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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo è stato sviluppato per estrarre efficacemente istoni intatti dai materiali fogliari di sorgo per la profilazione di modifiche post-tras trasunzionali istone che possono servire come potenziali marcatori epigenetici per aiutare le colture resistenti alla siccità ingegneristica.

Abstract

Gli istoni appartengono a una famiglia di proteine altamente conservate negli eucarioti. Impacchettano il DNA in nucleosomi come unità funzionali di cromatina. Le modifiche post-trascizionali (PTM) degli istoni, che sono altamente dinamiche e possono essere aggiunte o rimosse dagli enzimi, svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione dell'espressione genica. Nelle piante, i fattori epigenetici, comprese le PTT istono, sono correlati alle loro risposte adattive all'ambiente. Comprendere i meccanismi molecolari del controllo epigenetico può portare opportunità senza precedenti per soluzioni innovative di bioingegneria. Qui descriviamo un protocollo per isolare i nuclei e purificare gli istoni dal tessuto fogliare di sorgo. Gli istone estratti possono essere analizzati nelle loro forme intatte mediante spettrometria di massa dall'alto verso il basso (MS) accoppiata con cromatografia liquida in fase inversa (RP) online (LC). Le combinazioni e la stechiometria di più PTM sullo stesso proteoforma istono possono essere facilmente identificate. Inoltre, il ritaglio della coda istonale può essere rilevato utilizzando il flusso di lavoro LC-MS dall'alto verso il basso, producendo così il profilo PTM globale degli istoni principali (H4, H2A, H2B, H3). Abbiamo applicato questo protocollo in precedenza per profilare le PLOM istone dal tessuto fogliare di sorgo raccolte da uno studio sul campo su larga scala, volto a identificare marcatori epigenetici di resistenza alla siccità. Il protocollo potrebbe potenzialmente essere adattato e ottimizzato per il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq), o per lo studio delle PTM istonali in piante simili.

Introduzione

Si prevede che la crescente gravità e frequenza della siccità influirà sulla produttività delle colturecerealicole 1,2. Il sorgo è una coltura alimentare ed energetica di cereali nota per la sua eccezionale capacità di resistere alle condizioni di limitazionedell'acqua 3,4. Stiamo perseguendo la comprensione meccanicistica dell'interazione tra stress da siccità, sviluppo delle piante ed epigenetica delle piante disorgo [Sorgo bicolore (L.) Moench]. Il nostro precedente lavoro ha dimostrato forti connessioni tra microbioma vegetale e rizosfera nell'acclimatazione della siccità e risposte alivello molecolare 5,6,7. Questa ricerca spianerà la strada all'utilizzo dell'ingegneria epigenetica per adattare le colture ai futuri scenari climatici. Come parte degli sforzi per comprendere l'epigenetica, miriamo a studiare marcatori proteici che hanno un impatto sull'espressione genica all'interno dell'organismo vegetale.

Gli istoni appartengono a una famiglia altamente conservata di proteine negli eucarioti che confezionano il DNA in nucleosomi come unità fondamentali di cromatina. Le modifiche post-tras traslazione (PTM) degli istoni sono regolate dinamicamente per controllare la struttura della cromatina e influenzare l'espressione genica. Come altri fattori epigenetici, tra cui la metilazione del DNA, le PTM istono svolgono ruoli importanti in molti processibiologici 8,9. Test a base di anticorpi come le macchie occidentali sono stati ampiamente utilizzati per identificare e quantificare le PTT istonali. Inoltre, l'interazione delle PTM istonali e del DNA può essere efficacemente sondata dall'immunoprecipitazione della cromatina - sequenziamento (ChIP-seq)10. In ChIP-seq, la cromatina con PTM istonale mirato specifico è arricchita da anticorpi contro quel PTM specifico. Quindi, i frammenti di DNA possono essere rilasciati dalla cromatina arricchita e sequenziati. Vengono rivelate regioni di geni che interagiscono con la PTM istono mirata. Tuttavia, tutti questi esperimenti si basano fortemente su anticorpi di alta qualità. Per alcune varianti/omologhi istoni o combinazioni di PTM, lo sviluppo di anticorpi robusti può essere estremamente impegnativo (specialmente per più PTM). Inoltre, gli anticorpi possono essere sviluppati solo se è noto il PTM istonale mirato. 11 Pertanto, sono necessari metodi alternativi per una profilazione globale non mirata delle PTM istone.

La spettrometria di massa (SM) è un metodo complementare per caratterizzare le PTT istonali, comprese le PTM sconosciute per lequali non sono disponibili anticorpi 11,12. Il consolidato flusso di lavoro MS "bottom-up" utilizza le proteasi per digerire le proteine in piccoli peptidi prima della separazione della cromatografia liquida (LC) e del rilevamento della SM. Poiché gli istoni hanno un gran numero di residui di base (lisina e arginina), la digestione della tripsina (proteasi specifica della lisina e dell'arginina) nel flusso di lavoro standard dal basso verso l'alto taglia le proteine in peptidi molto brevi. I peptidi brevi sono tecnicamente difficili da analizzare per standard LC-MS e non conservano le informazioni sulla connettività e la stechiometria di più PTM. L'uso di altri enzimi o etichettatura chimica per bloccare le lisina genera peptidi più lunghi che sono più adatti per la caratterizzazione delle PTT istono13,14.

In alternativa, il passaggio di digestione può essere completamente omesso. In questo approccio "top-down", gli ioni proteici intatti vengono introdotti nella SM mediante ionizzazione elettrospray (ESI) dopo la separazione LC online, producendo ioni delle proteoforme istone intatte. Inoltre, gli ioni (cioè le proteoforme) di interesse possono essere isolati e frammentati nello spettrometro di massa per produrre gli ioni di sequenza per l'identificazione e la localizzazione della PTM. Pertanto, l'MS dall'alto verso il basso ha il vantaggio di preservare le informazioni a livello di proteoforma e acquisire la connettività di più PTM e troncazioni terminali sullo stesso proteoforma15,16. Gli esperimenti dall'alto verso il basso possono anche fornire informazioni quantitative e offrire approfondimenti sui biomarcatori al livello proteicointatto 17. Nel presente documento, descriviamo un protocollo per estrarre l'istono dalla foglia di sorgo e analizzare gli istoni intatti dall'alto verso il basso LC-MS.

I dati di esempio riportati nella figura 1 e nella figura 2 provengono dalla foglia di sorgo raccolta alla settimana 2 dopo la semina. Sebbene sia prevista una variazione della resa, questo protocollo è generalmente indipendente da specifiche condizioni di campionamento. Lo stesso protocollo è stato utilizzato con successo per il tessuto fogliare vegetale di sorgo raccolto da 2, 3, 5, 8, 9 e 10 settimane dopo la semina.

Protocollo

1. Preparazione del materiale fogliare di sorgo

NOTA: Le piante di sorgo sono state coltivate nel suolo del settore a Parlier, CA.

  1. Raccogliere le foglie di sorgo dalle piante in tubi di centrifuga da 50 ml e congelare immediatamente il tubo in azoto liquido. Raccogli il tessuto fogliare strappando la terza e la quarta foglia completamente emersa dal timone primario.
    NOTA: Ulteriori dettagli sulle condizioni del campo, sulla crescita del campione e sulla raccolta sono disponibili nel reportpubblicato 18.
  2. Macinare le foglie con azoto liquido e trasferire immediatamente in un tubo di centrifuga.
  3. Conservare la foglia di terra a -80 °C fino all'uso. Prendi circa 4 g di polvere di foglie crio-macinate per l'analisi istono di ogni campione.

2. Preparazione di tamponi e materiali (3-4 h)

NOTA: Le soluzioni stock ad alta concentrazione possono essere realizzate in anticipo e conservate fino all'uso. Ma tutti i tamponi di lavoro devono essere resi freschi il giorno dell'estrazione (diluizione dal magazzino e miscelazione con altri contenuti) e devono essere posti sul ghiaccio durante il processo. L'intero esperimento deve essere eseguito a 4 °C, salvo diversa indicazione.

  1. Preparare il saccarosio di 2,5 M sciogliendo 42,8 g di saccarosio (342,30 g/mol) in 15 mL di acqua sterile su piastra termica in un contenitore di vetro con agitazione continua. Portare il volume a 50 mL una volta che il saccarosio si è completamente sciolto. Conservare il saccarosio in 4 °C fino all'uso.
  2. Preparare 1 M Tris pH 8 sciogliendo 1.576 g di Tris HCl in 10 mL di H2O in un tubo di centrifuga da 15 ml. Regolare il pH con NaOH a 8 e controllare con carta pH. Conservarlo a 4 °C fino all'uso.
  3. Preparare 1 M Ditiothreitol (DTT) pesando 231 mg di DTT (154,25 g/mol) e scioglierlo in acqua sterile da 1,5 mL. DTT deve essere reso fresco o utilizzare aliquote congelate immagazzinate.
  4. (Facoltativo) Preparare gli inibitori aggiuntivi mescolando tre diversi sali. Preparare 18,38 mg di ortovanato di sodio (183,91 g/mol) in 1 mL di acqua sterile, quindi preparare separatamente il butyrato di sodio aggiungendo 11,008 mg di butirato di sodio (110,09 g/mol) in 1 mL di acqua sterile. Preparare il sale finale aggiungendo 4,199 mg di fluoruro di sodio (41,99 g/mol) in 1 mL di acqua. Mescolare le tre soluzioni di sale insieme in volume uguale come soluzione stock per "inibitori aggiuntivi" (33 mM di ciascuna delle tre sostanze chimiche).
    NOTA: Il vanadate di sodio polimerizza a concentrazioni superiori a 0,1 mM sotto pH neutro. Si consiglia di attivare il vanadate di sodio per depolimerizzarlo per la massima efficacia a seguito dei protocollipubblicati 19. In alternativa, il vanadato di sodio attivato è disponibile in commercio. In questo caso, il vanadate di sodio non è stato attivato intenzionalmente, quindi l'efficacia non si riduce. Il vanadate di sodio attivato non è ancora stato testato per questo protocollo.
  5. Preparare 1 M di MgCl2 sciogliendo 0,952 g di cloruro di magnesio anidro (95,2 g/mol) in 10 ml di H2O in un tubo di centrifuga da 15 ml. Conservare 1 M MgCl2 a 4 °C fino all'uso.
  6. Preparare il 10% (v/v) Triton X-100 mescolando 53,5 g di Tritone X-100 con 35 mL di acqua sterile, portare fino a 50 mL con acqua e conservarlo a temperatura ambiente.
  7. Preparare il 5% di guanidina tampone pH7 (indicato come "tampone Gdn") che verrà utilizzato per condizionare la resina almeno durante la notte – preparare 0,1 M di dibasico di fosfato di idrogeno di potassio (K2HPO4)pesando 870 mg di K2HPO4 e sciogliendolo in 50 mL di acqua sterile e conservare a 4 °C.
  8. Pesare 0,7 g di cloridrato di guanidina e sciogliere in 0,1 M K2HPO4 ad un volume finale di 14 mL. Regolare il pH a 7 controllando con carta pH.
  9. Immergere la resina a secco a debole scambio di cationi (WCX) nel 5% di guanidina tampone pH 7 durante la notte. Rimuovere il supernatante e ricaricare con un tampone fresco del 5% di Gdn e immergerlo di nuovo durante la notte per lasciare che la resina equilibra completamente (fino a quando il supernatante non ha lo stesso pH del tampone originale).
  10. Prima di iniziare l'esperimento nella sezione successiva, mescolare i reagenti per creare il buffer EB1, EB2A ed EB2B basato sulla tabella 1. Aggiungere tutti gli inibitori e DTT freschi poco prima dell'uso.
ReagentiConcentrazione di scorteEB1EB2AEB2B
Volume (mL)Volume (mL)Volume (mL)
Saccarosio2,5 milioni di ecu4.41.250.5
Tris HCl pH81M0.250.1250.05
Dtt1M0.1250.06250.025
H2O20.2259.68754.375
compressa inibitore della proteasi (PI)0,5 pillola0,5 pillola0,5 pillola
Inibitori aggiuntivi (facoltativo)33mM0.250.1250.05
MgCl2 1M0.1250.05
Tritone X10010%1.25
Volume complessivo25 mL12,5 mL5 mL

Tabella 1: Composizione dei tamponi di estrazione (RB).

  1. Rendere il buffer di analisi dei nuclei (NLB) basato sulla tabella 2. Preparare bilanciamento carico di rete in anticipo e conservare a 4 °C fino all'uso. Aggiungere compresse PI fresche poco prima dell'uso a 1x (0,5 compresse per 5 mL). Cfr. tabella 2 per volumi specifici.
NlbConcentrazione di scorteVolume (mL)
Nacl5M0.4
Tris HCl pH81M0.05
Tritone X10010%0.5
Edta0,5 milioni di ecu0.2
H2O3.85
Tablet PI0,5 pillola
Inibitori aggiuntivi (facoltativo)33mM0.05
Volume complessivo5 mL

Tabella 2: Composizione della tampone di analisi dei nuclei (NLB).

3. Procedura di isolamento dei nuclei

NOTA: Si consiglia di eseguire i passaggi 3.1–3.3 del primo giorno (2-3 h), salvare i nuclei in tampone NLB a -80 °C e riprendere il giorno successivo (o più tardi) per la purificazione delle proteine (4 h). Le fasi di isolamento dei nuclei in questo protocollo sono state adattate da un protocollo ChIP-seq di sorgo utilizzato presso il Joint Genome Institute. Possono essere necessari lavaggi aggiuntivi e separazione del gradiente di saccarosio per garantire la purezza dei nuclei per le applicazioni chIP-seq.

  1. Filtrazione dei detriti (~0,5 h)
    1. Pesare la polvere di foglie macinate ~ 4 g, assicurando che rimanga congelata posizionando sul ghiaccio secco o sull'azoto liquido fino a quando non è pronto per l'uso.
    2. Aggiungere compresse inibitorie della proteasi a EB1 a una concentrazione finale di 0,2x (0,5 compresse per 25 mL per campione). Utilizzare un pestello di plastica in miniatura o una punta di pipetta per pre-schiacciare le compresse in un tubo di microcentrifugo prima di aggiungere ai tamponi per aiutare nella dissoluzione della compressa nel tampone. Per evitare la perdita di materiale, aggiungere la compressa PI e sonicare il buffer per sciogliere la compressa.
    3. Aggiungere 20 mL di EB1 alla polvere di foglie macinate congelate, delicatamente vortice e mescolarli fino a quando la polvere non è completamente sospesa. Continuare a mescolare delicatamente per ~ 10 minuti.
    4. Filtrare attraverso la rete 100, risciacquando il materiale filtrato due volte con 2 mL di EB1 ogni volta.
      NOTA: Sia il filtrato che i detriti filtrati devono essere verdi. Se si traccia utilizzando un microscopio, si dovrebbe essere in grado di vedere nuclei intatti e cloroplasti intatti nel filtrato a questo punto. La maggior parte dei detriti di grandi dimensioni dovrebbe essere assente / impoverita. Mescolare coloranti come il blu di metilene con il campione. I nuclei sono facilmente osservabili come sfere blu scuro/acquamarina di circa 3-5 μm di diametro quando vengono visualizzati usando un obiettivo 20x, 40x e/o 100x. Rispetto ai nuclei, i cloroplasti sono di dimensioni simili, ma di colore verdastro e spesso di forma più ovale. I vacuoli sono anche simili ai nuclei per dimensioni e forma, ma non prenderanno prontamente il colorante blu di metilene.
    5. Centrifugare il filtrato combinato a 3.000 x g per 10 min a 4 °C in un rotore a secchio oscillante per pellet debris e grandi organelli subcellulari, inclusi nuclei e cloroplasti.
      NOTA: Si consiglia di preparare EB2A durante questo giro (vedere il passaggio 3.2.1).
    6. Decantare il supernatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
      NOTA: Poiché non è stato ancora aggiunto alcun detergente, il pellet deve rimanere verde intenso e il supernatante deve essere, al massimo, verde pallido / giallo.
  2. Llisi degli organelli non bersaglio (~0,5 h)
    1. Preparare EB2A aggiungendo inibitori della proteasi a una concentrazione finale di 0,4x (0,5 compresse per 12,5 mL EB2A).
    2. Rimorsi il pellet dal passo 3.1.6 in 5 mL di EB2A e incubare sul ghiaccio per 10 minuti con miscelazione delicata.
      NOTA: La concentrazione di detergenti deve essere ottimizzata per lyse preferenzialmente cellule intatte e cloroplasti ma non nuclei. La quantità richiesta può variare tra gli organismi. Si raccomanda di verificare la lisi dei cloroplasti e la ritenzione di nuclei intatti al microscopio.
    3. Centrifuga a 2.100 x g per 15 min a 4 °C in un rotore a secchio oscillante per pellet detriti e nuclei.
      NOTA: In questa fase, il supernatante dovrebbe essere intensamente verde e il pellet dovrebbe essere molto meno verde di quanto osservato nelle fasi precedenti a causa dellalisi dei cloroplasti e del rilascio di clorofilla nel citosol.
    4. Decantare il supernatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
  3. Isolamento dei nuclei dai contaminanti citoplasmatici rimanenti (~0,5 h)
    1. Preparare EB2B aggiungendo inibitori della proteasi a una concentrazione finale di 1x (0,5 compresse per 5 mL EB2B).
    2. Resuspend pellet nucleare grezzo dalla fase 3.2.3 in 2 mL di EB2B.
      NOTA: EB2B non contiene Tritone X-100, quindi a questo punto non dovrebbe verificarsi alcunalisi aggiuntiva.
    3. Centrifuga a 2.100 x g per 15 min a 4 °C in un rotore a secchio oscillante per pellet detriti e nuclei.
      NOTA: Piccoli organelli e componenti citoplasmatici non devono pellet, quindi dovrebbero rimanere nel supernatante.
    4. Decantare il supernatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
    5. Rimescolare il pellet utilizzando 250 μL di NLB (aggiungere 0,5 compressa inibitore della proteasi fresca per 5 mL).
      NOTA: L'obiettivo è quello di rimosocciare i nuclei in una quantità minima di NLB senza perdite materiali significative. Poiché nlb è molto viscoso e il pellet contiene una grande quantità di detriti insolubili, è molto difficile pipettare e tende ad aggrapparsi all'interno delle punte delle pipette. Per questo motivo, si consiglia di riutilizzare la stessa punta della pipetta quando possibile. Se si tratta di materiale residuo in una punta di pipetta, è sufficiente appendere la pipetta da un ripiano o da un rack per ~ 1 minuto per consentire alla gravità di raccogliere il materiale all'apertura della punta. Non pipettare aggressivamente per rimorsi i pellet. Utilizzare invece la punta della pipetta come asta di agitazione fino a quando il materiale pelletato non può essere aspirato nella punta della pipetta. vale a dire, va benissimo che grandi grumi di pellet rimangano in questa fase purché possano essere disegnati in una punta di pipetta.
    6. Vortice 15 s al massimo per omogeneizzare e resospensare parzialmente il materiale. Sonicare per 5 minuti a 4 °C, quindi conservare a -80 °C.
      NOTA: Per i passaggi successivi, tenere presente che la quantità totale di BILANCIAMENTO carico di rete aggiunto è di 250 μL, ma il volume apparente totale del campione può essere fino al doppio a causa di detriti insolubili. Il campione viene congelato e scongelato per facilitare la lisi dei nuclei.
  4. Lisi dei nuclei ed estrazione dell'istone (~4 h)
    1. Aggiungere 750 μL di tampone Gdn al 5% di tampone di scongelato. Sonicare per 15 minuti a 4 °C.
    2. Trasferire il campione in un singolo tubo da 2 ml e girare 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
      NOTA: Il supernatante probabilmente avrà un aspetto verde. I seguenti passaggi di cromatografia dovrebbero rimuovere la maggior parte dei pigmenti dalla proteina.
    3. In attesa dei gradini 3.4.1 e 3.4.2, preparare la colonna per la pulizia della cromatografia a scambio ionico. Risciacquare la colonna cromatografica con 2 mL di acetonitrile e 4 mL di acqua per ridurre al minimo la contaminazione in superficie.
    4. Caricare 200~300 μL di resina WCX (precondidenne con tampone Gdn al 5%) sulla colonna cromatografica. Lascia depositare la resina. Lavare quattro volte con 1 mL di tampone Gdn al 5%. Tenere il tubo e la colonna sul ghiaccio per il resto dei passaggi di purificazione.
    5. Metti la colonna cromatografica su un tubo di raccolta da 2 ml. Caricare lentamente il supernatante dal passaggio 3.4.2 sul letto di resina senza interrompere la resina (provare a cadere lentamente dal lato dei tubi). Lascia che la soluzione fluisa per gravità. Mentre la soluzione scorre, caricare l'eluente nella parte superiore della colonna 6-8 volte per consentire il massimo legame con la resina. Quindi, scartare l'eluente.
    6. Caricare 2 mL di tampone Gdn al 5% per lavare le proteine non istone dalla colonna. Scartare l'eluente.
    7. Elute istoni con 1 mL 20% Gdn buffer. Raccogli l'eluente, che contiene proteine istono.
    8. Utilizzare il filtro di spin mwco (3 kDa molecular weight cut off) (0,5 mL) per disaltare l'eluente dal passo 3.4.6. Prima dell'uso, caricare 500 μL di solvente da lavaggio (0,2% di acido formico nel 3% di ACN) e farlo girare due volte per pulire il filtro.
      NOTA: Si consiglia di iniziare a lavare il filtro MWCO durante l'esecuzione dei passaggi di cromatografia della resina per risparmiare tempo. I seguenti passaggi del filtro di rotazione fanno ~3-4 h.
    9. Primo carico 500 μL di campione di istono, girare a 14.000 x g per ~25 min per ridurre il volume fino a ~100 μL. Quindi caricare altri 400 μL di campione e girare di nuovo a 14.000 x g per ~ 25 minuti. Caricare gli ultimi 100 μL del campione, sciacquare il tubo del campione con solvente da lavaggio da 300 μL e caricare il solvente nel filtro. Gira di nuovo a 14.000 x g per ~ 25 minuti.
    10. Caricare 400 μL di solvente da lavaggio, girare a 14.000 x g per ~25 min per ridurre il volume a ~100 μL o meno. Ogni ciclo riduce la concentrazione di sale di un quinto. Ripetere per altri tre cicli per portare la concentrazione di guanidina a ~0,01%. Invertire il filtro in un tubo di raccolta pulito e ruotare a 1.000 x g per 2 minuti. Salvare il campione di istone purificato a -20 °C o -80 °C per l'analisi.
      NOTA: Si consiglia di ruotare più a lungo (30-40 min) all'ultimo passaggio per ridurre al minimo il volume del campione per ottenere una concentrazione più elevata. Il volume dovrebbe essere in grado di scendere a 50-70 μL.

4. Spettrometria di massa degli istoni purificati

  1. Acquisizione dati spettrometria di massa cromatografica liquida (LC-MS)
    1. Stimare la concentrazione proteica mediante saggio di acido bicinchoninico (BCA) seguendo il protocollo del produttore.
      NOTA: BCA può fornire solo una stima della concentrazione totale di proteine, ma non la qualità della purificazione dell'istone. Se la strumentazione MS non è prontamente disponibile per controllare la qualità della purificazione dell'istone, è possibile utilizzare la macchia occidentale. LC in fase invertita abbinato al rilevamento dell'assorbanza ultravioletta di 210 nm come descritto nel nostro rapporto precedente può essere utilizzatoanche 20. Il cromatogramma può essere confrontato con uno standard noto per il controllo della qualità del campione. Tuttavia, organismi diversi possono avere diversi profili di eluizione. Pertanto, è altamente raccomandato l'uso di standard istoni di organismi simili.
    2. Collegare una colonna analitica a fase invertita C18 (RP) (ad esempio, 3 μm 300 Å, colonna diametro interno 75 μm, diametro esterno 360 μm, lunghezza 70 cm) e una colonna trappola C18 (ad esempio, 3,6 μm, diametro interno della colonna 150 μm, diametro esterno 360 μm, lunghezza 5 cm) a un sistema di cromatografia liquida a nanoflusso a doppia pompa (ad esempio, Waters NanoAcquity). I solventi binari sono A: 0,1% acido formico in acqua, e B: 0,1% acido formico in acetonitrile.
      NOTA: La doppia pompa LC include una pompa di lavaggio e una pompa a gradiente. Entrambe le pompe passano attraverso due fasi di ciascuna analisi: una fase di cattura seguita dalla fase analitica. Nella fase di intrappolamento, la pompa di lavaggio fluisce nella colonna trappola e la pompa gradiente fluisce nella colonna analitica. Nella fase analitica, la colonna trap è accoppiata con la colonna analitica e la pompa gradiente fluisce in entrambe le colonne. La pompa di lavaggio va quindi ai rifiuti.
    3. Fase di abbondanza: impostare il metodo LC per caricare prima 1-2 μg di campione di istone sulla colonna trap. Essiccare il campione dalla pompa di lavaggio a 3 μL/min 5% di solvente B per 10 min. Impostare la pompa analitica a 0,3 μL/min 5% di solvente B per l'equilibrazione.
    4. Fase analitica: impostare la pompa di gradiente (0,3 μL/min) per iniziare dal 5% B e dalla rampa al 30% a 15 minuti. Quindi, aumentare al 41% B a 100 min prima di un lavaggio organico elevato fino al 95% B alla fine.
      NOTA: la sfumatura può essere ottimizzata a seconda dei diversi profili di ritenzione sulle singole colonne. In genere, gli istoni a figura intera elutano circa il 30%-40% B nelle condizioni LC specificate. Gradienti più lunghi possono essere usati per aumentare il numero di spettri MS2 per catturare più proteoforme istono.
    5. Impostare un metodo di acquisizione dipendente dai dati su una SM ad alta risoluzione (ad esempio, Thermo Orbitrap Fusion Lumos o simili) con capacità etd (Electron Transfer Dissociation). Utilizzare la modalità proteina intatta ed eseguire tutte le calibrazioni necessarie come suggerito dal produttore. I parametri critici sono descritti di seguito. Questi saranno specifici per lo strumento utilizzato.
      1. MS1: intervallo di scansione 600-2.000 m/z, risoluzione 120k (a m/z 200), 4 microscan, obiettivo AGC 1E6, iniezione massima 50 ms.
      2. MS2: risoluzione 120k; 1 microscan; Obiettivo AGC 1E6; MS/MS dipendente dai dati: ETD alternato (tempo di reazione di 25 ms, tempo massimo di iniezione 500 ms) e dissociazione collisionale ad alta energia (HCD, 28% di energia di collisione normalizzata con energia a gradini del ±5%, tempo massimo di iniezione 100 ms); finestra di isolamento di 0,6 Da; priorità sugli stati di carica più elevati.
      3. Esclusione dinamica: finestra di tempo di 120 s, ± di massa da 0,7 Da. Escludere gli stati di addebito inferiori a 5 e gli stati di carica indeterminati.
    6. Eseguire alcune iniezioni di peptide o standard istono su nuove colonne per equilibrare e controllare il sistema, prima di eseguire i campioni effettivi. Per eseguire un gran numero di campioni, aggiungere brevi spazi vuoti o lavaggi tra i campioni per ridurre al minimo il riporto. Lasciare che le colonne equilibrano per 15-20 min alla condizione iniziale (5% solvente B) prima del campione successivo.
      NOTA: Gradienti LC più lunghi e tempi di iniezione massima più elevati per MS2 possono migliorare la qualità spettrale per identificare più proteoforme istono.
  2. Elaborazione dei dati LC-MS e identificazione proteoforme
    1. Ottenere la sequenza proteica (sorgo) in formato FASTA da JGI (https://genome.jgi.doe.gov) o UniProt (https://www.uniprot.org/).
    2. Utilizzate MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) per convertire i file di dati grezzi dello strumento (*.raw) in formato mzML.
    3. Scarica toppic suite22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) per l'elaborazione dei dati. Il programma può essere eseguito sia nella riga di comando che attraverso l'interfaccia grafica.
    4. Utilizzare TopFD nella suite TopPIC per deconvolutare gli spettri dal file mzML dal passaggio 4.2.2. È possibile utilizzare i parametri predefiniti. Ma la "finestra precursore" (-w) deve essere ridotta a 1 m/z perché viene utilizzata una stretta finestra di isolamento.
    5. Utilizzare TopPIC nella suite TopPIC per identificare i proteoformi. È possibile utilizzare la maggior parte dei parametri predefiniti. Impostare il tipo di taglio dello spettro e del proteoforma su FDR (false discovery rate) e impostare il valore di cutoff su 0,01 (1% FDR) o come desiderato. Impostare la "tolleranza di errore proteoforme" su 5 (Dalton). Caricare il file FASTA dal passaggio 4.2.1 e il file "*_ms2.msalign" dal passaggio 4.2.4. Quindi avviare la ricerca.
      NOTA: L'impostazione "tolleranza di errore proteoforma" combinerà proteoforme con masse simili (± 5 Da) come una sola. Ciò aiuta a ridurre la ridondanza nel conteggio dei proteoformi. Tuttavia, dovrebbe essere usato con cautela perché una grande tolleranza unirà proteoforme con piccole o nessuna differenza di massa. Questo parametro è disponibile solo in TopPIC versione 1.3 o successiva.
    6. I proteoformi identificati possono essere esaminati nel file "*_proteoform.csv" o visualizzati utilizzando il modulo Topview nella cartella "*_html" dell'output.
    7. L'elenco delle proteoforme generato dai passaggi precedenti utilizzando TopPIC annota le PTM istono come spostamenti di massa. Per localizzare le singole PTM, è necessario includere un elenco di modifiche. Una descrizione dettagliata è disponibile nel manuale TopPIC. In alternativa, procedere al passaggio successivo per eseguire un'analisi complementare dei dati utilizzando il pacchetto Informed-Proteomics23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
    8. Seguire le istruzioni e utilizzare il modulo PbfGen per convertire i dati grezzi dello strumento in un file PBF. Quindi deconvolutare i dati MS1 utilizzando il modulo ProMex per generare un file ms1ft (elenco di funzionalità, ogni feature rappresenta una combinazione univoca di tempo di massa e conservazione).
    9. Creare un FASTA mirato per la proteomica informata utilizzando l'elenco delle proteine identificato da TopPIC nel passaggio 4.2.6.
      NOTA: La ricerca dell'intero genoma utilizzando la proteomica informata con un gran numero di PTM variabili può essere estremamente lenta e causare arresti anomali. Pertanto, si consiglia di ridurre le dimensioni di FASTA includendo solo le proteine bersaglio.
    10. Creare un elenco di modifiche di destinazione per cercare le PTT istoni seguendo il formato nel file di esempio. Le PTM comuni da includere sono: acetilazione della lisina, mono-metilazione della lisina, dimetilazione della lisina, trimetilazione della lisina, fosforilazione serina/treonina/tirosina, acetilazione N-terminale proteica, ossidazione metinina/cisteina. Per il sorgo, devono essere aggiunte la monometilazione n-terminale proteica, la dimetilazione e la trimetilazione.
      NOTA: Informed-Proteomics cerca solo le PTT specificate nell'elenco. Se sono presenti PTM non specificate, il proteoforma potrebbe non essere identificato o essere erroneamente identificato con altre proteoforme. Tuttavia, l'elenco PTM deve essere mantenuto il più breve possibile per ridurre al minimo il tempo di ricerca.
    11. Eseguire il modulo MSPathFinder per identificare i proteoform utilizzando i file del passaggio 4.2.8, il FASTA focalizzato del passaggio 4.2.9 e l'elenco delle modifiche del passaggio 4.2.10. È possibile utilizzare i parametri predefiniti.
    12. I risultati possono essere visualizzati in LcMsSpectator caricando tutti i file dei risultati.
      NOTA: Altri strumenti di bioinformatica sono disponibili per l'elaborazione e la visualizzazione dei dati top-down, ognuno con i propripunti di forza 24,25,26,27,28. Il sorgo e molti altri organismi hanno informazioni note limitate sulle PTT istono nel database. Utilizzare prima TopPIC per identificare i turni di massa dalle PTM. Questa analisi può facilmente scoprire PTM conosciute e sconosciute. Quindi, le PTM rilevate possono essere cercate in modo mirato specificando un elenco PTM in TopPIC o con altri strumenti complementari.

Risultati

Seguendo il protocollo, gli istoni possono essere estratti e identificati utilizzando l'analisi LC-MS. I dati grezzi e i risultati elaborati sono disponibili presso MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) tramite l'adesione: MSV000085770. Sulla base dei risultati TopPIC del campione rappresentativo (disponibile anche da MassIVE), abbiamo identificato 303 proteoforme istone (106 proteoforme H2A, 72 H2B, 103 H3 e 22 proteoforme H4). Sono state rilevate anche proteoforme ribosomiali co-purificate, tipicamente eluizzanti all'ini...

Discussione

Il protocollo presentato descrive come estrarre gli istoni da campioni di foglie di sorgo (o più in generale foglie vegetali). La resa media dell'istone dovrebbe essere di 2-20 μg per 4-5 g di materiale fogliare di sorgo. I materiali sono sufficientemente puri per l'analisi dell'istone a valle da parte di LC-MS (per lo più istoni con contaminazione da proteine ribosomiali ~20%). È possibile ottenere una resa inferiore a causa di variazioni del campione o potenziali errori di gestione/guasti in tutto il protocollo. Ma...

Divulgazioni

Nessuno.

Riconoscimenti

Ringraziamo Ronald Moore e Thomas Fillmore per aver aiutato con gli esperimenti di spettrometria di massa e Matthew Monroe per la deposizione dei dati. Questa ricerca è stata finanziata da sovvenzioni del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti (DOE) Biological and Environmental Research attraverso il progetto Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) con il numero di premio DE-SC0014081, del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), e attraverso il Joint BioEnergy Institute (JBEI), una struttura sponsorizzata da DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) tra Lawrence Berkeley National Laboratory e DOE. La ricerca è stata eseguita utilizzando l'Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), un DOE Office of Science User Facility sponsorizzato dall'Office of Biological and Environmental Research.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileFisher ChemicalA955-4L
Dithiothreitol (DTT)Sigma43815-5G
EDTA, 500mM Solution, pH 8.0EMD Millipore Corp324504-500mL
Formic AcidThermo Scientific28905
Guanidine HydrochlorideSigmaG3272-100G
MgCl2SigmaM8266-100G
Potassium phosphate, dibasicSigmaP3786-100G
Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tabletsRoche5892791001
Sodium butyrateSigma303410-5GUsed for histone deacetylase inhibitor
Sodium Chloride (NaCl)SigmaS1888
Sodium FluorideSigmaS7020-100GUsed for phosphatase inhibitor
Sodium OrthovanadateSigma450243-10GUsed for phosphatase inhibitor
SucroseSigmaS7903-5KG
Tris-HClFisher ScientificBP153-500 g
Triton X-100SigmaT9284-100ML
Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)Bio-Rad142-5842
Disposables
Chromatography column (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
Mesh 100 filter clothMillipore SigmaNY1H09000This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.
Micropipette tips (P20, P200, P1000)Sigma
Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, ConicalGenesee Scientific28-103
Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mLSigma
Equipment
Analytical BalanceFisher Scientific01-912-401
Beakers (50mL – 2L)
Microcentrifuge with coolingFisher Scientific13-690-006
Micropipettes
Swinging-bucket centrifuge with coolingFisher Scientific
VortexFisher Scientific50-728-002
Water bath SonicatorFisher Scientific15-336-120

Riferimenti

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