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Resumen

El protocolo ha sido desarrollado para extraer eficazmente histonas intactas de materiales de hojas de sorgo para la elaboración de perfiles de modificaciones post-traslacionales de piedra histone que pueden servir como marcadores epigenéticos potenciales para ayudar a la ingeniería de cultivos resistentes a la sequía.

Resumen

Las histonas pertenecen a una familia de proteínas altamente conservadas en eucariotas. Empaquetan adn en nucleosomas como unidades funcionales de cromatina. Las modificaciones post-traslacionales (PTM) de histonas, que son altamente dinámicas y pueden ser añadidas o eliminadas por enzimas, desempeñan un papel crítico en la regulación de la expresión génica. En las plantas, los factores epigenéticos, incluidos los PTMs de histona, están relacionados con sus respuestas adaptativas al medio ambiente. Comprender los mecanismos moleculares del control epigenético puede traer oportunidades sin precedentes para soluciones innovadoras de bioingeniería. En este documento, describimos un protocolo para aislar los núcleos y purificar las histonas del tejido de la hoja de sorgo. Las histonas extraídas se pueden analizar en sus formas intactas mediante espectrometría de masas (EM) de arriba hacia abajo junto con cromatografía líquida en fase invertida (RP) en línea (LC). Se pueden identificar fácilmente combinaciones y estoquiometría de múltiples PTMs en el mismo proteoforme de piedra histone. Además, el recorte de cola de histona se puede detectar utilizando el flujo de trabajo LC-MS descendente, lo que produce el perfil ptm global de histonas centrales (H4, H2A, H2B, H3). Hemos aplicado este protocolo anteriormente para perfilar ptms de histona a partir de tejido de hoja de sorgo recogidos de un estudio de campo a gran escala, destinado a identificar marcadores epigenéticos de resistencia a la sequía. El protocolo podría adaptarse y optimizarse potencialmente para la inmunoprecipitación-secuenciación de cromatina (ChIP-seq), o para estudiar ptms de histona en plantas similares.

Introducción

Se espera que la creciente gravedad y frecuencia de la sequía afecte a la productividad de los cultivos de cereales1,2. El sorgo es un cultivo de alimentos y energía de cereales conocido por su excepcional capacidad para soportar condiciones de limitación de agua3,4. Estamos persiguiendo la comprensión mecanicista de la interacción entre el estrés por sequía, el desarrollo de plantas y la epigenética de las plantas de sorgo[Sorghum bicolor (L.) Moench]. Nuestro trabajo anterior ha demostrado fuertes conexiones entre el microbioma vegetal y la rizosfera en la aclimatación por sequía y las respuestas a nivel molecular5,6,7. Esta investigación allanará el camino para utilizar la ingeniería epigenética en la adaptación de los cultivos a futuros escenarios climáticos. Como parte de los esfuerzos en la comprensión de la epigenética, nuestro objetivo es estudiar marcadores proteicos que impactan la expresión génica dentro del organismo vegetal.

Las histonas pertenecen a una familia altamente conservada de proteínas en eucariotas que empaquetan el ADN en nucleosomas como unidades fundamentales de cromatina. Las modificaciones post-traslacionales (PTM) de histonas se regulan dinámicamente para controlar la estructura de la cromatina e influir en la expresión génica. Al igual que otros factores epigenéticos, incluyendo la metilación del ADN, los PTMs de histona desempeñan un papel importante en muchos procesos biológicos8,9. Los ensayos basados en anticuerpos, como las manchas occidentales, se han utilizado ampliamente para identificar y cuantificar los PTMs de histona. Además, la interacción de ptms histone y ADN puede ser sondeada eficazmente por inmunoprecipitación de cromatina – secuenciación (ChIP-seq)10. En ChIP-seq, la cromatina con PTM de histona dirigida específica se enriquece con anticuerpos contra ese PTM específico. Luego, los fragmentos de ADN se pueden liberar de la cromatina enriquecida y secuenciarse. Se revelan regiones de genes que interactúan con el PTM de histona objetivo. Sin embargo, todos estos experimentos dependen en gran medida de anticuerpos de alta calidad. Para algunas variantes/homólogos de histona o combinaciones de PTM, el desarrollo de anticuerpos robustos puede ser extremadamente difícil (especialmente para múltiples PTM). Además, los anticuerpos solo se pueden desarrollar si se conoce el PTM de piedra histone objetivo. 11 Por lo tanto, son necesarios métodos alternativos para la generación de perfiles globales notariados de PTMs de histona.

La espectrometría de masas (EM) es un método complementario para caracterizar los PTMs de histona, incluidos los PTM desconocidos para los que los anticuerpos no están disponibles11,12. El flujo de trabajo de EM "ascendente" bien establecido utiliza proteasas para digerir proteínas en péptidos pequeños antes de la separación de cromatografía líquida (LC) y la detección de EM. Debido a que las histonas tienen un gran número de residuos básicos (lisina y arginina), la digestión de la trippsina (proteasa específica para lisina y arginina) en el flujo de trabajo estándar de abajo hacia arriba corta las proteínas en péptidos muy cortos. Los péptidos cortos son técnicamente difíciles de analizar por LC-MS estándar, y no preservan la información sobre la conectividad y la estoquiometría de múltiples PTM. El uso de otras enzimas o etiquetado químico para bloquear la lisina genera péptidos más largos que son más adecuados para la caracterización de ptms de histona13,14.

Alternativamente, el paso de digestión se puede omitir por completo. En este enfoque de "arriba hacia abajo", los iones de proteína intactos se introducen en la EM mediante ionización de electrospray (ESI) después de la separación de LC en línea, produciendo iones de los proteoformes de histona intactos. Además, los iones (es decir, proteoformes) de interés pueden aislarse y fragmentarse en el espectrómetro de masas para producir los iones de secuencia para su identificación y localización de PTM. Por lo tanto, ms de arriba hacia abajo tiene la ventaja de preservar la información de nivel proteoforme y capturar la conectividad de múltiples PTM y truncamientos de terminales en el mismo proteoforme15,16. Los experimentos de arriba hacia abajo también pueden proporcionar información cuantitativa y ofrecer información sobre biomarcadores en el nivel de proteína intacto17. En este documento, describimos un protocolo para extraer histona de la hoja de sorgo y analizar las histonas intactas por LC-MS de arriba hacia abajo.

Los datos de ejemplo mostrados en la Figura 1 y la Figura 2 provienen de la hoja de sorgo recogida en la semana 2 después de la plantación. Aunque se espera una variación del rendimiento, este protocolo es generalmente agnóstico a condiciones específicas de la muestra. El mismo protocolo se ha utilizado con éxito para el tejido de hoja vegetal de sorgo recogido de 2, 3, 5, 8, 9 y 10 semanas después de la siembra.

Protocolo

1. Preparación de material de hoja de sorgo

NOTA: Las plantas de sorgo fueron cultivadas en suelo en el campo en Parlier, CA.

  1. Recoger las hojas de sorgo de las plantas en tubos centrífugas de 50 ml e congelar inmediatamente el tubo en nitrógeno líquido. Recoge el tejido de las hojas arrancando la tercera y cuarta hoja completamente emergida del timón primario.
    NOTA: Puede encontrar más detalles de la condición de campo, el crecimiento de la muestra y la recopilación en el informe publicado18.
  2. Moler las hojas con nitrógeno líquido y transferir inmediatamente a un tubo centrífuga.
  3. Guarde la hoja molida a -80 °C hasta su uso. Tome alrededor de 4 g de polvo de hoja crio-molida para el análisis de histona de cada muestra.

2. Preparación de tampones y materiales (3-4 h)

NOTA: Las soluciones de stock de alta concentración se pueden hacer con anticipación y almacenarse hasta su uso. Pero todos los tampones de trabajo deben ser frescos el día de la extracción (por dilución del stock y mezcla con otros contenidos) y para ser colocados en hielo durante el proceso. Todo el experimento debe realizarse a 4 °C a menos que se recose lo contrario.

  1. Preparar sacarosa de 2,5 M disolviendo 42,8 g de sacarosa (342,30 g/mol) en 15 ml de agua estéril en placa de calor en un recipiente de vidrio con agitación continua. Sube el volumen a 50 ml una vez que la sacarosa se haya disuelto por completo. Guarde la sacarosa en 4 °C hasta su uso.
  2. Prepare 1 M Tris pH 8 disolviendo 1.576 g de Tris HCl en 10 ml de H2O en un tubo centrífuga de 15 ml. Ajuste el pH con NaOH a 8 y compruébelo con papel de pH. Guárdelo a 4 °C hasta su uso.
  3. Preparar 1 M Dithiothreitol (TDT) pesando 231 mg de TDT (154,25 g/mol) y disolviéndolo en agua estéril de 1,5 ml. La TDT debe ser fresca o usar aliquots congelados almacenados.
  4. (Opcional) Prepare los inhibidores adicionales mezclando tres sales diferentes. Preparar 18,38 mg de ortodonato de sodio (183,91 g/mol) en 1 ml de agua estéril, luego preparar por separado butirato sódico añadiendo 11.008 mg de butirato de sodio (110,09 g/mol) en 1 ml de agua estéril. Preparar la sal final añadiendo 4.199 mg de flúor sódico (41,99 g/mol) en 1 ml de agua. Mezcle las tres soluciones de sal en igual volumen que la solución de stock para "inhibidores adicionales" (33 mM de cada uno de los tres productos químicos).
    NOTA: El vanadato de sodio polimeriza a concentraciones superiores a 0,1 mM bajo pH neutro. Se recomienda activar el vanadato de sodio para despolimerizarlo para su máxima eficacia siguiendo los protocolos publicados19. Alternativamente, el vanadato de sodio activado está disponible comercialmente. En este caso, el vanadato de sodio no se activó intencionalmente, por lo que la eficacia no se reduce. El vanadato de sodio activado aún no ha sido probado para este protocolo.
  5. Preparar 1 M de MgCl2 disolviendo 0,952 g de cloruro de magnesio anhidro (95,2 g/mol) en 10 ml de H2O en un tubo centrífuga de 15 ml. Conservar 1 M MgCl2 a 4 °C hasta su uso.
  6. Preparar 10% (v/v) Tritón X-100 mezclando 53,5 g de Tritón X-100 con 35 ml de agua estéril, traer hasta 50 ml con agua y almacenarlo a temperatura ambiente.
  7. Preparar 5% Tampón de guanidina pH7 (conocido como "Tampón Gdn") que se utilizará para acondicionar la resina al menos durante la noche – preparar 0,1 M de fosfato de hidrógeno potásico dibasico (K2HPO4)pesando 870 mg de K2HPO4 y disolviéndose en 50 ml de agua estéril y almacenar a 4 °C.
  8. Pesar 0,7 g de clorhidrato de guanidina y disolverse en 0,1 M K2HPO4 a un volumen final de 14 ml. Ajuste el pH a 7 comprobando con papel pH.
  9. Remoje la resina seca de intercambio débil de catión (WCX) en 5% pH tampón de guanidina 7 durante la noche. Retire el sobrenadante y rellene con un búfer Gdn fresco del 5% y sumérjalo de nuevo durante la noche para dejar que la resina se equililice por completo (hasta que el sobrenadante tenga el mismo pH que el búfer original).
  10. Antes de iniciar el experimento en la siguiente sección, mezcle los reactivos para crear eb1, EB2A y eb2B buffer basado en la Tabla 1. Agregue todos los inhibidores y la TDT frescos justo antes de su uso.
ReactivosConcentración de existenciasEB1EB2AEB2B
Volumen (mL)Volumen (mL)Volumen (mL)
Sacarosa2,5 millones4.41.250.5
Tris HCl pH81M0.250.1250.05
Tdt1M0.1250.06250.025
H2O20.2259.68754.375
comprimido inhibidor de la proteasa (PI)0.5 píldora0.5 píldora0.5 píldora
Inhibidores adicionales (opcional)33mM0.250.1250.05
MgCl2 1M0.1250.05
Tritón X10010%1.25
Volumen general25 mL12.5 mL5 ml

Tabla 1: Composición para búferes de extracción (EBs).

  1. Realice el búfer de lisis de Núcleos (NLB) basado en la Tabla 2. Prepare NLB con antelación y guárdelo a 4 °C hasta su uso. Agregue los comprimidos de PI frescos justo antes de usarlos a 1x (0,5 comprimidos por 5 ml). Consulte la Tabla 2 para ver volúmenes específicos.
NlbConcentración de existenciasVolumen (mL)
Nacl5M0.4
Tris HCl pH81M0.05
Tritón X10010%0.5
Edta0,5 millones0.2
H2O3.85
Tabletas de PI0.5 píldora
Inhibidores adicionales (opcional)33mM0.05
Volumen general5 ml

Tabla 2: Composición para el búfer de lisis de núcleos (NLB).

3. Procedimiento de aislamiento de Nuclei

NOTA: Se recomienda realizar los pasos 3.1–3.3 del primer día (2-3 h), guardar los núcleos en el búfer NLB a -80 °C y reanudar al día siguiente (o más tarde) para la purificación de proteínas (4 h). Los pasos de aislamiento de núcleos en este protocolo fueron adaptados a partir de un protocolo chIP-seq de sorgo que se utiliza en el Joint Genome Institute. Es posible que se requieran lavados adicionales y separación del gradiente de sacarosa para garantizar la pureza de los núcleos para las aplicaciones ChIP-seq.

  1. Filtración de residuos (~0,5 h)
    1. Pesar polvo de hoja molida ~ 4 g, asegurándose de que permanece congelado mediante la colocación de hielo seco o nitrógeno líquido hasta que esté listo para usar.
    2. Añadir comprimidos inhibidores de la proteasa a EB1 a una concentración final de 0,2x (0,5 comprimidos para 25 ml por muestra). Utilice un pestle de plástico en miniatura o una punta de pipeta para pre-triturar comprimidos en un tubo de microcentrífuga antes de añadir a los tampones para ayudar en la disolución de la tableta en el buffer. Para evitar la pérdida de material, agregue la tableta pi y sonice el búfer para disolver el comprimido.
    3. Agregue 20 ml de EB1 al polvo de hoja molida congelada, vórtice suave y mezcle hasta que el polvo esté completamente suspendido. Sigue mezclando suavemente durante ~10 min.
    4. Filtre a través de la malla 100, enjuagando el material filtrado dos veces con 2 ml de EB1 cada vez.
      NOTA: Tanto el filtrado como los residuos filtrados deben ser verdes. Si se realiza un seguimiento mediante un microscopio, se deben poder ver núcleos intactos y cloroplastos intactos en el filtrado en este punto. La mayoría de los desechos grandes deben estar ausentes/agotados. Mezcle tintes como el azul metileno con la muestra. Los núcleos son fácilmente observables como ~3–5 μm de diámetro esferas azul oscuro/aguamarina cuando se visualizan usando un objetivo de 20x, 40x y/o 100x. En relación con los núcleos, los cloroplastos son de tamaño similar, pero de color verdoso y a menudo de forma más ovalada. Los vacuoles también son similares a los núcleos en tamaño y forma, pero no tomarán fácilmente el tinte azul de metileno.
    5. Centrífuga el filtrado combinado a 3.000 x g durante 10 minutos a 4 °C en un rotor de cubo oscilante a restos de pellets y grandes orgánulos subcelulares, incluyendo núcleos y cloroplastos.
      NOTA: Se recomienda preparar EB2A durante este giro (véase el paso 3.2.1).
    6. Decantar el sobrenadante, tener cuidado de no molestar el pellet.
      NOTA: Como todavía no se ha añadido detergente, el pellet debe permanecer verde intenso y el sobrenadante debe ser, a lo sumo, de color verde pálido/amarillo.
  2. Lisis de orgánulos no objetivo (~0,5 h)
    1. Preparar EB2A mediante la adición de inhibidores de la proteasa a una concentración final de 0.4x (0.5 comprimidos por 12.5 mL EB2A).
    2. Resuspend el pellet de paso 3.1.6 en 5 ml de EB2A e incubar en hielo durante 10 minutos con mezcla suave.
      NOTA: La concentración de detergente debe optimizarse para lilas y cloroplastos de forma preferente, pero no para núcleos. La cantidad requerida puede variar entre los organismos. Se recomienda comprobar si hay lisis de cloroplastos y retención de núcleos intactos bajo microscopio.
    3. Centrífuga a 2.100 x g durante 15 min a 4 °C en un rotor de cubo oscilante a residuos de pellets y núcleos.
      NOTA: En esta etapa, el sobrenadante debe ser intensamente verde, y el pellet debe ser mucho menos verde que el observado en las etapas anteriores debido a la lisis de cloroplastos y liberación de clorofila en el citosol.
    4. Decantar el sobrenadante, tener cuidado de no molestar el pellet.
  3. Aislamiento de núcleos de contaminantes citoplasmáticos restantes (~0,5 h)
    1. Preparar EB2B mediante la adición de inhibidores de la proteasa a una concentración final de 1x (0,5 comprimidos por 5 ml de EB2B).
    2. Pellet nuclear crudo resuspend del paso 3.2.3 en 2 ml de EB2B.
      NOTA: EB2B no contiene Tritón X-100, por lo que no debe ocurrir lisis adicional en este momento.
    3. Centrífuga a 2.100 x g durante 15 min a 4 °C en un rotor de cubo oscilante a residuos de pellets y núcleos.
      NOTA: Los orgánulos pequeños y los componentes citoplasmáticos no deben peletizarse, por lo que deben permanecer en el sobrenadante.
    4. Decantar el sobrenadante, tener cuidado de no molestar el pellet.
    5. Resuspend el pellet utilizando 250 μL de NLB (añadir 0,5 comprimidos inhibidores de la proteasa frescos durante 5 ml).
      NOTA: El objetivo es resuspend los núcleos en una cantidad mínima de NLB sin pérdida de material significativa. Debido a que NLB es muy viscoso y los pellets contienen una gran cantidad de residuos insolubles, es muy difícil pipetear y tiende a aferrarse al interior de las puntas de la pipeta. Por esta razón, se recomienda reutilizar la misma punta de pipeta siempre que sea posible. Si se trata de material residual en una punta de pipeta, simplemente cuelgue la pipeta de un estante o estante durante ~ 1 min para permitir que la gravedad recoja el material en la abertura de la punta. No entuba agresivamente la pipeta para resuspend los pellets. En su lugar, utilice la punta de la pipeta como una varilla de agitación hasta que el material peletizado pueda aspirarse en la punta de la pipeta. Es decir, está perfectamente bien que grandes grupos de pellets permanezcan en esta etapa siempre y cuando pueda ser dibujado en una punta de pipeta.
    6. Vórtice 15 s al máximo para homogeneizar y resuspend parcialmente el material. Sonicate durante 5 min a 4 °C, luego guárdalo a -80 °C.
      NOTA: Para los pasos posteriores, tenga en cuenta que la cantidad total de NLB añadida es de 250 μL, pero el volumen aparente total de la muestra puede ser hasta el doble debido a los desechos insolubles. La muestra está congelada y descongelada para ayudar en la lisis de los núcleos.
  4. Lisis nuclei y extracción de histona (~4 h)
    1. Añadir 750 μL de 5% Tampón Gdn a la muestra descongelada. Sonicato durante 15 min a 4 °C.
    2. Transfiera la muestra a un solo tubo de 2 ml y gire 10.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
      NOTA: El sobrenadante probablemente se verá verde. Los siguientes pasos de cromatografía deben eliminar la mayoría de los pigmentos de la proteína.
    3. Mientras espera en los pasos 3.4.1 y 3.4.2, prepare la columna para la limpieza de la cromatografía de intercambio de iones. Enjuague la columna de cromatografía con 2 ml de acetonitrilo y 4 ml de agua para minimizar la contaminación en la superficie.
    4. Cargue 200 ~ 300 μL de resina WCX (precondicionada con 5% Tampón Gdn) en la columna de cromatografía. Deja que la resina se asiente. Lave cuatro veces con 1 ml de amortiguador Gdn del 5%. Mantenga el tubo y la columna sobre hielo durante el resto de los pasos de purificación.
    5. Coloque la columna de cromatografía en un tubo de recolección de 2 ml. Cargue el sobrenadante desde el paso 3.4.2 lentamente sobre el lecho de resina sin interrumpir la resina (trate de caer lentamente desde el lado de los tubos). Deje que la solución fluya por gravedad. A medida que la solución fluye a través, cargue el eluent de nuevo a la parte superior de la columna 6-8 veces para permitir la máxima unión a la resina. Entonces, deseche el eluent.
    6. Cargue 2 ml de tampón Gdn del 5% para lavar proteínas no histonas de la columna. Deseche el eluent.
    7. Elute histones con 1 mL 20% Tampón Gdn. Recoge el eluent, que contiene proteínas de histona.
    8. Utilice el filtro de espín (MWCO) de 3 kDa de corte de peso molecular (MWCO) (0,5 ml) para desalar el eluent desde el paso 3.4.6. Antes de su uso, cargue 500 μL de disolvente de lavado (0,2% de ácido fórmico en 3% ACN) y baje dos veces para limpiar el filtro.
      NOTA: Se recomienda comenzar a lavar el filtro MWCO mientras realiza los pasos de cromatografía de resina para ahorrar tiempo. Los siguientes pasos del filtro de giro toman ~3–4 h.
    9. Primera carga 500 μL de muestra de histona, girar a 14.000 x g durante ~ 25 min para reducir el volumen a ~ 100 μL. A continuación, cargue otros 400 μL de muestra y gire a 14.000 x g de nuevo durante ~25 min. Cargue los 100 μL finales de la muestra, enjuague el tubo de muestra con 300 μL de disolvente y cargue el disolvente en el filtro. Gire a 14.000 x g de nuevo durante ~25 min.
    10. Cargue 400 μL de disolvente de lavado, gire a 14.000 x g durante ~25 minutos para reducir el volumen a ~100 μL o menos. Cada ciclo reduce la concentración de sal en una quinta parte. Repita para otros tres ciclos para llevar la concentración de guanidina a ~0.01%. Invierta el filtro en un tubo de recogida limpio y gire a 1.000 x g durante 2 minutos. Guarde la muestra de histona purificada a -20 °C o -80 °C para su análisis.
      NOTA: Se recomienda girar más tiempo (30-40 min) en el último paso para minimizar el volumen de la muestra para obtener una mayor concentración. El volumen debe ser capaz de bajar a 50-70 μL.

4. Espectrometría masiva de histonas purificadas

  1. Adquisición de datos de espectrometría de masas de cromatografía líquida (LC-MS)
    1. Estimar la concentración de proteínas por ensayo de ácido bicinchoninico (BCA) siguiendo el protocolo del fabricante.
      NOTA: BCA sólo puede proporcionar una estimación de la concentración total de proteínas, pero no la calidad de la purificación de histonas. Si la instrumentación de EM no está disponible para comprobar la calidad de la purificación de histonas, se puede utilizar mancha occidental. LC de fase invertida junto con la detección de absorbancia ultravioleta de 210 nm como se describe en nuestro informe anterior también se puede utilizar20. El cromatograma se puede comparar con un estándar conocido para comprobar la calidad de la muestra. Sin embargo, diferentes organismos pueden tener diferentes perfiles de elución. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente el uso de estándares de histona de organismos similares.
    2. Conecte una columna analítica de fase invertida (RP) C18 (RP) (por ejemplo, 3 μm 300 Å, diámetro interior de columna 75 μm, diámetro exterior 360 μm, longitud 70 cm) y una columna de trampa C18 (p. ej., 3,6 μm, diámetro interior de columna 150 μm, diámetro exterior 360 μm, longitud 5 cm) a un sistema de cromatografía líquida de nanoflujo de doble bomba (por ejemplo, Waters NanoAcquity). Los disolventes binarios son A: 0.1% ácido fórmico en agua, y B: 0.1% ácido fórmico en acetonitrilo.
      NOTA: El LC de doble bomba incluye una bomba de lavado y una bomba de gradiente. Ambas bombas pasan por dos etapas en cada análisis, una etapa de captura seguida de la etapa analítica. En la etapa de captura, la bomba de lavado fluye hacia la columna de trampa y la bomba de degradado fluye hacia la columna analítica. En la etapa analítica, la columna de reventado se combina con la columna analítica y la bomba de degradado fluye hacia ambas columnas. La bomba de lavado entonces va a los residuos.
    3. Etapa de captura: Configure el método LC para cargar primero 1-2 μg de muestra de histona en la columna de reventado. Desalte la muestra por la bomba de lavado a 3 μL/min 5% disolvente B durante 10 min. Ajuste la bomba analítica a 0,3 μL/min 5% disolvente B para el equilibrio.
    4. Etapa analítica: Ajuste la bomba de gradiente (0,3 μL/min) para que comience desde el 5% B y la rampa hasta el 30% a 15 min. A continuación, aumentar al 41% B a 100 minutos antes de un lavado orgánico alto hasta un 95% B al final.
      NOTA: El degradado se puede optimizar en función de los diferentes perfiles de retención en columnas individuales. Por lo general, histonas de longitud completa elute alrededor de 30%–40% B en las condiciones de LC especificadas. Los degradados más largos se pueden utilizar para aumentar el número de espectros MS2 para capturar más proteoformas de histona.
    5. Configure el método de adquisición dependiente de datos en una EM de alta resolución (por ejemplo, Lumos thermo orbitrap fusión o similares) con capacidad de disociación de transferencia de electrones (ETD). Utilice el modo de proteína intacto y realice todas las calibraciones necesarias según lo sugerido por el fabricante. Los parámetros críticos se describen a continuación. Estos serán específicos del instrumento utilizado.
      1. MS1: rango de escaneo 600–2.000 m/z, resolución 120k (a m/z 200), 4 microscans, objetivo AGC 1E6, inyección máxima 50 ms.
      2. MS2: resolución 120k; 1 microscan; Objetivo 1E6 de AGC; MS/EM dependiente de datos: ETD alterna (tiempo de reacción de 25 ms, tiempo máximo de inyección 500 ms) y disociación colisional de mayor energía (HCD, 28% energía de colisión normalizada con energía ±5% escalonada, tiempo máximo de inyección 100 ms); ventana de aislamiento de 0,6 Da; prioridad en los estados de mayor carga.
      3. Exclusión dinámica: ventana de tiempo de 120 s, ventana de masa ±0.7 Da. Excluya los estados de cargo inferiores a 5 y los estados de carga indeterminados.
    6. Ejecute algunas inyecciones de péptidos o estándares de histona en nuevas columnas para equilibrar y comprobar el sistema, antes de ejecutar las muestras reales. Para ejecutar un gran número de muestras, agregue espacios en blanco cortos o lavados entre muestras para minimizar el transporte. Deje que las columnas se reequilibren durante 15-20 min en la condición inicial (5% disolvente B) antes de la siguiente muestra.
      NOTA: Los gradientes LC más largos y el tiempo máximo de inyección más alto para MS2 pueden mejorar la calidad espectral para identificar más proteoformas de histona.
  2. Procesamiento de datos de LC-MS e identificación proteoforme
    1. Obtenga la secuencia de proteínas (sorgo) en formato FASTA de JGI (https://genome.jgi.doe.gov) o UniProt (https://www.uniprot.org/).
    2. Utilice MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) para convertir los archivos de datos sin procesar del instrumento (*.raw) en formato mzML.
    3. Descargue TopPIC suite22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) para el procesamiento de datos. El programa se puede ejecutar en cualquiera de las líneas de comandos o a través de la interfaz gráfica.
    4. Utilice TopFD en el conjunto TopPIC para desconvolur los espectros del archivo mzML desde el paso 4.2.2. Se pueden utilizar los parámetros predeterminados. Pero la "ventana precursora" (-w) debe reducirse a 1 m/z porque se utiliza una ventana de aislamiento estrecha.
    5. Utilice TopPIC en el conjunto TopPIC para identificar proteoformas. Se pueden utilizar la mayoría de los parámetros predeterminados. Establezca el tipo de corte de espectro y proteoforme en FDR (tasa de detección falsa) y establezca el valor de corte en 0,01 (1% FDR) o como desee. Establezca la "tolerancia a errores proteoformes" en 5 (Dalton). Cargue el archivo FASTA desde el paso 4.2.1 y el archivo "*_ms2.msalign" desde el paso 4.2.4. A continuación, inicie la búsqueda.
      NOTA: El ajuste "tolerancia a errores proteoformes" combinará proteoformas con masas similares (± 5 Da) como una sola. Esto ayuda a reducir la redundancia en los recuentos de proteoformes. Sin embargo, se debe utilizar con precaución porque la tolerancia grande fusionará proteoformas con pequeñas o ninguna diferencia de masa. Este parámetro solo está disponible en toppic versión 1.3 o posterior.
    6. Los proteoformes identificados se pueden examinar en el archivo "*_proteoform.csv" o visualizarse mediante el módulo Topview en la carpeta "*_html" de la salida.
    7. La lista de proteoformas generada a partir de los pasos anteriores mediante TopPIC anota los PTMs de histona como desplazamientos de masa. Para localizar los PTMs individuales, se debe incluir una lista de modificaciones. La descripción detallada se puede encontrar en el manual de TopPIC. Como alternativa, proceda al siguiente paso para realizar un análisis de datos complementario utilizando el paquete23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics) Informed-Proteomics.
    8. Siga las instrucciones y utilice el módulo PbfGen para convertir los datos sin procesar del instrumento en un archivo PBF. A continuación, desconvolute los datos ms1 mediante el módulo ProMex para generar un archivo ms1ft (lista de características, cada característica representa una combinación única de masa y tiempo de retención).
    9. Crea un FASTA enfocado para la Proteómica Informada usando la lista de proteínas identificada de TopPIC en el paso 4.2.6.
      NOTA: Buscar en todo el genoma utilizando La proteómica informada con un gran número de PTMs variables puede ser extremadamente lenta y puede causar accidentes. Por lo tanto, se recomienda reducir el tamaño de FASTA incluyendo sólo las proteínas objetivo.
    10. Cree una lista de modificaciones de destino para buscar PTMs de histona siguiendo el formato del archivo de ejemplo. Los PTMs comunes a incluir son: acetilación de lisina, mono-metilación de lisina, di-metilación de lisina, tri-metilación de lisina, fosforilación de serina/threonina/tirosina, acetilación de proteína N-terminal, oxidación de metionina/cisteína. Para el sorgo, se debe añadir la monometilación, la ditilación y la trimetilación de proteína N-terminal.
      NOTA: La proteómica informada solo busca los PTM especificados en la lista. Si hay PTMs no especificados, es posible que el proteoforme no se identifique o pueda identificarse erróneamente a otros proteoformes. Sin embargo, la lista ptm debe mantenerse lo más corta posible para minimizar el tiempo de búsqueda.
    11. Ejecute el módulo MSPathFinder para identificar proteoformas utilizando los archivos del paso 4.2.8, el FASTA enfocado desde el paso 4.2.9 y la lista de modificaciones desde el paso 4.2.10. Se pueden utilizar los parámetros predeterminados.
    12. Los resultados se pueden visualizar en LcMsSpectator cargando todos los archivos de resultados.
      NOTA: Otras herramientas de bioinformática están disponibles para procesar y visualizar datos descendentes, cada una con sus propias fortalezas24,25,26,27,28. El sorgo y muchos otros organismos tienen información conocida limitada con respecto a los PTMs de histona en la base de datos. Utilice TopPIC primero para identificar los cambios de masa de los PTM. Este análisis puede descubrir fácilmente PTMs conocidos y desconocidos. A continuación, los PTMs detectados se pueden buscar de forma específica especificando una lista de PTM en TopPIC o con otras herramientas complementarias.

Resultados

Siguiendo el protocolo, las histonas se pueden extraer e identificar utilizando el análisis LC-MS. Los datos sin procesar y los resultados procesados están disponibles en MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) a través de la adhesión: MSV000085770. Sobre la base de los resultados de TopPIC de la muestra representativa (disponible también de MassIVE), identificamos 303 proteoformas de histona (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 y 22 proteoformos H4). También se han detectado proteoformas ribosomales co-purificadas, típicamente e...

Discusión

El protocolo presentado describe cómo extraer histonas de muestras de hoja de sorgo (o más generalmente hoja vegetal). Se espera que el rendimiento medio de la histona sea de 2-20 μg por material de hoja de sorgo de 4-5 g. Los materiales son lo suficientemente puros para el análisis de histona aguas abajo por LC-MS (principalmente histonas con ~20% contaminación de proteína ribosomal). Se puede obtener un rendimiento menor debido a variaciones de la muestra, o posibles errores de manejo/fallas en todo el protocolo....

Divulgaciones

Ninguno.

Agradecimientos

Agradecemos a Ronald Moore y Thomas Fillmore por ayudar con experimentos de espectrometría masiva, y a Matthew Monroe por la deposición de datos. Esta investigación fue financiada con subvenciones del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE) Investigación Biológica y Ambiental a través del proyecto epigenético control de la respuesta a la sequía en sorgo (EPICON) bajo el número de premio DE-SC0014081, del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), y a través del Joint BioEnergy Institute (JBEI), una instalación patrocinada por doe (Contrato DE-AC02-05CH11231) entre el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley y el DOE. La investigación se realizó utilizando el Laboratorio de Ciencias Moleculares Ambientales (EMSL) (grid.436923.9), un Doe Office of Science User Facility patrocinado por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileFisher ChemicalA955-4L
Dithiothreitol (DTT)Sigma43815-5G
EDTA, 500mM Solution, pH 8.0EMD Millipore Corp324504-500mL
Formic AcidThermo Scientific28905
Guanidine HydrochlorideSigmaG3272-100G
MgCl2SigmaM8266-100G
Potassium phosphate, dibasicSigmaP3786-100G
Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tabletsRoche5892791001
Sodium butyrateSigma303410-5GUsed for histone deacetylase inhibitor
Sodium Chloride (NaCl)SigmaS1888
Sodium FluorideSigmaS7020-100GUsed for phosphatase inhibitor
Sodium OrthovanadateSigma450243-10GUsed for phosphatase inhibitor
SucroseSigmaS7903-5KG
Tris-HClFisher ScientificBP153-500 g
Triton X-100SigmaT9284-100ML
Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)Bio-Rad142-5842
Disposables
Chromatography column (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
Mesh 100 filter clothMillipore SigmaNY1H09000This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.
Micropipette tips (P20, P200, P1000)Sigma
Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, ConicalGenesee Scientific28-103
Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mLSigma
Equipment
Analytical BalanceFisher Scientific01-912-401
Beakers (50mL – 2L)
Microcentrifuge with coolingFisher Scientific13-690-006
Micropipettes
Swinging-bucket centrifuge with coolingFisher Scientific
VortexFisher Scientific50-728-002
Water bath SonicatorFisher Scientific15-336-120

Referencias

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