Экспресс-белок Cas9 in vivo посредством экспрессии на основе плазмиды. В этом случае лучше всего иметь экспрессию Cas9 на плазмиде, приводимую в движение эмбриональным промотором, который был хорошо охарактеризован у целевого вида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На сегодняшний день эмбриональные промоторы не были хорошо охарактеризованы у комаров Culex, и поэтому рекомендуется вводить очищенный белок или мРНК Cas9.
5. Комплекс гРНК с белком Cas9, адаптированным из Kistler et al.^22.
   1. При введении белка Cas9 с гРНК вместе (рекомендуется) убедитесь, что конечные концентрации белка Cas9 составляет 300 нг/мкл, а конечная концентрация одной гРНК составляет 80 мкг/мкл. Смешайте белок и отдельную гРНК в ПЦР-трубке 0,2 мл.
   2. Инкубировать в течение 20 мин на льду.
6. Тестирование гРНК с помощью анализа in vitro (например, Guide-it sgRNA Screening Kit).
   1. Ампулируйте фрагменты вокруг участка разреза для каждой гРНК с помощью ПЦР.
   2. Запустите продукты ПЦР на геле, чтобы убедиться, что они имеют правильный размер. Затем очистите продукты ПЦР и секвенируйте их, чтобы убедиться, что они нацелены на правильную область гена.
   3. Смешайте 200 нг оставшегося очищенного продукта ПЦР с 1 мкл реакционного буфера Cas9, 1 мкл BSA, 1,5 мкл комплекса Cas9:gRNA и доведите общий объем реакции до 15 мкл. Инкубат в течение 5 мин при 37°C.
   4. Снова запустите продукт на геле. Если белок Cas9 успешно разрезает продукт ПЦР, первичная полоса должна казаться более слабой, и должны присутствовать дополнительные меньшие полосы. Обратите внимание на уменьшение размера исходного продукта ПЦР и, при желании, рассчитайте уменьшение интенсивности полосы для приближения эффективности резки.
7. Приготовление окончательной инъекционной смеси
   1. Для каждой гРНК, которая успешно разрезала свой целевой продукт ПЦР, смешайте объемы каждого Cas9 и гРНК в трубку объемом 0,5 мл таким образом, чтобы конечный объем оставался 300 нг / мкл белка Cas9 и 80 нг / мкл каждой гРНК.
   2. Храните комплексные Cas9 и гРНК при -80 °C до тех пор, пока они не понадобятся для инъекций.

2. Вытягивание и скос игл

ПРИМЕЧАНИЕ: Для успешных инъекций и выживания эмбрионов требуются острые иглы(рисунок 1).

1. Используйте боросиликатные микрокапилляры наружного диаметра 1 мм или микрокапилляры из кварцевого стекла. Силиконизируйте микрокапилляры в химическом вытяжке перед вытяжкой.
   1. Короче говоря, поместите 3 мл сигмакота в стеклянный стакан и вакуумом втяните во второй стакан, содержащий стеклянные микрокапилляры, в течение не менее 4 ч, позволяя силиконизизирующему раствору испаряться и оседать на всех поверхностях микрокапилляров.
   2. После этого медленно позвольте вакуумной камере выровняться с давлением окружающей среды, постепенно открывая запорный клапан и позволяя воздуху возвращаться в камеру. Затем иглы готовы к вытягивам.
   3. Всегда читайте инструкцию по эксплуатации съемников игл перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенных ниже инструкциях подробно описано, как использовать лазерный съемник для вытягивания стеклянных игл P-2000. Важно отметить, что все съемники игл, даже одной марки, не откалиброваны, чтобы тянуть одну и ту же иглу на разных единицах. Ключом к получению хороших игл является начало с заданного набора параметров, а затем вытягивание игл, используя параметры, которые выше и ниже этих значений. Проверьте иглы по каждому из этих параметров, оценив, насколько хорошо игла прокалывает эмбрионы и насколько хорошо инъекционная смесь вытекает из иглы. Уточняйте параметры до тех пор, пока не будет получена игла, которая легко открывается или скосается, которая плавно прокалывает эмбрионы и легко доставляет инъекционную смесь.
2. Вытягивание игл с помощью лазерного съемника игл P-2000
   1. Включите лазерный съемник иглы и дайте лазеру прогреться за 15 минут до первого натяжения.
   2. Запрограммировать машину для типа стеклянной микрокапиллярной трубки (Помните, что любые параметры съемника иглы являются отправной точкой, поскольку съемники игл не калибруются для получения одной и той же иглы на всех съемниках):
      Кварц: Тепло = 730; Фил = 4; Вел = 40; Del = 122; Пул = 156
   3. После программирования съемника иглы загрузите микрокапилляр и зажмите его на месте, заботясь о том, чтобы коснуться только конца микрокапиллярной трубки, а не области, которая будет нагреваться лазером.
   4. После зажима микрокапилляра поместите большой и указательный пальцы на поперечные полосы, а затем отпустите потянущие стержни, нажав на пружинные выпуски по одному.
   5. Сожмите большой и указательный пальцы, чтобы полностью стянуть бруски вместе.
   6. Расположите другую сторону микрокапиллярной трубки в ее зажиме так, чтобы небольшая часть трубки простирается с обеих сторон. Затяните зажимы, убедившись, что оба зажима плотно затянуты пальцами и что они крепко удерживают «прутья» на месте.
   7. Закройте защитный кожух на съемнике.
   8. Нажмите кнопку Pull, и лазер начнет нагревать стекло, что обозначено красным светом «laser on», расположенным под кожухом. Тяга завершается, когда тяговые стержни полностью разделены, сопровождаемые металлическим стуком.
   9. Убедитесь, что свет «лазерного включения» не загорается, прежде чем поднимать кожух.
   10. Зажмите маленький конец микрокапиллярной трубки, который выходит за пределы зажима, большим и указательным пальцами и ослабьте зажим. Затем вытяжите микрокапиллярную трубку из зажима.
   11. Используйте щипцы, чтобы аккуратно поместить микрокапиллярную трубку в квадратную чашку Петри, высточную двусторонней лентой. При помещении иглы в удерживающее поле убедитесь, что задний конец иглы касается первым, и игла осторожно опускается на место, чтобы острый наконечник не был поврежден.
3. Вытягивание игл с помощью съемника игл PC-10/PC-100
   1. Установите съемник PC-10 с использованием 4 весов и установите температуру на 50,4 °C для одноступенчатого тяги.
   2. Поместите микрокапилляр из боросиликатного стекла в верхний зажим. Затем поднимите утяжеленный нижний зажим в нужное положение и зажмите нижнюю часть микрокапилляра, убедившись, что капилляр находится в положении, чтобы вытянуть две хорошие иглы. Это довольно длинный цикл вытягивания, но он производит хорошие хвои для скоса.
4. Скосные иглы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод мокрого скоса дает обратную связь в реальном времени об относительном размере отверстия иглы.
   1. Соберите абразивную пластину и стопорное кольцо игольчатого фаского. Убедитесь, что серая сторона абразивной пластины ориентирована вверх между верхним и нижним стопорным кольцом. Затяните винты на стопорном кольце, чередуя от винта к винту, чтобы каждый винт был затянут равномерно. Абразивная пластина и стопорные кольца в дальнейшем будут называться шлифовальным агрегатом.
   2. Поместите 13 капель (~ 520 мкл) масла пьедестала на оптическую плоскую поверхность, а затем поместите шлифовальный узел поверх пластины. Поместите узел под рассекающий микроскоп, а затем включите фаск. Используется немного больше масла по сравнению с рекомендацией Саттера, так как это сохраняет вращение абразивной пластины в течение более длительного периода при использовании в сочетании с этим методом влажной скосы.
   3. Добавьте 1% раствор Photo-Flo на шлифовальную поверхность и переместите фитиль в нужное положение, чтобы он был погружен в раствор Photo-Flo.
   4. Включите эфир у основного источника. Затем поместите вытянутую боросиликатную иглу в держатель и затяните стопорное кольцо. Включите воздух у регулятора и увеличивайте до тех пор, пока давление не достигнет 26 PSI.
   5. Наблюдая со стороны, опуская иглу с помощью грубой регуляторной ручки, пока она почти не коснется поверхности жидкости Photo-Flo.
   6. Отрегулируйте микроскоп, чтобы найти иглу в поле зрения. Начните с наименьшего увеличения и увеличьте увеличение. Тщательно отрегулируйте положение иглы с помощью грубой регуляторной ручки, пока она не коснется поверхности жидкости Photo-Flo.
   7. Используя грубую регуляторную ручку и продолжая смотреть под микроскоп, опустите иглу до тех пор, пока она не приблизится к абразивной поверхности, но не коснувшись ее.
   8. Используя тонкую регуляторную ручку, осторожно и медленно опустите иглу, обращая пристальное внимание на иглу и тень, которую она оставляет на абразивной поверхности фаска. Когда игла и ее тень выглядят так, как будто они вот-вот коснутся абразивной поверхности, продолжайте опускать иглу еще медленнее и осторожно.
   9. Поочередно позволяя игле «скоситься», опуская ее на абразивную поверхность, а затем поднимая ее. Перед поднятием иглы быстро запишите настройку на микрометре на тонкой регуляторной ручке, чтобы иглу можно было опустить в то же положение или, при необходимости, в несколько более низкое положение. Не забудьте держать иглу ниже слоя жидкости Photo-Flo. После того, как игла была поднята над абразивной поверхностью, быстро остановитесь и перезапустите вращение фаска, чтобы проверить наличие пузырьков. Если игла была надлежащим образом скошена, пузырьки воздуха должны вытекать из иглы в Photo-Flo. Если пластина не остановлена, пузырьки, скорее всего, не станут видимыми, пока отверстие иглы не станет слишком большим.
   10. Если пузырьки не появляются, когда игла поднимается над абразивной поверхностью и скос остановился, повторите процедуру скоса, опустив иглу в несколько более низкое положение на микрометре, расположенном на тонкой регуляторной ручке, подняв иглу, остановив пластину фаска и проверив пузырьки воздуха. Повторяйте до тех пор, пока не появится небольшой, но устойчивый поток пузырьков.
   11. Как только пузырьки воздуха присутствуют, проверьте относительный размер отверстия, остановив абразивную пластину и понизив давление воздуха, отметив PSI, при котором образование пузырьков прекращается, так как это является относительным показателем размера отверстия скошенных игл. Чем ниже давление, при котором воздух перестает вырываться из кончика иглы, тем больше отверстие иглы. Иглы, скошенные до такой степени, что пузырьки перестают выходить из иглы при 18-20 PSI, указывают на то, что игла имеет относительно небольшое отверстие и должна нанести минимальный ущерб эмбриону при использовании для микроинъекций.
   12. После проверки отверстия иглы увеличьте давление воздуха до 26 фунтов на дюйм, чтобы предотвратить попадание жидкости в иглу. Затем поднимите иглу вверх и выйдите из слоя Photo-Flo с помощью грубой регуляторной ручки. Важно отметить, что до тех пор, пока воздух вытекает из иглы, Photo-Flo не попадает в иглу, и поэтому внутренняя часть иглы защищена от загрязнения.
   13. Как только игла выйдет из Photo-Flo, выключите воздух и извлеките иглу из держателя иглы.
   14. Используя щипцы, поместите недавно скошенную иглу в чашку Петри, которая имеет либо двустороннюю ленту, либо лепку из глины, чтобы сохранить ее на месте. Повторяйте процесс до тех пор, пока не будет изготовлено 10-20 скошенных игл.

3. Кровокормление родительского поколения комаров

1. Задние личинки комаров Cx. pipiens в однозначных условиях долгого дня (>13 ч света в день) при 25-27 °C, чтобы гарантировать, что комары не войдут в зимующее состояние покоя или диапаузу.
2. Через семь-десять дней после пика появления взрослых особей подготовьте систему питания мембраны Hemotek, подключив нагревательные блоки к источнику питания. Отрегулируйте температуру каждого устройства до 37 ° C (внутренняя температура тела человека) или 41 ° C (внутренняя температура тела курицы) с помощью регулировочного винта в верхней части устройства. Убедитесь, что с помощью электрического термометра достигнута правильная температура.
3. Подготовьте резервуар для кровяной муки для кормления.
   1. Вырежьте один квадрат парапленки для каждого цилиндра, питающего кровь, и потрите парапленку о босые ноги. Это обеспечивает ароматы, которые привлекательны для комаров.
   2. Растяните парапленку как можно тоньше, а края плотно оберните вокруг резервуара для еды. При желании закрепите на месте резиновым уплотнительным кольцом.
   3. Добавьте приблизительно 200 мкл 0,1 М раствора АТФ к 15 мл свежей или размороженой цельной куриной крови, обработанной цитратом натрия. АТФ помогает стимулировать питание крови, а цитрат натрия предотвращает свораживание крови.
   4. Держите резервуар так, чтобы сторона парапленки была обращена вниз, и осторожно используйте одноразовую пипетку, чтобы заполнить резервуар. Каждый резервуар содержит ~3 мл крови. Запечатайте заправочные отверстия пластиковыми заглушками.
   5. Вкрутите резервуары с едой в нагревательные блоки и поместите поверх клетки от комаров так, чтобы сторона парапленки была обращена вниз, и комары могли питаться через сетку.
4. Накройте клетки черными мешками для мусора, чтобы имитировать сумерки, и энергично дуйте в каждую клетку, поскольку повышенная концентрация CO₂ стимулирует кровосоточие.
5. Держите кормушку на клетке в течение 2-8 ч, чтобы максимизировать кровопитаю. Периодически проверяйте и отмечайте долю самок, которые принимали кровавую пищу (что видно по их красному и растянутым брюшкам).

4. Индуцирование яйцекладки у взрослых комаров

1. Через четыре-пять дней после кормления кровью подготовьте коническую трубку 50 мл для яйцекладки комаров.
   1. Создайте отверстие ~20 мм в нижней части конической трубки.
   2. Закройте отверстие двумя квадратами (35^мм2)из зубной плотины, один с горизонтальной щелью, а другой с вертикальной щелью. Используйте ленту для прикрепления квадратов зубной дамбы к конической трубке.
   3. Поместите лист фильтровальной бумаги размером 4,25 см на чашку Петри размером 35 мм x 10 мм и смочите фильтровальную бумагу 750 мкл дистиллированной воды.
   4. Переверните коническую трубку на фильтровальную бумагу и поверните взад и вперед несколько раз, чтобы убедиться, что она безопасна.
2. Используйте ротовой аспиратор, чтобы аккуратно удалить ~ 10 самок Cx. pipiens из их клетки и перенести их в подготовленную коническую трубку.
3. Поместите непрозрачный цилиндр над конической трубкой, чтобы обеспечить темноту для комаров, так как это стимулирует откладывание яиц, и подождите 20-25 минут.

5. Микро-манипулирование свежеотложенными яйцами Culex

1. Подготовьте слайд для прикрепления эмбрионов комара для микроинъекции.
   1. Прикрепите кусок двусторонней ленты к ширине покровного стекла.
   2. Прикрепите тонкую полоску прозрачной медицинской повязки (например, Tegaderm, шириной 2-3 мм) к двусторонней ленте таким образом, чтобы она проходила параллельно короткому концу покровного стекла и располагалась примерно в 5 мм от конца покровного стекла.
   3. Снимите лишний двусторонний скотч острым лезвием бритвы, а с каждого конца покровного стекла снимите 2-3 мм медицинской повязки и двусторонней ленты. Это позволяет слою масла оставаться на слайде после того, как яйца были установлены на покровном стекле.
   4. С помощью воскового карандаша нарисуйте форму «D» вокруг двусторонней ленты и полоски медицинской повязки. Это будет действовать как барьер для удержания воды вокруг яиц после инъекции.
2. После того, как слайд был подготовлен и прошло 20-25 минут, снимите непрозрачную трубку и определите, отложили ли комары яйца.
   1. Если нет, накройте их еще на 5-10 минут.
   2. Если комары отложили яйца, осторожно, но быстро поднимите коническую трубку и накройте крышкой. Поместите комаров в отдельную клетку и запишите время сбора яиц в электронную таблицу. Затем добавьте 50-100 мкл воды DI в фильтровальную бумагу, содержащую плоты для яиц.
3. Под рассекающим микроскопом выстраивают яйца.
   1. Поместите лист фильтровальной бумаги (прямоугольники размером 10 мм x 30 мм, вырезанные из грубой фильтровальной бумаги с высокой скоростью потока) под покровным стеклом размером 24 мм x 40 мм таким образом, чтобы покровное стекло покрывало 50-60% левой стороны фильтровальной бумаги.
   2. Смочите фильтровальную бумагу 50 мкл воды DI. Вода будет медленно распространяться под покровным стеклом, создавая резервуар для поддержания фильтровальной бумаги и яиц влажными во время микроманипуляции. Мениск образуется между покровным стеклом и фильтровальной бумагой при нанесении правильного количества воды.
   3. Отделите яйца от их яичных плотов с помощью тонкой кисти и расположите так, чтобы узкий задний конец эмбриона касался покровного стекла (слева), а более широкий, передний конец - справа.
   4. Выравнивайте яйца в течение 20 мин, внимательно наблюдая за изменением их цвета от молочно-белого до очень светло-серого. Регулярно осматривайте водяную пленку под покровным стеклом, чтобы убедиться, что есть достаточное количество воды. Если кажется, что яйца высыхают, добавьте небольшое количество воды DI (20-30 мкл) в фильтровальную бумагу.
   5. Через 20 мин выбросьте все оставшиеся яйца.
4. Перенесите яйца на микроинъекцию.
   1. Используйте небольшой (10 мм х 30 мм) кусок грубой фильтровальной бумаги, чтобы влить воду со стороны насыщенной фильтровальной бумаги и удалить фильтровальную бумагу щипцами. Повторите 2-3 раза, чтобы убедиться, что фильтровальной бумаги с яйцами как можно суше.
   2. Уложите свежий сухой прямоугольник фильтровальной бумаги и удерживайте его на месте парой щипцов. Осторожно оттяните покровное стекло влево, подальше от выровненных яиц.
   3. Высушите лишнюю воду на сцене, не нарушая маленькую фильтровальную бумагу, содержащую выровненные яйца. Продолжайте сушить влажную фильтровальную бумагу с яйцами еще несколько раз, надавливая на небольшие прямоугольники фильтровальной бумаги большими пальцами и / или щипцами, чтобы убедиться, что яйца как можно более сухие, прежде чем переносить их на слайд для инъекций.
   4. С помощью щипцов снимите бумагу с полоски медицинской повязки с монтажного слайда.
   5. Держите монтажную горку большим и средним пальцем и открытую медицинскую повязку лицом вниз и опустите под углом 45° на линию выровненных яиц. Расположите слайд так, чтобы более широкий передний конец яиц (слева) слегка свисал с конца медицинской повязки, так как это усиливает способность личинок Culex успешно вылупляться из установленных яиц.
   6. Прижмите указательный палец к нижней стороне защитного стекла, продолжая удерживать защитное стекло между большим и средним пальцами, чтобы убедиться, что все выровненные яйца прочно прикреплены к медицинской повязке.
   7. Немедленно переверните покровное стекло так, чтобы яйца были обращены вверх, и нанесите тонкий слой масла Halocarbon oil (2-3 капли; ~20 мкл) на яйца. Это предотвращает высыхание яиц во время микроинъекции. Удалите все яйца, которые не прикреплены к медицинской повязке или не покрыты маслом.
   8. Поместите стеклянную крышку с установленными яйцами лицом вверх внутри квадратной чашки Петри с большим квадратом влажной фильтровальной бумаги для транспортировки для микроинъекции.

6. Инъекция эмбрионов Culex

1. Обратное заполнение инъекционных игл инъекционной смесью
   1. Выберите игольчатый наполнитель или наконечник для загрузки геля, который будет легко вписываться в заднюю часть выбранной инъекционной иглы и будет иметь немного пространства между концом наполнителя иглы для инъекций.
   2. Осторожно поместите одну небольшую каплю инъекционной смеси (~ 0,5-1 мкл) в инъекционную иглу, используя наполнитель иглы для обратного заполнения иглы. Поместите каплю инъекционной смеси рядом с тем местом, где инъекционная игла начинает сужаться.
2. Прикрепите инъекционную иглу к микроинжектору.
3. Поместите слайд, содержащий эмбрионы, на сцену микроскопа.
4. Открытие иглы
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании скошенных игл это не обязательно.
   1. Используйте начальное давление впрыска ~30 PSI и отрегулируйте по мере необходимости, чтобы обеспечить соответствующий объем инъекционной смеси.
   2. Под рассеченным микроскопом поместите иглу над эмбрионом и осторожно используйте микроманипулятор, чтобы опустить иглу на эмбрион. Как только игла едва коснется эмбриона, быстро переместите эмбрион перпендикулярно длинной оси иглы.
   3. Чтобы определить, была ли игла успешно открыта, нажмите триггер инъекции и посмотрите, вытекают ли какие-либо пузырьки / инъекционная смесь из иглы. Если нет, повторите перемещение эмбриона против иглы до тех пор, пока игла не будет открыта, и инъекционная смесь не вырвется при нажатии на триггер.
5. Инъекция эмбрионов
   1. Поместите первый эмбрион в линию в центре поля зрения в микроскоп и убедитесь, что он находится в фокусе.
   2. Поместите иглу над первым яйцом, также в центр поля зрения в микроскопе.
   3. Постепенно увеличивайте увеличение на микроскопе, осторожно опуская иглу, чтобы держать ее чуть выше первого эмбриона, центрированного и в фокусе. Продолжайте до тех пор, пока микроскоп не достигнет своего наибольшего увеличения, и эмбрион и игла не будут в фокусе.
   4. Осторожно переместите эмбрион на сцену немного влево и слегка опустите иглу так, чтобы игла и эмбрион теперь находились в одной плоскости зрения.
   5. С помощью микроскопа ступеньки переместить эмбрион, осторожно и осторожно прикоснитесь эмбрионом к кончику иглы. Узкий задний конец эмбриона должен слегка отклоняться. Отрегулируйте высоту иглы, если она слишком высокая или слишком низкая.
   6. Используя стадию микроскопа, переместите задний конец эмбриона на иглу и наблюдайте, как игла проникает в хорион яйца комара. Игла должна просто проникать в мембрану в приблизительном расположении полюсных клеток внутри эмбрионов Culex. Как только это произойдет, нажимайте на спусковой крючок инъекции 1-3 раза, чтобы выстрелить инъекционной смесью в эмбрион. Доставить небольшое количество инъекционной смеси, ровно настолько, чтобы можно было обнаружить небольшое очищение в эмбриоплазме.
   7. Используя стадию, переместите эмбрион вправо, в сторону и от кончика иглы. Если инъекция прошла хорошо, из эмбриона должно практически не вытекать жидкость.
   8. Переместите стадию вниз так, чтобы следующий эмбрион на линии был расположен перед иглой. Затем снова переместите стадию влево, позиционируя эмбрион на инъекционную иглу и нажмите на спусковой крючок инъекции.
   9. Если инъекционная смесь, по-видимому, не выходит и / или если большое количество жидкости выходит из эмбриона после удаления иглы, замените инъекционную иглу и начните снова.
   10. Уничтожьте любые невведенные или поврежденные яйца.
6. Уход за эмбрионами после инъекции
   1. После того, как все эмбрионы на слайде были введены, смойте галогенуглеродное масло, применив воду обратного осмоса с бутылочкой для брызг, так что поток воды направляется на верхнюю часть стеклянного покрова над введенными эмбрионами и позволяет воде стекать вниз по крышке и по эмбрионам, чтобы смыть масло. Убедитесь, что поток воды не направляется непосредственно на эмбрионы, так как это может повредить или отсоедать их от медицинской повязки. Этот процесс удаляет большую часть, но не все, галогенуглеродного масла.
   2. Накройте горку 150 мкл воды DI.
   3. Поместите слайд с введенными эмбрионами на влажную фильтровальную бумагу внутри квадратной чашки Петри.
   4. Поместите чашку Петри, содержащую введенные эмбрионы, в камеру окружающей среды, установленную на 25-27 °C, 70-80% резусной влажности с длинным фотопериодом (>13 ч света в день).

7. Выращивание введенных эмбрионов (F₀₎до зрелого возраста и установка крестов

1. Ежедневно осматривайте слайды введенных эмбрионов, ожидая, что^1-я звездная личинка должна появиться через 1,5 дня после инъекции.
2. Подсчитайте количество личинок^1-й звезды и поместите 100-200 личинок в контейнер Tupperware размером с обувную коробку с 450 мл воды DI и 50 мг корма для молотых рыб. В это время создайте в 1-5 раз больше контейнеров, содержащих личинок дикого типа или без инъекций, которые будут использоваться для скрещивания с введенными комарами.
3. Кормите личинок ежедневно, немного увеличивая количество пищи, которую они получают каждый день, пока не достигнет 300-500 мг на^6-й день личиночной жизни.
4. Как только куколки появятся, используйте переносную пипетку, чтобы поместить одну куколку в микроцентрифужные трубки объемом 2 мл, заполненные на 50-75% водой DI. Повторите для всех куколок, как куколок, которые были введены в виде эмбрионов, так и неинъецированных куколок дикого типа. Осторожно прижмите крышки так, чтобы они были слегка приотжаты, предотвращая побег комаров, но все же обеспечивая небольшое количество газообмена.
5. Как только взрослые комары появляются внутри своих микроцентрифужных трубок, выпускают введенных самок комаров в клетку, содержащую диких самцов комаров, достигая соотношения по крайней мере 1 самца дикого типа на каждую введенную самку. Аналогичным образом, выпускают введенных самцов комаров в клетку, содержащую девственных самок дикого типа, достигая соотношения примерно 5-10 девственных самок дикого типа на каждого введенного самца. Рекомендуется более высокое соотношение самок дикого типа к введенным самкам, так как каждый самец комара может спариваться несколько раз. Таким образом, наличие большего количества самок дикого типа, которые спариваются с введенными самцами, увеличивает количество потомства F1, которое может быть произведено.

8. Получение и выращивание комаров F₁ и скрининг их на мутации

1. Через семь-десять дней после появления взрослых особей предложите пищу с кровью самкам в каждой клетке, как описано выше (шаг 3).
2. Через четыре дня после кровопитания поместите в каждую клетку яйцекладущую воду. Каждый яичный плот представляет собой потомство одной самки комара, и поэтому должен быть помещен в свой собственный пластиковый контейнер для выращивания обувной коробки вскоре после яйцекладки. Пометьте каждый контейнер уникальным идентификатором, а также укажите, что личинки принадлежат к поколению_F1 для интересующего гена, независимо от того, был ли введен родитель мужского или женского пола, дата создания кастрюли, условия выращивания и инициалы экспериментатора.
3. Следите за кастрюлями личинок ежедневно. Как только личинки вылупятся в кастрюлях, обеспечьте 50 мг корма для молотой рыбы. Увеличивайте питание ежедневно в течение 6 дней, как описано выше (шаг 7.3).
4. Перенесите отдельных куколок в микроцентрифужные трубки по 2 мл, содержащие от 1 до 1,5 мл воды DI, маркирует каждую трубку и трескает крышки.
5. Как только взрослые комары появятся, осторожно откройте трубку микроцентрифуги 2 мл, покрыв указательным пальцем, и другой рукой поместите стеклянный флакон размером 3 драма над верхней частью трубки микроцентрифуги. Естественный инстинкт комара должен заключаться в том, чтобы взлететь вверх и в стеклянный флакон. Как только это произойдет, проведите пальцем по отверстию стеклянного флакона и быстро перевертите его, поместив небольшой шарик хлопка, который был слегка смачен 10% раствором сахарозы, в верхнюю часть флакона. Это предотвращает побег комара и обеспечивает необходимый источник пищи и воды.
6. Пометить как трубку, содержащую эксувию куколки, так и стеклянный флакон, содержащий взрослого комара, чтобы указать личиночную кастрюлю, из которой он произошел, пол комара и уникальный идентификатор для этого человека. Например: II.C.M32, где «II» означает, что родитель мужского пола был введен, «C» представляет собой плот из кастрюли / яиц, из которого произошла особь, а «M32» обозначает, что это был^32-й самец, вышедший из этого контейнера для выращивания личинок.
7. Поместите взрослых комаров в их отдельные стеклянные флаконы обратно в камеру окружающей среды и ежедневно добавляйте небольшое количество (~ 20 мкл) 10% раствора сахарозы в их хлопок. Не перекармливайте и не насыщайте хлопок, так как комары застрянут в растворе сахарозы и погибнут.
8. Скрининг комаров на желаемую мутацию
   1. Извлеките геномную ДНК из 5-10 эксувий куколок из каждого яичного плота / кастрюли личинок с помощью набора Phire Direct PCR в соответствии с инструкциями производителя, а также 1-2 особей дикого типа, которые будут служить в качестве контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку потомство от каждого плота, вероятно, является полными братьями и сестрами, скрининг 5-10 личинок из каждой кастрюли определит, была ли мутация передана потомству. Если ни одна из экранированных личинок из одной кастрюли не имеет желаемой мутации, не проверяйте дополнительных взрослых особей. Если у некоторых личинок есть мутация, то каждая особь из этой кастрюли должна быть проверена.
   2. Используя ранее разработанные праймеры ПЦР (шаг 1.2), амплируйте фрагмент вокруг прогнозируемого местоположения вашей мутации с помощью набора Phire PCR как в потомство дикого типа, так и в потомство F1 и запустите фрагменты ПЦР на 3-4% агарозном геле, чтобы определить, есть ли какие-либо видимые вставки или делеции (indels).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любые особи, которые имеют желаемую мутацию, будут гетерозиготными и должны отображать 2 полосы, один дикий тип и один немного короче или длиннее в желаемом положении. Чтобы различить их, сравните положение и толщину полос особей дикого типа с полосами в потомство F1. В идеале будут видны 2 дискретные полосы, но если индель очень мал, полоса может показаться шире и / или размытее.
   3. Очистите продукт ПЦР либо путем иссечения полосы, содержащей предполагаемые индели (рекомендуется), либо путем очистки оставшегося продукта ПЦР, который не был загружен в гель. Отправьте очищенную ПЦР на секвенирование, чтобы определить, присутствует ли желаемая мутация.

9. Получение и выращивание комаров F₂ и F₃ и скрининг их на мутации

1. Выпустить всех взрослых комаров_F1, для которых была обнаружена желаемая мутация, путем скрининга его куколочной эксувии из их отдельных стеклянных флаконов и в клетку, содержащую комаров дикого типа, не введенных комаров противоположного пола. Бэккроссинг для этого второго поколения должен устранить все вредные последствия инъекций и инбридинга.
2. Кровь питает клетки комаров-мутантов F₁ и их диких собратьев, как описано ранее. Через четыре-пять дней соберите полученные F₂ яичных плота.
3. Маркируйте и задней панели личинок_F2, как описано выше, помещая каждый плот яиц в отдельный, маркированный контейнер. После окукливания снова разделите отдельных куколок на отдельные микроцентрифужные трубки по 2 мл и переложите каждого взрослого человека в отдельные стеклянные флаконы, укупоренные пропитанным сахарозой хлопком при появлении. Затем скрининг эксувии куколки каждого_F2 индивидуума желаемая мутация, как описано ранее (шаги 8.5-8.8).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь все особи, которые имеют желаемую мутацию, будут гетерозиготными, и поэтому продукт ПЦР должен в идеале производить 2 различные полосы при запуске на 3-4% агарозном гегле.
4. Как только мутантные личинки_{F2 будут} идентифицированы, поместите всех самцов и самок, у которых есть мутация, в одну и ту же клетку для спаривания. Кровью кормят через 7-10 дней после появления взрослых особей, а через 4-5 дней собирают_F3 яичных плотов.
5. Поместите каждый плот для яиц F₃ в отдельный контейнер для выращивания личинок, а также маркируйте и корм, как описано выше.
6. Разделите куколки F₃ на отдельные микроцентрифужные трубки по 2 мл. Как только появятся взрослые, перенесите их в отдельные стеклянные флаконы, покрытые 10% пропитанным сахарозой хлопком. Отсеивает экзувию куколок, как описано ранее. На этот раз примерно 25% потомства в каждой кастрюле должны быть гомозиготными для нулевой мутации. Поместите этих особей в одну клетку и используйте их для создания и поддержания вновь созданной мутантной линии комаров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если присутствует небольшое количество гомозиготных комаров, гетерозиготные самцы f 3 и самки могут_быть скрещены друг с другом для получения дополнительных гомозиготно-нулевых комаров в поколении F_4.

Результаты

Используя описанный протокол, мы смогли успешно ввести эмбрионы Cx. pipiens,и наблюдали высокий показатель выживаемости среди введенных эмбрионов (~55%, рисунок 1). Более ранние испытания имели более низкий процент выживаемости, вероятно, потому, что передняя часть яйцекл...

Обсуждение

Этот протокол представляет методы введения специфических мутаций в геном комаров Culex и может быть использован для редактирования генома других комаров. Протокол важен тем, что он предоставляет конкретные детали не только о том, как подготовить инъекционные материалы, но и подробн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Membrane Feeder	Hemotek	SP5W1-3	Company location: Blackburn, UK
ATP	Invitrogen	18330019	Company location: Carlsbad, CA, USA
Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	World Precision Instruments	1B100-6	Company Location: Sarasota, FL, USA
BV10 Needle Beveler	Sutter Instruments	BV-10-B	Company Location: Nobato, CA, USA
Whatman Circular filter paper (12.5 cm)	Sigma Aldrich	WHA1001125	Company Location: St. Louis, MO, USA
Conical tube (50 mL)	Thermo Fisher Scientific	339652	Company Location: Waltham, MA, USA
Fisherbrand course filter paper with fast flow rate	Thermo Fisher Scientific	09-800	Company Location: Waltham, MA, USA
Cover glass (24 x 40 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	Company Location: Waltham, MA, USA
Dental dam	Henry Schein Inc	1010171	Company Location: Melville, NY USA
Scotch double-sided tape	Thermo Fisher Scientific	NC0879005	Company Location: Waltham, MA, USA
FemtoJet 4i microinjector	Eppendorf	5252000021	Company Location: Hamburg, Germany
Glass vial (2 dram)	Thermo Fisher Scientific	033401C	Company Location: Waltham, MA, USA
Halocarbon oil	Sigma Aldrich	H8898-50ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle Puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Company Location: Nobato, CA, USA
Parafilm	Thermo Fisher Scientific	50-998-944	Company Location: Waltham, MA, USA
PC-100 Weighted Needle Puller	Narishige	PC-100	This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F140WH	Company Location: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%)	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	Company Location: Waltham, MA, USA
Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	Capillary Tube Supplies Limited	QGCT 1.0	Company Location: Cornwall, UK
Guide-it™ sgRNA Screening Kit	Takara, Bio USA	632639	This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
Small petri dishes (35X10 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-190-0273	Company Location: Waltham, MA, USA
Sodium citrate chicken blood	Lampire biologicals	7201406	Company Location: Everett, PA, USA
Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875711A	Company Location: Waltham, MA, USA
Tegaderm	Henry Schein Inc.	7771180	Company Location: Melville, NY USA
Tropical fish food	Tetramin	N/A
Whatman filter paper	Thermo Fisher Scientific	09-927-826	Company Location: Waltham, MA, USA
Whatman filter paper, 4.25 cm	Sigma Aldrich	1001-042	Company Location: St. Louis, MO, USA