JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол был разработан для эффективного извлечения нетронутыми гистонами из материалов листьев сорго для профилирования гистон пост-переводных модификаций, которые могут служить потенциальными эпигенетическими маркерами для оказания помощи инженерных засухоустойчивых культур.

Аннотация

Гистоны принадлежат к семейство высокосхраняемых белков в эукариотах. Они упаковывают ДНК в нуклеосомы как функциональные единицы хроматина. Пост-трансляционные модификации (ПТМ) гистонов, которые являются высокодинамических и могут быть добавлены или удалены ферментами, играют важную роль в регулировании экспрессии генов. В растениях эпигенетические факторы, в том числе гистон ПТМ, связаны с их адаптивной реакцией на окружающую среду. Понимание молекулярных механизмов эпигенетического контроля может принести беспрецедентные возможности для инновационных биоинженерных решений. В этом случае мы описываем протокол изоляции ядер и очистки гистонов от тканей листьев сорго. Извлеченные гистоны могут быть проанализированы в их неповрежденных формах с помощью масс-спектрометрии сверху вниз (MS) в сочетании с онлайн обратной фазой (RP) жидкой хроматографией (LC). Комбинации и стоихиометрия нескольких ПТМ на одной и той же протеоформе гистона могут быть легко идентифицированы. Кроме того, отрезание хвоста гистона может быть обнаружено с помощью рабочего процесса LC-MS сверху вниз, что дает глобальный профиль PTM основных гистонов (H4, H2A, H2B, H3). Ранее мы применяли этот протокол для определения гистоновых ПТМ из тканей листьев сорго, собранных в ходе крупномасштабного полевого исследования, направленного на выявление эпигенетических маркеров засухоустойчивости. Протокол потенциально может быть адаптирован и оптимизирован для хроматина иммунопреципиентации секвенирования (ChIP-seq), или для изучения гистон PTMs в аналогичных растений.

Введение

Увеличение тяжести и частоты засухи, как ожидается, повлияет на производительность зерновыхкультур 1,2. Сорго является зерновых продуктов питания и энергии культур известен своей исключительной способностью выдерживать ограничения водыусловиях 3,4. Мы преследуем механистическое понимание взаимодействия между засухой, развитием растений и эпигенетикой растений соргои двухцветного сорго (L.) Moench. Наша предыдущая работа продемонстрировала сильную связь между микробиомом растений и корневища при акклиматизации засухи иреакциями на молекулярном уровне 5,6,7. Это исследование проложит путь для использования эпигенетической инженерии в адаптации сельскохозяйственных культур к будущим климатическим сценариям. В рамках усилий по пониманию эпигенетики мы стремимся изучить белковые маркеры, которые влияют на экспрессию генов в организме растения.

Гистоны принадлежат к высоко сохраниваемому семейство белков в эукариотах, которые упаковывают ДНК в нуклеосомы в качестве основных единиц хроматина. Пост-трансляционные модификации (ПТМ) гистонов динамически регулируются для контроля структуры хроматина и влияния на экспрессию генов. Как и другие эпигенетические факторы, в том числе метилирование ДНК, гистон PTMs играют важную роль во многихбиологических процессах 8,9. Анализы на основе антител, такие как западные помарки, широко используются для выявления и количественной оценки гистоновых ПТМ. Кроме того, взаимодействие гистона ПТМ и ДНК может быть эффективно исследовано иммунопреципиентацией хроматина – секвенированием (ChIP-seq)10. В ChIP-seq хроматин с специфическим целевым гистоном PTM обогащается антителами против этого конкретного PTM. Затем фрагменты ДНК могут быть освобождены от обогащенного хроматина и секвенированы. Выявлены области генов, взаимодействующих с целевым гистоном PTM. Однако все эти эксперименты в значительной степени опираются на высококачественные антитела. Для некоторых вариантов гистон / омологов или комбинаций ПТМ, разработка надежных антител может быть чрезвычайно сложной задачей (особенно для нескольких ПТМ). Кроме того, антитела могут быть разработаны только в том случае, если целевой гистон PTM известен. 11 Поэтому необходимы альтернативные методы нецелесохозяемого глобального профилирования Гистоновых ПТМ.

Масс-спектрометрия (MS) является дополнительным методом для характеристики гистон PTMs, в том числе неизвестных ПТМ, длякоторых антитела не доступны 11,12. Устоявшийся "снизу вверх" MS рабочий процесс использует протеасы для переваривания белков в небольших пептидов до жидкой хроматографии (LC) разделения и обнаружения MS. Поскольку гистоны имеют большое количество основных остатков (лизин и аргинин), пищеварение трипсина (протеаза, специфичная для лизина и аргинина) в стандартном рабочем процессе снизу вверх разрезает белки на очень короткие пептиды. Короткие пептиды технически трудно анализировать стандартными LC-MS, и не сохраняют информацию о подключении и стоихиометрии нескольких ПТМ. Использование других ферментов или химической маркировки для блокирования лизинов генерирует более длинные пептиды, которые больше подходят для характеристики гистон PTMs13,14.

Кроме того, шаг пищеварения может быть полностью опущен. В этом "сверху вниз" подход, нетронутыми ионов белка вводятся в MS электроспрей ионизации (ESI) после онлайн разделения LC, что дает ионы нетронутыми протеоформов гистона. Кроме того, ионы (т.е. протеоформы), представляющие интерес, могут быть изолированы и фрагментированы в масс-спектрометре для получения последовательности ионов для идентификации и локализации PTM. Таким образом, сверху вниз MS имеет преимущество, чтобы сохранить информацию на уровне протеоформ и захватить подключение нескольких PTMs и терминальных усечений на той жепротеоформы 15,16. Эксперименты сверху вниз могут также предоставить количественную информацию и предложить понимание биомаркеров на нетронутом уровне белка17. В этом случае мы описываем протокол для извлечения гистона из листьев сорго и анализа неповрежденных гистонов сверху вниз LC-MS.

Примерные данные, показанные на рисунке 1 и рисунке 2, являются данными из листьев сорго, собранных на второй неделе после посадки. Хотя ожидается изменение урожайности, этот протокол, как правило, агностик к конкретным условиям выборки. Тот же протокол был успешно использован для тканей листьев растений сорго, собранных из 2, 3, 5, 8, 9 и 10 недель после посадки.

протокол

1. Подготовка материала из листьев сорго

ПРИМЕЧАНИЕ: Сорго растения были выращены в почве в поле в Parlier, Калифорния.

  1. Соберите листья сорго из растений в 50 мл центрифуг трубки и немедленно заморозить трубку в жидком азоте. Соберите листовую ткань, оторвав третий и четвертый полностью выверенные листья из первичного культиваива.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о состоянии поля, рост выборки, и сбор можно найти в опубликованном докладе18.
  2. Измельчите листья жидким азотом и немедленно перенесите в центрифугу.
  3. Храните лист земли при -80 градусов по Цельсию до использования. Возьмите около 4 г крио-земля лист порошка для гистон анализа каждого образца.

2. Подготовка буферов и материалов (3-4 ч)

ПРИМЕЧАНИЕ: Решения с высокой концентрацией запасов могут быть сделаны заранее и храниться до использования. Но все рабочие буферы должны быть свежими в день добычи (путем разбавления из бульона и смешивания с другим содержимым) и быть помещены на лед во время процесса. Весь эксперимент должен быть выполнен при 4 градусов по Цельсию, если не рекомендуется иное.

  1. Приготовьте 2,5 М сахарозы путем растворения 42,8 г сахарозы (342,30 г/мол) в 15 мл стерильной воды на тепловой пластине в стеклянной таре с непрерывным перемешиванием. Довести громкость до 50 мл после полного растворения сахарозы. Храните сахарозу в 4 градусов по Цельсию до их использования.
  2. Приготовьте 1 M Tris pH 8 путем растворения 1,576 г Tris HCl в 10 мл H2O в 15 мл центрифуги трубки. Отрегулируйте рН с NaOH до 8 и проверьте с рН бумаги. Храните его при 4 градусов по Цельсию до его использования.
  3. Приготовьте 1 М дитиотрейтол (ДЛТ) весом 231 мг ДЛТ (154,25 г/мол) и растворив его в стерильной воде 1,5 мл. DTT должен быть свежим или использовать сохраненные замороженные aliquots.
  4. (По желанию) Приготовьте дополнительные ингибиторы, смешивая три различные соли. Приготовьте 18,38 мг ортованата натрия (183,91 г/мол) в 1 мл стерильной воды, затем приготовьте отдельно бутират натрия, добавив 11,008 мг бутирата натрия (110,09 г/мол) в 1 мл стерильной воды. Приготовьте окончательную соль, добавив 4,199 мг фтора натрия (41,99 г/мол) в 1 мл воды. Смешайте три соленых раствора в равном объеме в качестве запасного раствора для "дополнительных ингибиторов" (33 мМ от каждого из трех химических веществ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ванадат натрия полимеризируется в концентрациях выше 0,1 м При нейтральном рН. Рекомендуется активировать ванадат натрия, чтобы деполимеризировать его для максимальной эффективности после опубликованных протоколов19. Кроме того, активированный ванадат натрия доступен на коммерческой основе. При этом ванадат натрия не активировался намеренно, поэтому эффективность не снижается. Активированный ванадат натрия еще не был протестирован для этого протокола.
  5. Приготовьте 1 М MgCl2 путем растворения 0,952 г хлорида магния ангидроуса (95,2 г/мол) в 10 мл H2O в 15 мл центрифуги трубки. Хранить 1 M MgCl2 при 4 кк до использования.
  6. Приготовьте 10% (v/v) Triton X-100, смешивая 53,5 г Triton X-100 с 35 мл стерильной воды, принесите до 50 мл с водой и храните его при комнатной температуре.
  7. Подготовка 5% Guanidine буфер рН7 (называется "Gdn буфер"), который будет использоваться для условий смолы по крайней мере на ночь - подготовить 0,1 М калия водорода фосфат дибазический (K2HPO4) путем взвешивания 870 мг K2HPO4 и растворения в 50 мл стерильной воды и хранить при 4 градусов по Цельсию.
  8. Взвесите 0,7 г гидрохлорида гуанидина и растворите в 0.1 M K2HPO4 до конечного объема 14 мл. Отрегулируйте pH до 7 путем проверять с бумагой pH.
  9. Замочите сухой слабый обмен катиоцией (WCX) смолы в 5% Гуанидин буфер рН 7 ночь. Удалите супернатант и пополнить со свежим 5% Gdn буфера и замочить его снова на ночь, чтобы смола полностью equilibrate (до тех пор, пока супернатант имеет тот же рН, как оригинальный буфер).
  10. Перед началом эксперимента в следующем разделе смешайте реагенты, чтобы сделать буфер EB1, EB2A и EB2B на основе таблицы 1. Добавьте все ингибиторы и DTT свежие перед использованием.
РеагентовКонцентрация запасовEB1EB2AEB2B
Объем (mL)Объем (mL)Объем (mL)
Сахароза2.5M4.41.250.5
Трис HCl рН81М0.250.1250.05
Dtt1М0.1250.06250.025
H2O20.2259.68754.375
ингибитор протеазы (PI) таблетка0,5 таблетки0,5 таблетки0,5 таблетки
Дополнительные ингибиторы (необязательно)33mM0.250.1250.05
MgCl2 1М0.1250.05
Тритон X10010%1.25
Общий объем25 мл12,5 мл5 мл

Таблица 1: Композиция для буферов извлечения (EB).

  1. Сделайте буфер nuclei Lysis (NLB) на основе таблицы 2. Подготовьтесь к NLB заранее и храните при 4 градусах Цельсия до его использования. Добавить PI таблетки свежие перед использованием в 1x (0,5 таблетки на 5 мл). Таблица 2 для конкретных томов.
NlbКонцентрация запасовОбъем (mL)
Nacl5М0.4
Трис HCl рН81М0.05
Тритон X10010%0.5
Эдта0,5 М0.2
H2O3.85
Pi таблетки0,5 таблетки
Дополнительные ингибиторы (необязательно)33mM0.05
Общий объем5 мл

Таблица 2: Композиция для буфера лиза ядер (NLB).

3. Процедура изоляции ядер

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнять шаги 3,1-3,3 первого дня (2-3 ч), сохранить ядра в буфере NLB при -80 градусов по Цельсию и возобновить на следующий день (или позже) для очистки белка (4 ч). Шаги изоляции ядер в этом протоколе были адаптированы из протокола сорго ChIP-seq, используемого в Объединенном институте генома. Дополнительные моет и сахарозы градиент разделения может потребоваться для обеспечения чистоты ядер для ChIP-seq приложений.

  1. Фильтрация мусора (0,5 ч)
    1. Взвесь порошок молотого листа 4 г, гарантируя, что он остается замороженным, поместив на сухой лед или жидкий азот до готовности к использованию.
    2. Добавьте таблетки ингибитора протеазы в EB1 к окончательной концентрации 0,2x (0,5 таблетки на 25 мл на образец). Используйте миниатюрный пластиковый пестик или наконечник пипетки, чтобы предварительно раздавить таблетки в микроцентрифуге трубки до добавления в буферы, чтобы помочь в растворении таблетки в буфере. Чтобы предотвратить потерю материала, добавьте планшет PI и sonicate буфер, чтобы растворить таблетку.
    3. Добавьте 20 мл EB1 в замороженный порошок молотого листа, аккуратно вихрь и смешать их, пока порошок полностью приостановлено. Держите смешивания осторожно в течение 10 мин.
    4. Фильтр через сетку 100, полоскания фильтрованного материала в два раза с 2 мл EB1 каждый раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: И фильтрат, и фильтрованный мусор должны быть зелеными. При отслеживании с помощью микроскопа, следует иметь возможность видеть нетронутыми ядра и нетронутыми хлоропластов в фильтрат в этой точке. Большинство крупных обломков должно отсутствовать/истощаться. Смешайте красители, такие как метиленовый синий с образцом. Ядра легко наблюдать, как 3-5 мкм диаметр темно-синий / аквамарин сферы при визуализации с помощью 20x, 40x, и / или 100x цели. По отношению к ядрам хлоропласты похожи по размеру, но зеленоваты по цвету и часто более овальные по форме. Вакуолы также похожи на ядра по размеру и форме, но они не будут легко взять метиленовый синий краситель.
    5. Центрифуга комбинированный фильтрат на 3000 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию в размахивая ротором ведро гранулы мусора и больших субклеточных органелл, в том числе ядер и хлоропластов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подготовить EB2A во время этого вращения (см. шаг 3.2.1).
    6. Декант супернатант, будьте осторожны, чтобы не беспокоить гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку моющее средство еще не было добавлено, гранулы должны оставаться интенсивным зеленым и супернатант должен быть, в крайнем случае, бледно-зеленый / желтый.
  2. Лиз нецелесоприимных органелл (0,5 ч)
    1. Подготовка EB2A путем добавления ингибиторов протеазы к конечной концентрации 0,4x (0,5 таблетки на 12,5 мл EB2A).
    2. Переподходить гранулы из шага 3.1.6 в 5 мл EB2A и инкубировать на льду в течение 10 мин с нежным смешивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация моющих средств должна быть оптимизирована для преимущественно лиза нетронутыми клетками и хлоропластами, но не ядрами. Требуемое количество может варьироваться в зависимости от организмов. Рекомендуется проверить лиз хлоропластов и удержание нетронутых ядер под микроскопом.
    3. Центрифуга при 2100 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию в размахивая ротором ведро гранул мусора и ядер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе, супернатант должен быть интенсивно зеленый, и гранулы должны быть гораздо менее зеленым, чем наблюдается на предыдущих стадиях из-за лиза хлоропластов и хлорофилла релиз в цитозол.
    4. Декант супернатант, будьте осторожны, чтобы не беспокоить гранулы.
  3. Изоляция ядер от оставшихся цитоплазмических загрязнителей (0,5 ч)
    1. Подготовка EB2B путем добавления ингибиторов протеазы к конечной концентрации 1x (0,5 таблетки на 5 мл EB2B).
    2. Resuspend сырой ядерной гранулы от шага 3.2.3 в 2 мл EB2B.
      ПРИМЕЧАНИЕ: EB2B не содержит Triton X-100, поэтому никаких дополнительных лизов не должно происходить в этой точке.
    3. Центрифуга при 2100 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию в размахивая ротором ведро гранул мусора и ядер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Малые органеллы и цитоплазмические компоненты не должны гранулы, поэтому они должны оставаться в супернатанте.
    4. Декант супернатант, будьте осторожны, чтобы не беспокоить гранулы.
    5. Повторное использование гранул с использованием 250 МКЛ NLB (добавить 0,5 ингибитор протеазы таблетки свежие для 5 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы повторно использовать ядра в минимальном количестве NLB без значительных материальных потерь. Потому что NLB очень вязкий и гранулы содержат большое количество нерастворимого мусора, это очень трудно pipette и, как правило, цепляются за внутреннюю часть пипетки советы. По этой причине рекомендуется повторно использовать тот же наконечник пипетки, когда это возможно. Если вы обеспокоены остаточным материалом в наконечнике пипетки, просто повесьте пипетку с полки или стойки на 1 мин, чтобы позволить гравитации собирать материал при открытии наконечника. Не агрессивно пипетки для повторного перерасхода гранул. Вместо этого используйте наконечник пипетки в качестве стержня для перемешивания до тех пор, пока гранулированный материал не будет аспирирован в наконечник пипетки. т.е., это прекрасно для больших сгустков гранулы, чтобы остаться на данном этапе до тех пор, как она может быть втянута в наконечник пипетки.
    6. Vortex 15 s на максимуме для гомогенизации и частично повторного перерасхода материала. Sonicate в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию, а затем хранить при -80 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующих шагов имейте в виду, что общее количество добавленных NLB составляет 250 МЛ, но общий видимый объем выборки может быть в два раза больше из-за нерастворимого мусора. Образец замораживается и размороживается, чтобы помочь в лизе ядер.
  4. Нуклеилиз и экстракция гистона (4 ч)
    1. Добавьте 750 МКЛ из 5% буфера Gdn в разморожеженный образец. Sonicate в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
    2. Перенесите образец в одну трубку 2 мл и вращай 10 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант, скорее всего, будет выглядеть зеленым. Следующие шаги хроматографии должны удалить большинство пигментов из белка.
    3. Ожидая на шаге 3.4.1 и 3.4.2, подготовь колонку для ионно-обменной хроматографии очистите. Промыть колонку хроматографии 2 мл ацетонитрила и 4 мл воды, чтобы свести к минимуму загрязнение поверхности.
    4. Загрузите 200–300 мкл смолы WCX (предварительно обусловленную 5% буфером Gdn) на колонку хроматографии. Пусть смола оседают. Вымойте четыре раза с 1 мл 5% Gdn буфера. Держите трубку и колонку на льду для остальных шагов очистки.
    5. Положите колонку хроматографии на трубку сбора 2 мл. Загрузите супернатант из шага 3.4.2 медленно на кровать смолы, не нарушая смолы (попробуйте медленно упасть со стороны труб). Пусть раствор протекать под действием силы тяжести. По мере того как разрешение пропускает до конца, загрузите eluent назад к верхней части колонки 6-8 времен для того чтобы позволить максимальную связывать к смоле. Затем отбросьте элуент.
    6. Загрузите 2 мл буфера Gdn 5% для мытья неистоновых белков с колонки. Отбросьте элуент.
    7. Elute гистоны с буфером 1 мл 20% Gdn. Соберите элуент, который содержит белки гистона.
    8. Используйте молекулярный фильтр спина 3 kDa, отрезанный (MWCO) (0,5 мл), чтобы опустытить элюент от шага 3.4.6. Перед использованием загрузите растворитель для мытья 500 йл (0,2% мякотиновой кислоты в 3% ACN) и покрутите его дважды, чтобы очистить фильтр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется начать промывку фильтра MWCO при выполнении шагов хроматографии смолы, чтобы сэкономить время. Следующие шаги фильтра спина принимают 3-4 ч.
    9. Первая нагрузка 500 МКЛ образца гистона, спина на 14000 х г за 25 мин, чтобы уменьшить объем до 100 фунтов стерлингов. Затем загрузите еще 400 МКЛ образца и спина на 14000 х г снова в течение 25 мин. Загрузите последние 100 МКЛ образца, промойте образец трубки растворителем для мытья 300 йл и загрузите растворитель в фильтр. Спин на 14000 х г снова в течение 25 мин.
    10. Загрузите растворитель для мытья 400 мкл, вращайтесь на 14 000 х г в течение 25 мин, чтобы уменьшить объем до 100 мкл или меньше. Каждый цикл снижает концентрацию соли на одну пятую. Повторите еще три цикла, чтобы довести концентрацию гуанидина до 0,01%. Обратный фильтр в чистую трубку сбора и спина на 1000 х г в течение 2 мин. Сохраните очищенный образец гистона при -20 градусов по Цельсию или -80 градусов по Цельсию для анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется вращаться дольше (30-40 мин) на последнем шаге, чтобы свести к минимуму объем выборки, чтобы получить более высокую концентрацию. Объем должен быть в состоянии спуститься до 50-70 мл.

4. Массовая спектрометрия очищенных гистонов

  1. Получение данных о жидкой хроматографии (LC-MS)
    1. Оцените концентрацию белка по анализу Бицинхониновой кислоты (BCA) в соответствии с протоколом производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BCA может только дать оценку общей концентрации белка, но не качество очистки гистона. Если MS приборов не легко доступны для проверки качества очистки гистона, западная помарка может быть использована. Обратная фаза LC в сочетании с 210 нм ультрафиолетового обнаружения абсорбтности, как описано в нашем предыдущем докладе могут быть такжеиспользованы 20. Хроматограмму можно сравнить с известным стандартом проверки качества образца. Тем не менее, различные организмы могут иметь различные профили elution. Поэтому, используя стандарты гистона от подобных организмов настоятельно рекомендуется.
    2. Подключите аналитическую колонку обратной фазы C18 (RP) (например, 3 мкм 300, колонка внутреннего диаметра 75 мкм, внешний диаметр 360 мкм, длина 70 см) и столб-ловушка C18 (например, 3,6 мкм, внутренний диаметр колонны 150 мкм, внешний диаметр 360 мкм, длина 5 см) к двухкамповой нанопотоковой жидкой хроматографической системе (например, Waters NanoAcquity). Бинарные растворители A: 0.1% formic кислота в воде, и B: 0.1% formic кислота в ацетонитриле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двойной насос LC включает в себя стиральный насос и градиентный насос. Оба насоса проходят через два этапа в каждом анализе- этап захвата следуют аналитические этапы. В стадии захвата, мыть насос впадает в ловушку колонки и градиент насоса течет в аналитическую колонку. На аналитическом этапе столбец ловушки соединен с аналитической колонкой, а градиентный насос впадает в обе колонны. Насос для мытья затем идет в отходы.
    3. Этап захвата: Настройка метода LC для первой загрузки 1-2 мкг образца гистона на столбец ловушки. Desalt образец стиральный насос на 3 йл / мин 5% растворителя B в течение 10 мин. Установите аналитический насос на уровне 0,3 МКЛ/мин 5% растворителя B для эквилибрации.
    4. Аналитическая стадия: Установите градиентный насос (0,3 мкл/мин), чтобы начать с 5% B и рампы до 30% в 15 мин. Затем, увеличение до 41% B на 100 мин до высокой органической мыть до 95% B в конце.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Градиент может быть оптимизирован в зависимости от различных профилей удержания на отдельных столбцах. Как правило, полнометражные гистоны elute около 30%-40% B на указанных условиях LC. Более длинные градиенты могут быть использованы для увеличения числа спектров MS2, чтобы захватить больше протеоформ гистона.
    5. Настройка метода получения данных на ms с высоким разрешением (например, Thermo Orbitrap Fusion Lumos или аналогичный) с возможностью диссоциации передачи электронов (ETD). Используйте режим нетронутого белка и выполните все необходимые калибровки, как это было предложено производителем. Критические параметры описаны ниже. Они будут специфичны для используемого инструмента.
      1. MS1: диапазон сканирования 600-2000 м/з, разрешение 120к (при м/з 200), 4 микроскана, цель AGC 1E6, максимальная инъекция 50 мс.
      2. MS2: разрешение 120k; 1 микроскан; Цель AGC 1E6; данные зависимых MS/MS: чередование ETD (25 мс время реакции, максимальное время впрыска 500 мс) и более высокой энергии столкновения диссоциации (HCD, 28% нормализованной энергии столкновения с ±5% шагнул энергии, максимальное время впрыска 100 мс); изоляционные окна 0,6 Da; приоритет на самых высоких состояниях заряда.
      3. Динамическое исключение: 120 с окном времени, ±0.7 Da массовое окно. Исключить государства обвинения ниже 5 и неопределенные состояния заряда.
    6. Вы запустите несколько инъекций пептида или гистона стандартов на новые столбцы, чтобы уравночные и проверить систему, прежде чем запустить фактические образцы. Для выполнения большого количества образцов добавьте короткие заготовки или моет между образцами, чтобы свести к минимуму переноску. Пусть столбцы уравночные в течение 15-20 минут в исходном состоянии (5% растворителя B) до следующего образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длинные градиенты LC и более высокое максимальное время впрыска ДЛЯ MS2 могут улучшить спектральное качество для определения более протеоформов гистона.
  2. Обработка данных LC-MS и протеоформная идентификация
    1. Получить (сорго) белковой последовательности в формате FASTA от JGI (https://genome.jgi.doe.gov) или UniProt (https://www.uniprot.org/).
    2. Используйте MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) для преобразования необработанных файлов данных инструмента (.raw) в формат mzML.
    3. Загрузите TopPIC Suite22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) для обработки данных. Программа может быть запущена либо в командной строке, либо через графический интерфейс.
    4. Используйте TopFD в наборе TopPIC, чтобы деконволюция спектра из файла mzML из шага 4.2.2. Параметры по умолчанию могут быть использованы. Но "окно прекурсоров" (-w) должно быть уменьшено до 1 м/з, поскольку используется узкое изоляционные окна.
    5. Используйте TopPIC в наборе TopPIC для определения протеоформов. Большинство параметров по умолчанию могут быть использованы. Установите тип отсечения спектра и протеоформы на FDR (ложная скорость обнаружения) и установите значение отсечения до 0,01 (1% FDR) или по желанию. Установите "протеоформную толерантность к ошибкам" до 5 (Далтон). Загрузите файл FASTA с шага 4.2.1 и файла «_ms2.msalign» с шага 4.2.4. Тогда начните поиск.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметр "толерантность к ошибкам proteoform" будет сочетать протеоформы с аналогичными массами (± 5 Da) как один. Это помогает уменьшить избыточность в протеоформных числах. Тем не менее, его следует использовать с осторожностью, потому что большая толерантность будет сливаться протеоформов с небольшими или нет массовых различий. Этот параметр доступен только в версии TopPIC 1.3 или позже.
    6. Идентифицированные протеоформы можно изучить в файле «_proteoform.csv» или визуализировать с помощью модуля Topview под папкой _html» вывода.
    7. Список протеоформ, созданный из вышеуказанных шагов с помощью TopPIC, аннотирует Гистон PTMs как массовые сдвиги. Для локализации отдельных ПТМ необходимо включить список изменений. Подробное описание можно найти в руководстве TopPIC. Кроме того, перейти к следующему шагу для выполнения дополнительного анализа данных с использованием пакета Informed-Proteomics23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
    8. Следуйте инструкциям и используйте модуль PbfGen для преобразования необработанных данных инструмента в файл PBF. Затем деконвольтировать данные MS1 с помощью модуля ProMex для вывода файла ms1ft (список функций, каждая функция представляет собой уникальное сочетание массы и времени хранения).
    9. Создайте сфокусированную FASTA для информированных протеоми с использованием идентифицированного списка белков из TopPIC в шаге 4.2.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поиск всего генома с помощью Informed-Proteomics с большим количеством переменных ПТМ может быть чрезвычайно медленным и может привести к сбоям. Поэтому рекомендуется уменьшить размер FASTA только путем включения целевых белков.
    10. Создайте целевой список модификаций для поиска Гистон PTMs после формата в примере файла. Общие ПТМ включают в себя: лизин ацетилирование, лизин моно-метилирование, лизин ди-метилирование, лизин три-метилирование, серин / триеонин / тирозин фосфорилирования, белка N-терминальной ацетилирования, метионина / цистеина окисления. Для сорго следует добавить белок N-терминального моно-метилирования, ди-метилирования и триметиляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Informed-Proteomics ищет только ПТМ, указанные в списке. При неуточненных ПТМ протеоформ не может быть идентифицирован или может быть неправильно идентифицирован другим протеоформами. Тем не менее, список PTM должен быть как можно более коротким, чтобы свести к минимуму время поиска.
    11. Выполните модуль MSPathFinder для идентификации протеоформ с помощью файлов шага 4.2.8, сфокусированного FASTA из шага 4.2.9 и списка изменений из шага 4.2.10. Параметры по умолчанию могут быть использованы.
    12. Результаты можно визуализировать в LcMsSpectator, загрузив все файлы результатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие инструменты биоинформатики доступны для обработки и визуализации данных сверху вниз, каждый со своимисильными сторонами 24,25,26,27,28. Сорго и многие другие организмы имеют ограниченную известную информацию о гистон PTMs в базе данных. Сначала используйте TopPIC для определения массовых сдвигов от ПТМ. Этот анализ может легко обнаружить как известные, так и неизвестные ПТМ. Затем обнаруженные ПТМ можно искать целевым образом либо путем указания списка PTM в TopPIC, либо с помощью других дополнительных инструментов.

Результаты

Следуя протоколу, гистоны могут быть извлечены и идентифицированы с помощью анализа LC-MS. Необработанные данные и обработанные результаты доступны в MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) через присоединение: MSV000085770. На основе результатов TopPIC из репрезентативной выборки (доступно также от MassIVE), мы опреде?...

Обсуждение

Представленный протокол описывает, как извлечь гистоны из листьев сорго (или, в более общем плане, листьев растений) образцов. Средняя урожайность гистона, как ожидается, будет 2-20 мкг на 4-5 г материала листьев сорго. Материалы достаточно чисты для анализа гистона вниз по течению LC-MS (в осн...

Раскрытие информации

Ни один.

Благодарности

Мы благодарим Рональда Мура и Томаса Филлмора за помощь в экспериментах по масс-спектрометрии, а Также Мэтью Монро за осаждение данных. Это исследование финансировалось за счет грантов Министерства энергетики США (DOE) биологических и экологических исследований в рамках эпигенетического контроля засухи ответ в Сорго (EPICON) проекта под номером премии DE-SC0014081, от Министерства сельского хозяйства США (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), а также через Объединенный институт биоэнергетики (JBEI), объект, спонсируемый DOE (контракт DE-AC02-05CH11231) между Национальной лабораторией Лоуренса Беркли и Министерством здравоохранения. Исследование проводилось с использованием Лаборатории экологических молекулярных наук (EMSL) (grid.436923.9), Управления научных пользователей, спонсируемого Управлением биологических и экологических исследований.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileFisher ChemicalA955-4L
Dithiothreitol (DTT)Sigma43815-5G
EDTA, 500mM Solution, pH 8.0EMD Millipore Corp324504-500mL
Formic AcidThermo Scientific28905
Guanidine HydrochlorideSigmaG3272-100G
MgCl2SigmaM8266-100G
Potassium phosphate, dibasicSigmaP3786-100G
Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tabletsRoche5892791001
Sodium butyrateSigma303410-5GUsed for histone deacetylase inhibitor
Sodium Chloride (NaCl)SigmaS1888
Sodium FluorideSigmaS7020-100GUsed for phosphatase inhibitor
Sodium OrthovanadateSigma450243-10GUsed for phosphatase inhibitor
SucroseSigmaS7903-5KG
Tris-HClFisher ScientificBP153-500 g
Triton X-100SigmaT9284-100ML
Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)Bio-Rad142-5842
Disposables
Chromatography column (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
Mesh 100 filter clothMillipore SigmaNY1H09000This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.
Micropipette tips (P20, P200, P1000)Sigma
Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, ConicalGenesee Scientific28-103
Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mLSigma
Equipment
Analytical BalanceFisher Scientific01-912-401
Beakers (50mL – 2L)
Microcentrifuge with coolingFisher Scientific13-690-006
Micropipettes
Swinging-bucket centrifuge with coolingFisher Scientific
VortexFisher Scientific50-728-002
Water bath SonicatorFisher Scientific15-336-120

Ссылки

  1. Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
  2. Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
  3. Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
  4. Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
  5. Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
  6. Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
  7. Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
  10. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  11. Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
  12. Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
  13. Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).
  14. Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
  15. Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
  16. Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
  17. Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
  18. Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
  19. Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
  20. Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).
  21. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  22. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
  23. Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
  24. LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
  25. Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
  26. Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
  27. Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
  28. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
  29. Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , (2019).
  30. Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
  31. Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
  32. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
  33. Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
  34. Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
  35. Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
  36. Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

169

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены