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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Protokoll wurde entwickelt, um intakte Histone effektiv aus Sorghumblattmaterialien für die Profilierung von histonenposttranslationalen Modifikationen zu extrahieren, die als potenzielle epigenetische Marker dienen können, um die Konstruktion von dürreresistenten Kulturen zu unterstützen.

Zusammenfassung

Histone gehören zu einer Familie von hochkonservierten Proteinen in Eukaryoten. Sie packen DNA als funktionelle Chromatineinheiten in Nukleosomen ein. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen, die hochdynamisch sind und durch Enzyme hinzugefügt oder entfernt werden können, spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Genexpression. In Pflanzen stehen epigenetische Faktoren, einschließlich Histon-PTMs, im Zusammenhang mit ihren adaptiven Reaktionen auf die Umwelt. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der epigenetischen Kontrolle kann beispiellose Chancen für innovative Bioengineering-Lösungen mit sich bringen. Hierin beschreiben wir ein Protokoll, um die Kerne zu isolieren und Histone aus Sorghumblattgewebe zu reinigen. Die extrahierten Histone können in ihren intakten Formen durch Top-Down-Massenspektrometrie (MS) gekoppelt mit der Online-Rektokphase (RP) Flüssigchromatographie (LC) analysiert werden. Kombinationen und Stoichiometrie mehrerer PTMs auf demselben Histonproteoform können leicht identifiziert werden. Darüber hinaus kann Histonschwanzclipping mit dem Top-Down-LC-MS-Workflow erkannt werden, wodurch das globale PTM-Profil von Kernhistonen (H4, H2A, H2B, H3) entsteht. Wir haben dieses Protokoll zuvor angewendet, um Histon-PTMs aus Sorghumblattgewebe zu profilieren, das aus einer groß angelegten Feldstudie gesammelt wurde, um epigenetische Marker der Dürreresistenz zu identifizieren. Das Protokoll könnte möglicherweise für die Chromatin-Immunpräzipationssequenzierung (ChIP-seq) oder für die Untersuchung von Histon-PTMs in ähnlichen Pflanzen angepasst und optimiert werden.

Einleitung

Die zunehmende Schwere und Häufigkeit der Dürre dürfte sich auf die Produktivität der Getreidepflanzenauswirken 1,2. Sorghum ist eine Getreidenahrungs- und Energiepflanze, die für ihre außergewöhnliche Fähigkeit bekannt ist, wasserbegrenzenden Bedingungen standzuhalten3,4. Wir verfolgen ein mechanistisches Verständnis des Zusammenspiels von Dürrestress, Pflanzenentwicklung und Epigenetik von Sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] Pflanzen. Unsere bisherige Arbeit hat starke Verbindungen zwischen Pflanzen- und Rhizosphärenmikrobiom bei der Dürreakklimatisierung und Reaktionen auf molekularer Ebene5,6,7gezeigt. Diese Forschung wird den Weg für die Nutzung epigenetischer Technik bei der Anpassung von Pflanzen an zukünftige Klimaszenarien ebnen. Als Teil der Bemühungen um das Verständnis der Epigenetik wollen wir Proteinmarker untersuchen, die die Genexpression innerhalb des Pflanzenorganismus beeinflussen.

Histone gehören zu einer hochkonservierten Familie von Proteinen in Eukaryoten, die DNA als grundlegende Chromatineinheiten in Nukleosomen verpacken. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen werden dynamisch reguliert, um die Chromatinstruktur zu steuern und die Genexpression zu beeinflussen. Wie andere epigenetische Faktoren, einschließlich DNA-Methylierung, spielen Histon-PTMs eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen8,9. Antikörperbasierte Assays wie Western Blots wurden häufig verwendet, um Histon-PTMs zu identifizieren und zu quantifizieren. Darüber hinaus kann die Wechselwirkung von Histon-PTMs und DNA durch Chromatin-Immunpräzipitation – Sequenzierung (ChIP-seq)10effektiv untersucht werden. In ChIP-seq wird Chromatin mit spezifischem gezielten Histon PTM durch Antikörper gegen diese spezifische PTM angereichert. Dann können die DNA-Fragmente aus dem angereicherten Chromatin freigesetzt und sequenziert werden. Regionen von Genen, die mit dem gezielten Histon PTM interagieren, werden aufgedeckt. Alle diese Experimente sind jedoch stark auf hochwertige Antikörper angewiesen. Bei einigen Histonvarianten/Homologen oder Kombinationen von PTMs kann die Entwicklung robuster Antikörper (besonders bei mehreren PTMs) äußerst anspruchsvoll sein. Darüber hinaus können Antikörper nur entwickelt werden, wenn der gezielte Histon PTM bekannt ist. 11 Daher sind alternative Methoden für eine ungezielte, globale Profilierung von Histon-PTMs erforderlich.

Massenspektrometrie (MS) ist eine ergänzende Methode zur Charakterisierung von Histon-PTMs, einschließlich unbekannter PTMs, für die Antikörper nicht verfügbar sind11,12. Der etablierte "Bottom-up"-MS-Workflow verwendet Proteasen, um Proteine vor der Flüssigkeitschromatographie (LC) Trennung und MS-Erkennung in kleine Peptide zu verdauen. Da Histone eine große Anzahl von Grundrückständen (Lysin und Arginin) aufweisen, schneidet die Trypsinverdauung (proteasespezifisch für Lysin und Arginin) im Standard-Bottom-up-Workflow die Proteine in sehr kurze Peptide. Die kurzen Peptide sind technisch schwierig zu analysieren von Standard-LC-MS, und bewahren nicht die Informationen über die Konnektivität und Stoichiometrie von mehreren PTMs. Die Verwendung anderer Enzyme oder chemische Etikettierung zur Blockierung von Lysinen erzeugt längere Peptide, die besser für die Charakterisierung von Histon-PTMs13,14geeignet sind.

Alternativ kann der Verdauungsschritt komplett weggelassen werden. Bei diesem "Top-down"-Ansatz werden intakte Proteinionen durch Elektrospray-Ionisation (ESI) nach Online-LC-Trennung in die MS eingeführt, wodurch Ionen der intakten Histonproteoformen entstehen. Darüber hinaus können Ionen (d.h. Proteoformen) von Interesse isoliert und im Massenspektrometer fragmentiert werden, um die Sequenzionen zur Identifizierung und PTM-Lokalisierung zu erhalten. Daher hat MS von oben nach unten den Vorteil, die Informationen auf Proteoform-Ebene beizubehalten und die Konnektivität mehrerer PTMs und Terminalkürzungen auf derselben Proteoform15,16zu erfassen. Top-down-Experimente können auch quantitative Informationen liefern und Einblicke in Biomarker auf dem intakten Proteinlevel17bieten. Hierin beschreiben wir ein Protokoll, um Histon aus Sorghumblatt zu extrahieren und die intakten Histone von oben nach unten LC-MS zu analysieren.

Die in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellten Beispieldaten stammen aus Sorghumblättern, die in Woche 2 nach der Pflanzung gesammelt wurden. Obwohl eine Variation des Ertrags erwartet wird, ist dieses Protokoll im Allgemeinen agnostisch für bestimmte Probenbedingungen. Das gleiche Protokoll wurde erfolgreich für Sorghum Pflanzenblattgewebe von 2, 3, 5, 8, 9 und 10 Wochen nach der Pflanzung gesammelt verwendet.

Protokoll

1. Herstellung von Sorghumblattmaterial

HINWEIS: Die Sorghumpflanzen wurden im Boden auf dem Feld in Parlier, CA angebaut.

  1. Sorghumblätter von Pflanzen in 50 ml Zentrifugenrohre sammeln und das Rohr sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Sammeln Sie Blattgewebe, indem Sie das dritte und vierte vollständig herausgetretene Blatt aus dem Primärfräser abreißen.
    HINWEIS: Weitere Einzelheiten zu Feldzustand, Stichprobenwachstum und Sammlung finden Sie im veröffentlichten Bericht18.
  2. Blätter mit flüssigem Stickstoff schleifen und sofort in ein Zentrifugenrohr geben.
  3. Lagern Sie das gemahlene Blatt bei -80 °C, bis es verwendet wird. Nehmen Sie etwa 4 g Kryo-Gemahlenblattpulver für die Histonanalyse jeder Probe.

2. Vorbereiten von Puffern und Materialien (3–4 h)

HINWEIS: Die hochkonzentrierten Lagerlösungen können im Voraus hergestellt und bis zum Gebrauch gelagert werden. Alle Arbeitspuffer müssen jedoch am Tag der Extraktion (durch Verdünnung aus dem Lager und Mischen mit anderen Inhalten) frisch gemacht und während des Prozesses auf Eis gelegt werden. Das gesamte Experiment sollte bei 4 °C durchgeführt werden, sofern nichts anderes empfohlen wird.

  1. 2,5 M Saccharose vorbereiten, indem 42,8 g Saccharose (342,30 g/mol) in 15 ml sterilem Wasser auf der Wärmeplatte in einem Glasbehälter unter kontinuierlichem Rühren gelöst werden. Erhöhen Sie das Volumen auf 50 ml, sobald sich die Saccharose vollständig aufgelöst hat. Bewahren Sie die Saccharose in 4 °C bis zur Verwendung auf.
  2. Bereiten Sie 1 M Tris pH 8 vor, indem Sie 1.576 g Tris HCl in 10 mlH2O in einem 15 ml Zentrifugenrohr auflösen. PH mit NaOH auf 8 einstellen und mit pH-Papier überprüfen. Lagern Sie es bei 4 °C bis zum Gebrauch.
  3. 1 M Dithiothreitol (DTT) mit einem Gewicht von 231 mg DTT (154,25 g/mol) vorbereiten und in 1,5 ml sterilem Wasser auflösen. DTT muss frisch gemacht werden oder gelagerte gefrorene Aliquots verwenden.
  4. (Optional) Bereiten Sie die zusätzlichen Inhibitoren durch Mischen von drei verschiedenen Salzen vor. 18,38 mg Natriumorthovanadate (183,91 g/mol) in 1 ml sterilem Wasser zubereiten, dann separat Natriumbutyrat zubereiten, indem 11,008 mg Natriumbutyrat (110,09 g/mol) in 1 ml sterilem Wasser zusetzen. Bereiten Sie das endige Salz vor, indem Sie 4,199 mg Natriumfluorid (41,99 g/mol) in 1 ml Wasser hinzufügen. Mischen Sie die drei Salzlösungen in gleichem Volumen als Stammlösung für "zusätzliche Inhibitoren" (33 mM jeder der drei Chemikalien).
    HINWEIS: Natriumvanadate polymerisiert bei Konzentrationen von mehr als 0,1 mM unter neutralem pH-Wert. Es wird empfohlen, Natriumvanadate zu aktivieren, um es für maximale Wirksamkeit nach veröffentlichten Protokollen19zu depolymerisieren. Alternativ ist aktiviertes Natriumvanadate im Handel erhältlich. Hierbei wurde Natriumvanadate nicht absichtlich aktiviert, so dass die Wirksamkeit nicht reduziert wird. Aktiviertes Natriumvanadate wurde noch nicht auf dieses Protokoll getestet.
  5. 1 M MgCl2 vorbereiten, indem man 0,952 g wasserfreies Magnesiumchlorid (95,2 g/mol) in 10 mlH2O in einem 15 ml Zentrifugenrohr auflöst. 1 M MgCl2 bei 4 °C bis zum Gebrauch lagern.
  6. Bereiten Sie 10% (v/v) Triton X-100 vor, indem Sie 53,5 g Triton X-100 mit 35 ml sterilem Wasser mischen, bis zu 50 ml mit Wasser bringen und bei Raumtemperatur lagern.
  7. 5% Guanidinpuffer pH7 (als "Gdn-Puffer" bezeichnet), die verwendet werden, um das Harz mindestens über Nacht zu konditionieren – 0,1 M Kaliumhydrogenphosphat-Dibasis (K2HPO4) vorbereiten, indem Sie 870 mgK2HPO4 wiegen und sich in 50 ml sterilem Wasser auflösen und bei 4 °C speichern.
  8. 0,7 g Guanidinhydrochlorid wiegen und in 0,1 M K2HPO4 auf ein Endvolumen von 14 ml auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7 ein, indem Sie mit pH-Papier überprüfen.
  9. Das trockene schwache Kationenaustauschharz (WCX) in 5% Guanidinpuffer pH 7 über Nacht einweichen. Entfernen Sie den Überstand und füllen Sie ihn mit einem frischen 5% Gdn-Puffer auf und tränken Sie ihn über Nacht erneut, damit das Harz vollständig ausgeglichen wird (bis der Überstand den gleichen pH-Wert wie der ursprüngliche Puffer hat).
  10. Bevor Sie mit dem Experiment im nächsten Abschnitt beginnen, mischen Sie die Reagenzien, um EB1, EB2A und EB2B-Puffer auf der Grundlage von Tabelle 1herzustellen. Fügen Sie alle Inhibitoren und DTT frisch kurz vor der Verwendung.
ReagenzienLagerkonzentrationEB1EB2AEB2B
Volumen (mL)Volumen (mL)Volumen (mL)
Saccharose2,5 Mio.4.41.250.5
Tris HCl pH81M0.250.1250.05
Dtt1M0.1250.06250.025
H2O20.2259.68754.375
Protease-Hemmer (PI)-Tablette0.5 Pille0.5 Pille0.5 Pille
Zusätzliche Inhibitoren (optional)33mM0.250.1250.05
MgCl2 1M0.1250.05
Triton X10010%1.25
Gesamtvolumen25 ml12,5 ml5 mL

Tabelle 1: Zusammensetzung für Extraktionspuffer (EBs).

  1. Erstellen Sie den Nuclei Lysis Buffer (NLB) basierend auf Tabelle 2. NLB im Voraus vorbereiten und bei 4 °C bis zur Verwendung aufbewahren. Fügen Sie PI Tabletten kurz vor Gebrauch mit 1x (0,5 Tablette pro 5 ml) frisch hinzu. Siehe Tabelle 2 für bestimmte Volumes.
NlbLagerkonzentrationVolumen (mL)
Nacl5M0.4
Tris HCl pH81M0.05
Triton X10010%0.5
Edta0,5 Mio.0.2
H2O3.85
PI-Tabletten0.5 Pille
Zusätzliche Inhibitoren (optional)33mM0.05
Gesamtvolumen5 mL

Tabelle 2: Zusammensetzung für den Kernlysepuffer (NLB).

3. Nuklei-Isolationsverfahren

HINWEIS: Es wird empfohlen, die Schritte 3.1–3.3 des ersten Tages (2–3 h) durchzuführen, die Kerne im NLB-Puffer bei -80 °C zu speichern und am nächsten Tag (oder später) zur Proteinreinigung (4 h) fortzufahren. Die Kernisolationsschritte in diesem Protokoll wurden von einem Sorghum ChIP-seq-Protokoll angepasst, das am Joint Genome Institute verwendet wird. Zusätzliche Wässer- und Saccharosegradiententrennung können erforderlich sein, um die Reinheit der Kerne für ChIP-seq-Anwendungen zu gewährleisten.

  1. Filtration von Schmutz (0,5 h)
    1. Wiegen Sie gemahlenes Blattpulver von 4 g, um sicherzustellen, dass es gefroren bleibt, indem Sie es auf Trockeneis oder flüssigen Stickstoff legen, bis es gebrauchsfertig ist.
    2. Fügen Sie Protease-Hemmer-Tabletten zu EB1 zu einer Endkonzentration von 0,2x hinzu (0,5 Tabletten für 25 ml pro Probe). Verwenden Sie einen Miniatur-Kunststoff-Stößel oder eine Pipettenspitze, um Tabletten in einem Mikrozentrifugenrohr vorzuzerkleinern, bevor Sie Puffer hinzufügen, um bei der Auflösung der Tablette im Puffer zu helfen. Um Materialverlust zu vermeiden, fügen Sie die PI-Tablette hinzu und beschallen Sie den Puffer, um die Tablette aufzulösen.
    3. 20 ml EB1 in das gefrorene gemahlene Blattpulver geben, sanft wirbeln und mischen, bis das Pulver vollständig aufgehängt ist. Mischen Sie vorsichtig für ca. 10 min.
    4. Filtern Sie durch Netz 100 und spülen Sie das gefilterte Material zweimal mit jeweils 2 ml EB1.
      HINWEIS: Sowohl der Filtrat als auch der gefilterte Schmutz sollten grün sein. Bei der Verfolgung mit einem Mikroskop sollte man an dieser Stelle intakte Kerne und intakte Chloroplasten im Filtrat sehen können. Die Mehrheit der großen Trümmer sollte fehlen/erschöpft sein. Mischen Sie Farbstoffe wie Methylenblau mit Probe. Kerne sind leicht zu beobachtbar, wenn sie mit einem 20x-, 40x- und/oder 100x-Objektiv visualisiert werden. Im Verhältnis zu Kernen sind Chloroplasten ähnlich groß, aber grünlich in der Farbe und oft ovaler in der Form. Vacuolen ähneln auch Kernen in Größe und Form, aber sie nehmen den blauen Methylenfarbstoff nicht ohne weiteres auf.
    5. Zentrifugieren Sie das kombinierte Filtrat bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C in einem schwingenden Schaufelrotor zu Pelletresten und großen subzellulären Organellen, einschließlich Kernen und Chloroplasten.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, EB2A während dieser Drehung vorzubereiten (siehe Schritt 3.2.1).
    6. Dekant den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
      HINWEIS: Da noch kein Waschmittel hinzugefügt wurde, sollte das Pellet intensiv grün bleiben und der Überstand sollte höchstens hellgrün/gelb sein.
  2. Lyse von Nicht-Ziel-Organellen (0,5 h)
    1. Bereiten Sie EB2A vor, indem Sie Protease-Inhibitoren zu einer Endkonzentration von 0,4x (0,5 Tablette pro 12,5 ml EB2A) hinzufügen.
    2. Das Pellet von Schritt 3.1.6 in 5 ml EB2A wieder aufsetzen und 10 min mit sanftem Mischen auf Eis brüten.
      HINWEIS: Die Waschmittelkonzentration muss optimiert werden, um intakte Zellen und Chloroplasten bevorzugt zu lysieren, jedoch keine Kerne. Die benötigte Menge kann je nach Organismen variieren. Es wird empfohlen, unter dem Mikroskop auf Lyse von Chloroplasten und die Retention intakter Kerne zu überprüfen.
    3. Zentrifuge bei 2.100 x g für 15 min bei 4 °C in einem schwingenden Schaufelrotor zu Pelletschutt und Kernen.
      HINWEIS: In diesem Stadium sollte der Überstand stark grün sein, und das Pellet sollte aufgrund der Lyse von Chloroplasten und Chlorophyllfreisetzung in das Zytosol viel weniger grün sein als in den vorherigen Stadien beobachtet.
    4. Dekant den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
  3. Isolierung von Kernen von verbleibenden zytoplasmatischen Verunreinigungen (0,5 h)
    1. Bereiten Sie EB2B vor, indem Sie Protease-Inhibitoren zu einer Endkonzentration von 1x (0,5 Tablette pro 5 ml EB2B) hinzufügen.
    2. Rohkernpellet ab Schritt 3.2.3 in 2 ml EB2B wieder aussetzen.
      HINWEIS: EB2B enthält triton X-100 nicht, daher sollte an dieser Stelle keine zusätzliche Lyse auftreten.
    3. Zentrifuge bei 2.100 x g für 15 min bei 4 °C in einem schwingenden Schaufelrotor zu Pelletschutt und Kernen.
      HINWEIS: Kleine Organellen und zytoplasmatische Komponenten sollten nicht pellet, so sollten sie im Überstand bleiben.
    4. Dekant den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
    5. Setzen Sie das Pellet mit 250 l NLB (0,5 Protease-Hemmer-Tablette frisch für 5 ml) wieder auf.
      HINWEIS: Das Ziel ist es, die Kerne in einer minimalen Menge an NLB ohne erheblichen materiellen Verlust wieder auszusetzen. Da NLB sehr zähflüssig ist und die Pellets eine große Menge an unlöslichen Ablagerungen enthalten, ist es sehr schwierig, Pipette und neigt dazu, sich an die Innenseite von Pipettenspitzen zu klammern. Aus diesem Grund wird empfohlen, die gleiche Pipettenspitze nach Möglichkeit wiederzuverwenden. Wenn Sie sich mit Restmaterial in einer Pipettenspitze befassen, hängen Sie einfach die Pipette für 1 min von einem Regal oder Rack auf, damit die Schwerkraft beim Öffnen der Spitze Material sammeln kann. Nicht aggressiv Pipette, um die Pellets wieder auszusetzen. Verwenden Sie stattdessen die Pipettenspitze als Rührstab, bis das pelletierte Material in die Pipettenspitze angesaugt werden kann. d.h. es ist vollkommen in Ordnung, wenn große Pelletklumpen in diesem Stadium bleiben, solange sie in eine Pipettenspitze gezogen werden können.
    6. Vortex 15 s bei max, um das Material zu homogenisieren und teilweise wieder aufzuhängen. 5 min bei 4 °C beschallen, dann bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Bei nachfolgenden Schritten sollten Sie bedenken, dass die Gesamtmenge der hinzugefügten NLB 250 L beträgt, das Gesamtvolumen der Probe jedoch aufgrund unlöslicher Ablagerungen bis zu doppelt so hoch sein kann. Die Probe wird eingefroren und aufgetaut, um bei der Lyse von Kernen zu helfen.
  4. Nuclei-Lyse und Histonextraktion (ca. 4 h)
    1. Fügen Sie der aufgetauten Probe 750 l 5% Gdn-Puffer hinzu. 15 min bei 4 °C beschallen.
    2. Probe in ein einzelnes 2 ml-Rohr geben und 10.000 x g 10 min bei 4 °C drehen.
      HINWEIS: Der Überstand wird wahrscheinlich grün aussehen. Die folgenden Chromatographieschritte sollten die meisten Pigmente aus dem Protein entfernen.
    3. Während Sie auf Schritt 3.4.1 und 3.4.2 warten, bereiten Sie die Spalte für die Ionenaustauschchromatographie vor. Spülen Sie die Chromatographiesäule mit 2 ml Acetonitril und 4 ml Wasser, um die Verschmutzung an der Oberfläche zu minimieren.
    4. Laden Sie 200 bis 300 L WCX-Harz (vorkonditioniert mit 5% Gdn-Puffer) auf die Chromatographiesäule. Lassen Sie das Harz absetzen. Viermal mit 1 ml 5% Gdn Puffer waschen. Halten Sie die Röhre und die Säule für den Rest der Reinigungsschritte auf Eis.
    5. Setzen Sie die Chromatographie-Säule auf ein 2 ml-Sammelrohr. Den Überstand ab Schritt 3.4.2 langsam auf das Harzbett laden, ohne das Harz zu stören (versuchen Sie, langsam von der Seite der Rohre fallen zu lassen). Lassen Sie die Lösung durch die Schwerkraft fließen. Wenn die Lösung durchfließt, laden Sie das Eluent 6–8 Mal wieder an die Oberseite der Säule, um eine maximale Bindung an das Harz zu ermöglichen. Entsorgen Sie dann das Eluent.
    6. Laden Sie 2 ml 5% Gdn Puffer, um nicht-histonische Proteine von der Säule zu waschen. Entsorgen Sie das Eluent.
    7. Elute Histones mit 1 ml 20% Gdn Puffer. Sammeln Sie das Eluent, das Histonproteine enthält.
    8. Verwenden Sie 3 kDa Molekulargewicht abgeschnitten (MWCO) Spinfilter (0,5 ml), um das Eluent aus Schritt 3.4.6 zu entsalzen. Vor gebrauchsweise 500 l Waschlösungsmittel (0,2 % Ameisensäure in 3 % ACN) laden und zweimal nach unten drehen, um den Filter zu reinigen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, den MWCO-Filter zu waschen, während Sie die Harzchromatographie-Schritte durchführen, um Zeit zu sparen. Die folgenden Drehspinfilterschritte dauern 3–4 h.
    9. Erste Last 500 l Histonprobe, Drehen bei 14.000 x g für 25 min, um das Volumen auf 100 l zu reduzieren. Dann laden Sie weitere 400 l Probe und drehen Sie bei 14.000 x g wieder für 25 min. Die letzten 100 l Probe beladen, das Probenröhrchen mit 300 l Waschlösungsmittel abspülen und das Lösungsmittel in den Filter laden. Drehen Sie bei 14.000 x g wieder für 25 min.
    10. Laden Sie 400 l Waschlösungsmittel, drehen Sie bei 14.000 x g für 25 min, um das Volumen auf 100 l oder weniger zu reduzieren. Jeder Zyklus reduziert die Salzkonzentration um ein Fünftel. Wiederholen Sie dies für weitere drei Zyklen, um die Guanidinkonzentration auf 0,01 % zu senken. Den Filter in ein sauberes Sammelrohr umkehren und bei 1.000 x g 2 min drehen. Speichern Sie die gereinigte Histonprobe bei -20 °C oder -80 °C zur Analyse.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, im letzten Schritt länger (30–40 min) zu drehen, um das Probenvolumen zu minimieren, um eine höhere Konzentration zu erzielen. Das Volumen sollte bis zu 50–70 l sinken können.

4. Massenspektrometrie gereinigter Histones

  1. Datenerfassung der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)
    1. Schätzen Sie die Proteinkonzentration durch Bicinchoninsäure (BCA) Assay nach dem Herstellerprotokoll.
      HINWEIS: BCA kann nur eine Schätzung der Gesamtproteinkonzentration liefern, aber nicht die Qualität der Histonreinigung. Wenn MS-Instrumentierung nicht ohne weiteres zur Überprüfung der Qualität der Histonreinigung verfügbar ist, kann western blot verwendet werden. Reversed-Phase LC gekoppelt mit 210 nm UV-Absorptionserkennung, wie in unserem vorherigen Bericht beschrieben, kann auch20verwendet werden. Das Chromatogramm kann mit einem bekannten Standard zur Überprüfung der Probenqualität verglichen werden. Verschiedene Organismen können jedoch unterschiedliche Elutionsprofile aufweisen. Daher wird die Verwendung von Histonstandards aus ähnlichen Organismen dringend empfohlen.
    2. Schließen Sie eine C18-Analysephase (RP) an (z. B. 3 m 300 , Säuleninnendurchmesser 75 m, Außendurchmesser 360 m, Länge 70 cm) und eine C18-Falle (z.B. 3,6 m, Säuleninnendurchmesser 150 m, Außendurchmesser 360 m, Länge 5 cm) bis zu einem Nanoflow-Flüssigkeitschromatographiesystem mit zwei Pumpen (z.B. WatersAcqu Nanoity). Die binären Lösungsmittel sind A: 0,1% Ameisensäure in Wasser und B: 0,1% Ameisensäure in Acetonitril.
      HINWEIS: Die Doppelpumpe LC umfasst eine Waschpumpe und eine Gradientenpumpe. Beide Pumpen durchlaufen in jeder Analyse zwei Phasen – eine Fangphase, gefolgt von der analytischen Phase. In der Fangphase fließt die Waschpumpe in die Fallsäule und die Gradientenpumpe in die Analysesäule. In der analytischen Phase wird die Trapsäule mit der analytischen Spalte gekoppelt, und die Gradientenpumpe fließt in beide Spalten. Die Waschpumpe geht dann in den Abfall.
    3. Trapping-Stufe: Richten Sie die LC-Methode ein, um zuerst 1–2 g Histonprobe auf die Trapsäule zu laden. Die Probe durch die Waschpumpe bei 3 l/min 5% Lösungsmittel B für 10 min absenken. Stellen Sie die Analysepumpe für den Ausgleich auf 0,3 l/min 5% Lösungsmittel B.
    4. Analytische Phase: Stellen Sie die Gradientenpumpe (0,3 l/min) so ein, dass sie bei 5% B und der Rampe auf 30% bei 15 min beginnt. Dann erhöhen Sie auf 41% B bei 100 min vor einer hohen organischen Wäsche bis zu 95% B am Ende.
      HINWEIS: Der Farbverlauf kann je nach den unterschiedlichen Retentionsprofilen auf einzelnen Spalten optimiert werden. Typischerweise werden die Histone in voller Länge bei den angegebenen LC-Bedingungen um 30 %–40 % B angegeben. Längere Gradienten können verwendet werden, um die Anzahl der MS2-Spektren zu erhöhen, um mehr Histonproteoformen zu erfassen.
    5. Richten Sie eine datenabhängige Erfassungsmethode auf einem hochauflösenden MS (z. B. Thermo Orbitrap Fusion Lumos oder ähnliches) mit Elektronenübertragungsdissoziation (ETD) ein. Verwenden Sie den intakten Proteinmodus und führen Sie alle erforderlichen Kalibrierungen durch, wie vom Hersteller vorgeschlagen. Kritische Parameter werden unten beschrieben. Diese werden spezifisch für das verwendete Instrument sein.
      1. MS1: Scanbereich 600–2.000 m/z, Auflösung 120k (bei m/z 200), 4 Mikroscans, AGC-Ziel 1E6, max. Injektion 50 ms.
      2. MS2: Auflösung 120k; 1 Mikroscan; AGC-Ziel 1E6; datenabhängige MS/MS: abwechselnde ETD (25 ms Reaktionszeit, max. Einspritzzeit 500 ms) und kollisionsstärkere Dissoziation mit höherer Energie (HCD, 28% normalisierte Kollisionsenergie mit ±5% Schrittenergie, max. Einspritzzeit 100 ms); Isolationsfenster von 0,6 Da; Priorität auf die höchsten Ladungsstaaten.
      3. Dynamischer Ausschluss: 120 s Zeitfenster, ±0.7 Da Massenfenster. Nicht zu den Ladezuständen unter 5 und zu unbestimmten Gebührenzuständen.
    6. Führen Sie ein paar Injektionen von Peptid- oder Histone-Standards auf neue Säulen aus, um das System auszuduthegen und zu überprüfen, bevor Sie die tatsächlichen Proben ausführen. Fügen Sie zum Ausführen einer großen Anzahl von Stichproben kurze Leerzeichen oder Wälvorenthalten zwischen den Stichproben hinzu, um die Übertragung zu minimieren. Lassen Sie die Säulen vor der nächsten Probe 15–20 min bei der Ausgangsbedingung (5% Lösungsmittel B) ausdemieren.
      HINWEIS: Längere LC-Gradienten und eine höhere maximale Einspritzzeit für MS2 können die Spektralqualität verbessern, um mehr Histonproteoformen zu identifizieren.
  2. LC-MS Datenverarbeitung und Proteoform-Identifikation
    1. Erhalten Sie die (Sorghum-)Proteinsequenz im FASTA-Format von JGI (https://genome.jgi.doe.gov) oder UniProt (https://www.uniprot.org/).
    2. Verwenden Sie MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml), um die Werkzeugrohdatendateien (*.raw) in das mzML-Format zu konvertieren.
    3. Laden Sie TopPIC Suite22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) für die Datenverarbeitung herunter. Das Programm kann entweder in der Befehlszeile oder über die grafische Oberfläche ausgeführt werden.
    4. Verwenden Sie TopFD in der TopPIC-Suite, um die Spektren aus der mzML-Datei aus Schritt 4.2.2 zu dekonvolute. Die Standardparameter können verwendet werden. Das "Vorläuferfenster" (-w) muss jedoch auf 1 m/z reduziert werden, da ein schmales Isolationsfenster verwendet wird.
    5. Verwenden Sie TopPIC in der TopPIC-Suite, um Proteoformen zu identifizieren. Die meisten Standardparameter können verwendet werden. Legen Sie den Spektrum- und Proteoform-Cutoff-Typ auf FDR (false discovery rate) fest, und legen Sie den Grenzwert auf 0,01 (1% FDR) oder wie gewünscht fest. Stellen Sie die "proteoforme Fehlertoleranz" auf 5 (Dalton) ein. Laden Sie die FASTA-Datei aus Schritt 4.2.1 und die Datei "*_ms2.msalign" aus Schritt 4.2.4. Starten Sie dann die Suche.
      ANMERKUNG: Die Einstellung "proteoforme Fehlertoleranz" kombiniert Proteoformen mit ähnlichen Massen (± 5 Da) als eine. Dies trägt dazu bei, die Redundanz in der Proteoformanzahl zu reduzieren. Es sollte jedoch mit Vorsicht verwendet werden, da große Toleranz Proteoformen mit kleinen oder gar keinen Massenunterschieden zusammenführt. Dieser Parameter ist nur in TopPIC Version 1.3 oder höher verfügbar.
    6. Die identifizierten Proteoformen können in der Datei "*_proteoform.csv" untersucht oder mit dem Topview-Modul unter dem Ordner "*_html" der Ausgabe visualisiert werden.
    7. Die proteoforms Liste aus den oben genannten Schritten mit TopPIC annotiert die Histon-PTMs als Massenverschiebungen. Um einzelne PTMs zu lokalisieren, muss eine Änderungsliste enthalten sein. Eine ausführliche Beschreibung finden Sie im TopPIC-Handbuch. Alternativ können Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, um eine ergänzende Datenanalyse mit dem Informed-Proteomics-Paket23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics durchzuführen.
    8. Folgen Sie den Anweisungen und verwenden Sie das PbfGen-Modul, um die Software-Rohdaten in eine PBF-Datei zu konvertieren. Dekonvolute dann die MS1-Daten mit ProMex-Modul, um eine ms1ft-Datei auszugeben (Feature-Liste, jedes Feature stellt eine einzigartige Kombination aus Masse und Aufbewahrungszeit).
    9. Erstellen Sie eine fokussierte FASTA für Informed-Proteomics unter Verwendung der identifizierten Proteinliste von TopPIC in Schritt 4.2.6.
      HINWEIS: Die Suche im gesamten Genom mit Informed-Proteomics mit einer großen Anzahl variabler PTMs kann extrem langsam sein und Abstürze verursachen. Daher wird empfohlen, die Größe von FASTA nur durch die Einbeziehung der Zielproteine zu reduzieren.
    10. Erstellen Sie eine Zieländerungsliste, um nach Histone-PTMs zu suchen, die dem Format in der Beispieldatei folgen. Die gemeinsamen PTM enthalten sind: Lysin-Acetylierung, Lysin-Mono-Methylierung, Lysin-Di-Methylierung, Lysin-Tri-Methylierung, Serin/Threonin/Tyrosin-Phosphorylierung, Protein N-terminale Acetylierung, Methionin/Cystein-Oxidation. Für Sorghum sollte das Protein N-terminale Monomethylierung, Di-Methylierung und Trimethylierung zugesetzt werden.
      HINWEIS: Informed-Proteomics sucht nur nach PTMs, die in der Liste angegeben sind. Wenn nicht spezifizierte PTMs vorhanden sind, kann das Proteoform nicht identifiziert werden oder möglicherweise fälschlicherweise mit anderen Proteoformen identifiziert werden. Die PTM-Liste sollte jedoch so kurz wie möglich gehalten werden, um die Suchzeit zu minimieren.
    11. Führen Sie das MSPathFinder-Modul aus, um Proteoformen mithilfe der Dateien aus Schritt 4.2.8, des fokussierten FASTA aus Schritt 4.2.9 und der Änderungsliste aus Schritt 4.2.10 zu identifizieren. Die Standardparameter können verwendet werden.
    12. Die Ergebnisse können in LcMsSpectator visualisiert werden, indem alle Ergebnisdateien geladen werden.
      HINWEIS: Für die Verarbeitung und Visualisierung von Top-Down-Daten stehen weitere Bioinformatik-Tools zur Verfügung, die jeweils ihre eigenen Stärken24,25,26,27,28haben. Sorghum und viele andere Organismen haben nur begrenzte bekannte Informationen über Histon-PTMs in der Datenbank. Verwenden Sie TopPIC zuerst, um Massenverschiebungen von PTMs zu identifizieren. Diese Analyse kann sowohl bekannte als auch unbekannte PTMs leicht erkennen. Anschließend können die erkannten PTMs gezielt durchsucht werden, indem entweder eine PTM-Liste in TopPIC angegeben wird oder andere ergänzende Tools verwenden.

Ergebnisse

Nach dem Protokoll können die Histonen mit der LC-MS-Analyse extrahiert und identifiziert werden. Die Rohdaten und verarbeiteten Ergebnisse sind bei MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) über den Beitritt verfügbar: MSV000085770. Basierend auf den TopPIC-Ergebnissen aus der repräsentativen Stichprobe (auch bei MassIVE erhältlich) identifizierten wir 303 Histonproteoformen (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 und 22 H4 Proteoformen). Auch ko-gereinigte ribosomale Proteoformen wurden nachgewiesen, die typischerweise früh im LC elu...

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Histonen aus Sorghumblattproben (oder allgemeiner Pflanzenblatt) proben extrahiert werden. Die durchschnittliche Histonausbeute wird voraussichtlich 2–20 g pro 4–5 g Sorghumblattmaterial betragen. Die Materialien sind ausreichend rein für die nachgeschaltete Histonanalyse durch LC-MS (meist Histone mit einer ribosomalen Proteinkontamination von 20 %). Aufgrund von Stichprobenvariationen oder möglichen Fehlbehandlungen/Fehlern im gesamten Protokoll kann ein geringerer Ertra...

Offenlegungen

nichts.

Danksagungen

Wir danken Ronald Moore und Thomas Fillmore für die Unterstützung bei Massenspektrometrieexperimenten und Matthew Monroe für die Datenabscheidung. Diese Forschung wurde durch Stipendien des US Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research im Rahmen des Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) Projekts unter der Nummer DE-SC0014081, vom US Department of Agriculture (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D) und über das Joint BioEnergy Institute (JBEI), eine vom DOE gesponserte Einrichtung (Vertrag DE-AC02-05CH11231) zwischen Lawrence Berkeley National Laboratory und DOE. Die Forschung wurde mit dem Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (Grid.436923.9) durchgeführt, einer vom Office of Biological and Environmental Research gesponserten DOE Office of Science User Facility.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileFisher ChemicalA955-4L
Dithiothreitol (DTT)Sigma43815-5G
EDTA, 500mM Solution, pH 8.0EMD Millipore Corp324504-500mL
Formic AcidThermo Scientific28905
Guanidine HydrochlorideSigmaG3272-100G
MgCl2SigmaM8266-100G
Potassium phosphate, dibasicSigmaP3786-100G
Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tabletsRoche5892791001
Sodium butyrateSigma303410-5GUsed for histone deacetylase inhibitor
Sodium Chloride (NaCl)SigmaS1888
Sodium FluorideSigmaS7020-100GUsed for phosphatase inhibitor
Sodium OrthovanadateSigma450243-10GUsed for phosphatase inhibitor
SucroseSigmaS7903-5KG
Tris-HClFisher ScientificBP153-500 g
Triton X-100SigmaT9284-100ML
Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)Bio-Rad142-5842
Disposables
Chromatography column (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
Mesh 100 filter clothMillipore SigmaNY1H09000This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.
Micropipette tips (P20, P200, P1000)Sigma
Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, ConicalGenesee Scientific28-103
Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mLSigma
Equipment
Analytical BalanceFisher Scientific01-912-401
Beakers (50mL – 2L)
Microcentrifuge with coolingFisher Scientific13-690-006
Micropipettes
Swinging-bucket centrifuge with coolingFisher Scientific
VortexFisher Scientific50-728-002
Water bath SonicatorFisher Scientific15-336-120

Referenzen

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