Isolamento de Histone do tecido da folha de sorgo para perfil de espectrometria de massa de top down de potenciais marcadores epigenéticos

Resumo

O protocolo foi desenvolvido para extrair efetivamente histonas intactas de materiais de folhas de sorgo para o perfil de modificações pós-translacionais de histona que podem servir como potenciais marcadores epigenéticos para ajudar as culturas resistentes à seca de engenharia.

Resumo

Histones pertencem a uma família de proteínas altamente conservadas em eucariotes. Eles embalam DNA em nucleosósmos como unidades funcionais de cromatina. Modificações pós-translacionais (PTMs) de histones, que são altamente dinâmicas e podem ser adicionadas ou removidas por enzimas, desempenham papéis críticos na regulação da expressão genética. Nas plantas, fatores epigenéticos, incluindo PTMs histonas, estão relacionados às suas respostas adaptativas ao meio ambiente. Compreender os mecanismos moleculares do controle epigenético pode trazer oportunidades sem precedentes para soluções inovadoras de bioengenharia. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar os núcleos e purificar histones do tecido da folha de sorgo. As histonas extraídas podem ser analisadas em suas formas intactas por espectrometria de massa superior para baixo (MS) juntamente com cromatografia líquida de fase invertida on-line (RP) (LC). Combinações e estequiometria de múltiplos PTMs na mesma histona proteoforma podem ser facilmente identificadas. Além disso, o recorte da cauda de histone pode ser detectado usando o fluxo de trabalho LC-MS de cima para baixo, produzindo assim o perfil global PTM de histones centrais (H4, H2A, H2B, H3). Aplicamos este protocolo anteriormente para traçar o perfil de PTMs histítonos a partir de tecido de folha de sorgo coletados de um estudo de campo em larga escala, com o objetivo de identificar marcadores epigenéticos de resistência à seca. O protocolo poderia potencialmente ser adaptado e otimizado para sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq), ou para estudar PTMs de histona em plantas semelhantes.

Introdução

Espera-se que a gravidade e a frequência crescentes da seca afetem a produtividade das culturas cereais^1,2. O sorgo é uma cultura de alimentos e energia de cereais conhecida por sua excepcional capacidade de suportar condições limitantes da água^3,4. Estamos buscando a compreensão mecanicista da interação entre o estresse da seca, o desenvolvimento das plantas e a epigenética das plantas desorgo bicolor (L.) Moench). Nosso trabalho anterior demonstrou fortes conexões entre microbioma vegetal e rizosfera na aclimatação da seca e respostas no nível molecular^5,6,7. Esta pesquisa abrirá caminho para a utilização da engenharia epigenética na adaptação das culturas aos cenários climáticos futuros. Como parte dos esforços na compreensão da epigenética, pretendemos estudar marcadores proteicos que impactam a expressão genética dentro do organismo vegetal.

Histones pertencem a uma família altamente conservada de proteínas em eucariotes que embalam DNA em nucleosósmos como unidades fundamentais de cromatina. Modificações pós-translacionais (PTMs) de histones são dinamicamente reguladas para controlar a estrutura da cromatina e influenciar a expressão genética. Como outros fatores epigenéticos, incluindo a metilação do DNA, os PTMs histonas desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos^8,9. Ensaios baseados em anticorpos, como manchas ocidentais, têm sido amplamente usados para identificar e quantificar PTMs histonas. Além disso, a interação de PTMs histonas e DNA pode ser efetivamente sondada pela imunoprecipitação chromatina – sequenciamento (ChIP-seq)¹⁰. Em ChIP-seq, cromatina com histone PTM específico é enriquecida por anticorpos contra esse PTM específico. Então, os fragmentos de DNA podem ser liberados da cromatina enriquecida e sequenciados. Regiões de genes que interagem com o ptm histona-alvo são reveladas. No entanto, todos esses experimentos dependem fortemente de anticorpos de alta qualidade. Para algumas variantes/homólogos de histona ou combinações de PTMs, o desenvolvimento de anticorpos robustos pode ser extremamente desafiador (especialmente para vários PTMs). Além disso, anticorpos só podem ser desenvolvidos se o PTM de histona-alvo for conhecido. ¹¹ Portanto, são necessários métodos alternativos para perfis não-alvos globais de PTMs histonas.

A espectrometria de massa (MS) é um método complementar para caracterizar PTMs histonas, incluindo PTMs desconhecidos para os quais os anticorpos não estão disponíveis^11,12. O bem estabelecido fluxo de trabalho "bottom-up" usa proteases para digerir proteínas em pequenos peptídeos antes da separação da cromatografia líquida (LC) e da detecção de ESM. Como as histonas têm um grande número de resíduos básicos (lise e arginina), a digestão de trippsina (protease específica para lysina e arginina) no fluxo de trabalho padrão de baixo para cima corta as proteínas em peptídeos muito curtos. Os peptídeos curtos são tecnicamente difíceis de analisar pela LC-MS padrão, e não preservam as informações sobre a conectividade e estequiometria de múltiplos PTMs. O uso de outras enzimas ou rotulagem química para bloquear a lises gera peptídeos mais longos que são mais adequados para caracterização de PTMs histone^13,14.

Alternativamente, o passo de digestão pode ser completamente omitido. Nesta abordagem "de cima para baixo", íons proteicos intactos são introduzidos no MS por ionização eletrospray (ESI) após a separação on-line da LC, produzindo íons dos proteoformes de histona intactos. Além disso, íons (ou seja, proteoforms) de interesse podem ser isolados e fragmentados no espectrômetro de massa para produzir os íons sequenciais para identificação e localização de PTM. Assim, a MS de cima para baixo tem a vantagem de preservar as informações de nível proteoforme capturar a conectividade de múltiplos PTMs e truncações terminais na mesma proteoforme^15,16. Experimentos de cima para baixo também podem fornecer informações quantitativas e oferecer insights de biomarcadores no nível de proteína intacta^{nível 17}. Aqui, descrevemos um protocolo para extrair histona da folha de sorgo e analisar as histonas intactas por LC-MS de cima para baixo.

Os dados de exemplo mostrados na Figura 1 e Figura 2 são da folha de sorgo coletada na semana 2 após o plantio. Embora a variação de rendimento seja esperada, este protocolo é geralmente agnóstico para condições amostrais específicas. O mesmo protocolo tem sido usado com sucesso para tecido de folha de plantas de sorgo coletados de 2, 3, 5, 8, 9 e 10 semanas após o plantio.

Protocolo

1. Preparando material de folha de sorgo

NOTA: As plantas de sorgo foram cultivadas em solo no campo em Parlier, CA.

1. Colete folhas de sorgo das plantas em tubos de centrífugas de 50 mL e congele imediatamente o tubo em nitrogênio líquido. Coletar tecido de folha arrancando a terceira e quarta folha totalmente emergida do leme primário.
   NOTA: Mais detalhes sobre condição de campo, crescimento amostral e coleta podem ser encontrados no relatório publicado¹⁸.
2. Moer folhas com nitrogênio líquido e transferir imediatamente para um tubo de centrífuga.
3. Armazene a folha de terra a -80 °C até usar. Tome cerca de 4 g de pó de folha moída crio-moída para análise de histona de cada amostra.

2. Preparação de tampões e materiais (3-4 h)

NOTA: As soluções de estoque de alta concentração podem ser feitas com antecedência e armazenadas até o uso. Mas todos os buffers de trabalho devem ser fabricados frescos no dia da extração (por diluição do estoque e mistura com outros conteúdos) e para serem colocados no gelo durante o processo. Todo o experimento deve ser realizado a 4 °C, a menos que seja recomendado o contrário.

1. Prepare 2,5 M de sacarose dissolvendo 42,8 g de sacarose (342,30 g/mol) em 15 mL de água estéril na placa de calor em um recipiente de vidro com agitação contínua. Elere o volume para 50 mL uma vez que a sacarose tenha dissolvido completamente. Guarde a sacarose em 4 °C até usar.
2. Prepare 1 M Tris pH 8 dissolvendo 1,576 g de Tris HCl em 10 mL de H₂O em um tubo centrífuga de 15 mL. Ajuste o pH com NaOH para 8 e verifique com papel pH. Armazene-o a 4 °C até o uso.
3. Prepare 1 M Dithiothreitol (DTT) pesando 231 mg de DTT (154,25 g/mol) e dissolvendo-o em água estéril de 1,5 mL. O DTT deve ser feito fresco ou usar alíquotas congeladas armazenadas.
4. (Opcional) Prepare os inibidores adicionais misturando três sais diferentes. Prepare 18,38 mg de ortovanadato de sódio (183,91 g/mol) em 1 mL de água estéril e prepare separadamente butirato de sódio adicionando 11.008 mg de butirato de sódio (110,09 g/mol) em 1 mL de água estéril. Prepare o sal final adicionando 4.199 mg de flúor de sódio (41,99 g/mol) em 1 mL de água. Misture as três soluções de sal em volume igual como solução de estoque para "inibidores adicionais" (33 mM de cada um dos três produtos químicos).
   NOTA: O vanadato de sódio polimeriza em concentrações superiores a 0,1 mM sob pH neutro. Aconselhável ativar vanadate de sódio para despolimerizá-lo para máxima eficácia após os protocolos publicados¹⁹. Alternativamente, o vanadate de sódio ativado está comercialmente disponível. Aqui, o vanadato de sódio não foi ativado intencionalmente, de modo que a eficácia não é reduzida. Vanadate de sódio ativado ainda não foi testado para este protocolo.
5. Prepare 1 M de MgCl₂ dissolvendo 0,952 g de cloreto de magnésio anidro (95,2 g/mol) em 10 mL de H₂O em um tubo centrífuga de 15 mL. Armazene 1 M MgCl₂ a 4 °C até usar.
6. Prepare 10% (v/v) Triton X-100 misturando 53,5 g de Triton X-100 com 35 mL de água estéril, leve até 50 mL com água e armazene-o à temperatura ambiente.
7. Prepare 5% de tampão de guanidina pH7 (conhecido como "tampão Gdn") que será usado para condicionar a resina pelo menos durante a noite – prepare 0,1 M de fosfato de hidrogênio de potássio dibasic (K₂HPO₄) pesando 870 mg de K₂HPO₄ e dissolvendo em 50 mL de água estéril e armazenar a 4 °C.
8. Pesar 0,7 g de cloridrato de guanidina e dissolver em 0,1 M K₂HPO₄ para um volume final de 14 mL. Ajuste o pH para 7 verificando com papel pH.
9. Mergulhe a resina de câmbio de cation fraca seca (WCX) em 5% de tampão de guanidina pH 7 durante a noite. Remova o supernascimento e refil com tampão fresco de 5% de Gdn e mergulhe-o novamente durante a noite para deixar a resina totalmente equilibrada (até que o supernatante tenha o mesmo pH do buffer original).
10. Antes de iniciar o experimento na próxima seção, misture os reagentes para fazer o buffer EB1, EB2A e EB2B com base na Tabela 1. Adicione todos os inibidores e DTT frescos pouco antes do uso.

Reagentes	Concentração de estoque	EB1	EB2A	EB2B
		Volume (mL)	Volume (mL)	Volume (mL)
Sacarose	2,5 M	4.4	1.25	0.5
Tris HCl pH8	1M	0.25	0.125	0.05
Tdt	1M	0.125	0.0625	0.025
H2O		20.225	9.6875	4.375
comprimido inibidor de protease (PI)		0,5 pílula	0,5 pílula	0,5 pílula
Inibidores adicionais (Opcional)	33mM	0.25	0.125	0.05
MgCl2	1M		0.125	0.05
Tritão X100	10%		1.25
Volume geral		25 mL	12,5 mL	5 mL

Tabela 1: Composição para buffers de extração (EBs).

11. Faça o Buffer de Lise Nucleísis (NLB) com base na Tabela 2. Prepare o NLB com antecedência e armazene a 4 °C até usar. Adicione comprimidos PI frescos pouco antes de usar em 1x (0,5 comprimidos por 5 mL). Consulte a Tabela 2 para obter volumes específicos.

Nlb	Concentração de estoque	Volume (mL)
Nacl	5M	0.4
Tris HCl pH8	1M	0.05
Tritão X100	10%	0.5
Edta	0,5M	0.2
H2O		3.85
Comprimidos PI		0,5 pílula
Inibidores adicionais (opcional)	33mM	0.05
Volume geral		5 mL

Tabela 2: Composição para o tampão de lise dos núcleos (NLB).

3. Procedimento de isolamento dos núcleos

NOTA: Recomenda-se realizar as etapas 3.1-3.3 do primeiro dia (2-3 h), salvar os núcleos no tampão NLB a -80 °C e retomar no dia seguinte (ou posterior) para purificação de proteínas (4h). As etapas de isolamento dos núcleos neste protocolo foram adaptadas a partir de um protocolo de sorgo ChIP-seq que está sendo usado no Instituto de Genoma Conjunto. Lavagens adicionais e separação de gradiente de sacarose podem ser necessárias para garantir a pureza dos núcleos para aplicações chip-seq.

1. Filtragem de detritos (~0,5 h)
   1. Pese o pó da folha moída ~4 g, garantindo que ele permaneça congelado colocando gelo seco ou nitrogênio líquido até estar pronto para uso.
   2. Adicione comprimidos inibidores de protease ao EB1 a uma concentração final de 0,2x (0,5 comprimidos para 25 mL por amostra). Use um pilão plástico em miniatura ou uma ponta de pipeta para pré-esmagar comprimidos em um tubo de microcentrifuuge antes de adicionar aos buffers para ajudar na dissolução do comprimido no buffer. Para evitar a perda de material, adicione o tablet PI e sonicate o buffer para dissolver o tablet.
   3. Adicione 20 mL de EB1 ao pó de folha moída congelado, suavemente vórtice e misture-os até que o pó esteja completamente suspenso. Continue misturando suavemente por ~10 min.
   4. Filtre através da malha 100, enxaguando o material filtrado duas vezes com 2 mL de EB1 cada vez.
      NOTA: Tanto o filtrado quanto os detritos filtrados devem ser verdes. Se o rastreamento usando um microscópio, deve-se ser capaz de ver núcleos intactos e cloroplastos intactos no filtrado neste momento. A maioria dos detritos grandes deve estar ausente/esgotado. Misture corantes como azul metileno com amostra. Os núcleos são facilmente observáveis como ~3-5 μm de diâmetro escuro azul/aquamarina esferas quando visualizados usando um objetivo de 20x, 40x e/ou 100x. Em relação aos núcleos, os cloroplastos são semelhantes em tamanho, mas esverdeados em cores e muitas vezes mais ovais em forma. Os vacuoles também são semelhantes aos núcleos em tamanho e forma, mas eles não vão prontamente assumir o corante azul de metileno.
   5. Centrifugar o filtrado combinado a 3.000 x g por 10 min a 4 °C em um rotor de balde balançando para detritos de pelotas e grandes organelas subcelulares, incluindo núcleos e cloroplastos.
      NOTA: Recomenda-se preparar eB2A durante esta rodada (ver etapa 3.2.1).
   6. Decante o supernatante, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
      NOTA: Como nenhum detergente ainda foi adicionado, a pelota deve permanecer verde intensa e o supernante deve ser, no máximo, verde/amarelo pálido.
2. Lise de organelas não-alvo (~0,5 h)
   1. Prepare o EB2A adicionando inibidores de protease a uma concentração final de 0,4x (0,5 comprimido por 12,5 mL EB2A).
   2. Resuspenha a pelota do passo 3.1.6 em 5 mL de EB2A e incubar no gelo por 10 minutos com mistura suave.
      NOTA: A concentração de detergente precisa ser otimizada para células intactas e cloroplastos preferencialmente, mas não núcleos. A quantidade necessária pode variar entre os organismos. Recomenda-se verificar se há lise de cloroplastos e retenção de núcleos intactos sob microscópio.
   3. Centrífuga a 2.100 x g por 15 min a 4 °C em um rotor de balde balançando para detritos e núcleos de pelotas.
      NOTA: Nesta fase, o supernasce deve ser intensamente verde, e a pelota deve ser muito menos verde do que observada nos estágios anteriores devido à lise de cloroplastos e liberação de clorofila no citosol.
   4. Decante o supernatante, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
3. Isolamento dos núcleos de contaminantes citoplasmados remanescentes (~0,5 h)
   1. Prepare o EB2B adicionando inibidores de protease a uma concentração final de 1x (0,5 comprimido por 5 mL EB2B).
   2. Resuspend pelota nuclear bruta a partir do passo 3.2.3 em 2 mL de EB2B.
      NOTA: O EB2B não contém Triton X-100, portanto, nenhuma lise adicional deve ocorrer neste momento.
   3. Centrífuga a 2.100 x g por 15 min a 4 °C em um rotor de balde balançando para detritos e núcleos de pelotas.
      NOTA: Pequenas organelas e componentes citoplasmados não devem ser pelotas, por isso devem permanecer no sobrenante.
   4. Decante o supernatante, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
   5. Resuspend a pelota usando 250 μL de NLB (adicione 0,5 comprimido inibidor de protease fresco para 5 mL).
      NOTA: O objetivo é resuspensar os núcleos em uma quantidade mínima de NLB sem perda material significativa. Como o NLB é muito viscoso e as pelotas contêm uma grande quantidade de detritos insolúveis, é muito difícil de pipeta e tende a se agarrar ao interior das pontas da pipeta. Por essa razão, recomenda-se reutilizar a mesma ponta de pipeta sempre que possível. Se estiver preocupado com o material residual em uma ponta de pipeta, basta pendurar a pipeta de uma prateleira ou rack por ~1 min para permitir que a gravidade colete material na abertura da ponta. Não pipeta agressivamente para resuspensar as pelotas. Em vez disso, use a ponta da pipeta como uma haste de mexida até que o material de pelotas possa ser aspirado na ponta da pipeta. ou seja, é perfeitamente bom para grandes aglomerados de pelotas para ficar nesta fase, desde que possa ser atraído para uma ponta de pipeta.
   6. Vórtice 15 s ao máximo para homogeneizar e resususpensar parcialmente o material. Sonicate por 5 min a 4 °C, em seguida, armazenar a -80 °C.
      NOTA: Para etapas subsequentes, tenha em mente que a quantidade total de NLB adicionada é de 250 μL, mas o volume total aparente da amostra pode ser até o dobro devido a detritos insolúveis. A amostra é congelada e descongelada para auxiliar na lise dos núcleos.
4. Extração de lise nuclei e histona (~4 h)
   1. Adicione 750 μL de 5% de gdn tampão à amostra descongelada. Sonicate por 15 min a 4 °C.
   2. Transfira a amostra para um único tubo de 2 mL e gire 10.000 x g por 10 min a 4 °C.
      NOTA: O supernatante provavelmente parecerá verde. As seguintes etapas de cromatografia devem remover a maioria dos pigmentos da proteína.
   3. Enquanto aguarda a etapa 3.4.1 e 3.4.2, prepare a coluna para a limpeza da cromatografia de troca de íons. Enxágüe a coluna de cromatografia com 2 mL de acetonitrilo e 4 mL de água para minimizar a contaminação na superfície.
   4. Carregar 200~300 μL de resina WCX (pré-condicionado com tampão de 5% Gdn) na coluna cromatografia. Deixe a resina resolver. Lave quatro vezes com 1 mL de tampão de 5% Gdn. Mantenha o tubo e a coluna no gelo para o resto das etapas de purificação.
   5. Coloque a coluna de cromatografia em um tubo de coleta de 2 mL. Carregue o supernasce da etapa 3.4.2 lentamente na cama de resina sem interromper a resina (tente cair lentamente do lado dos tubos). Deixe a solução fluir pela gravidade. À medida que a solução está fluindo, carregue o eluent de volta para a parte superior da coluna 6-8 vezes para permitir a ligação máxima à resina. Então, descarte o eluente.
   6. Carregue 2 mL de tampão de 5% Gdn para lavar proteínas não histonas da coluna. Descarte o eluente.
   7. Histones eluto com 1 mL 20% tampão Gdn. Colete o eluente, que contém proteínas histonas.
   8. Use filtro de giro de corte de peso molecular de 3 kDa (MWCO) (0,5 mL) para desalar o eluente da etapa 3.4.6. Antes de usar, carregue 500 μL de solvente de lavagem (0,2% ácido fórmico em 3% ACN) e gire-o duas vezes para limpar o filtro.
      NOTA: Recomenda-se começar a lavar o filtro MWCO enquanto executa as etapas de cromatografia de resina para economizar tempo. As seguintes etapas do filtro de giro levam ~3-4 h.
   9. Primeira carga 500 μL de amostra de histona, gire a 14.000 x g por ~25 min para reduzir o volume até ~100 μL. Em seguida, carregue outros 400 μL de amostra e gire a 14.000 x g novamente por ~25 min. Carregue os 100 μL finais da amostra, enxágue o tubo de amostra com solvente de lavagem de 300 μL e carregue o solvente no filtro. Gire a 14.000 x g novamente por ~25 min.
   10. Carregue 400 μL solvente de lavagem, gire a 14.000 x g por ~25 min para reduzir o volume para ~100 μL ou menos. Cada ciclo reduz a concentração de sal em um quinto. Repita por mais três ciclos para levar a concentração de guanidina a ~0,01%. Inverta o filtro em um tubo de coleta limpo e gire a 1.000 x g por 2 min. Guarde a amostra de histona purificada a -20 °C ou -80 °C para análise.
       NOTA: Recomenda-se girar mais (30-40 min) na última etapa para minimizar o volume amostral para obter maior concentração. O volume deve ser capaz de descer para 50-70 μL.

4. Espectrometria em massa de histones purificados

1. Aquisição de dados de espectrometria de massa cromatografia líquida (LC-MS)
   1. Estimar a concentração proteica pelo ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) seguindo o protocolo do fabricante.
      NOTA: O BCA só pode fornecer uma estimativa da concentração total de proteínas, mas não a qualidade da purificação da histona. Se a instrumentação ms não estiver prontamente disponível para verificar a qualidade da purificação de histona, a mancha ocidental pode ser usada. LC de fase invertida juntamente com a detecção de absorvância ultravioleta de 210 nm, conforme descrito em nosso relatório anterior, também pode ser usado²⁰. O cromatógrafo pode ser comparado com um padrão conhecido para verificar a qualidade da amostra. No entanto, diferentes organismos podem ter diferentes perfis de elução. Portanto, o uso de padrões de histona de organismos semelhantes é altamente recomendado.
   2. Conecte uma coluna analítica de fase invertida C18 (RP) (por exemplo, 3 μm 300 Å, coluna interior diâmetro 75 μm, diâmetro externo 360 μm, comprimento 70 cm) e uma coluna armadilha C18 (por exemplo, 3,6 μm, diâmetro interno da coluna 150 μm, diâmetro externo 360 μm, comprimento 5cm) para um sistema de cromatografia líquida nanoflua de bomba dupla (por exemplo, NanoAcquity de Águas). Os solventes binários são A: 0,1% ácido fórmico na água, e B: 0,1% ácido fórmico em acetonitrilo.
      NOTA: A LC da bomba dupla inclui uma bomba de lavagem e uma bomba de gradiente. Ambas as bombas passam por duas etapas em cada análise — uma fase de trapping seguida do estágio analítico. No estágio de captura, a bomba de lavagem flui para a coluna da armadilha e a bomba gradiente flui para a coluna analítica. No estágio analítico, a coluna armadilha é acoplado à coluna analítica, e a bomba gradiente flui para ambas as colunas. A bomba de lavagem então vai para o lixo.
   3. Estágio de captura: Configure o método LC para primeiro carregar 1-2 μg de amostra de histona na coluna armadilha. Desalar a amostra pela bomba de lavagem a 3 μL/min 5% solvente B por 10 min. Coloque a bomba analítica em 0,3 μL/min 5% solvente B para equilíbrio.
   4. Estágio analítico: Coloque a bomba de gradiente (0,3 μL/min) para começar a partir de 5% B e rampa para 30% a 15 min. Em seguida, aumente para 41% B a 100 min antes de uma lavagem orgânica alta até 95% B no final.
      NOTA: O gradiente pode ser otimizado dependendo dos diferentes perfis de retenção em colunas individuais. Normalmente, as tônus de comprimento total elute em torno de 30%-40% B nas condições de LC especificadas. Gradientes mais longos podem ser usados para aumentar o número de espectros MS2 para capturar mais proteoformes histonas.
   5. Configure o método de aquisição dependente de dados em um MS de alta resolução (por exemplo, Thermo Orbitrap Fusion Lumos ou similar) com capacidade de dissociação de transferência de elétrons (ETD). Use o modo proteína intacta e realize todas as calibrações necessárias, conforme sugerido pelo fabricante. Parâmetros críticos são descritos abaixo. Estes serão específicos do instrumento utilizado.
      1. MS1: intervalo de varredura de 600 a 2.000 m/z, resolução 120k (a m/z 200), 4 microscans, alvo AGC 1E6, injeção máxima de 50 ms.
      2. MS2: resolução 120k; 1 microscana; Alvo AGC 1E6; MS/MS dependente de dados: ETD alternado (tempo de reação de 25 ms, tempo máximo de injeção de 500 ms) e dissociação colisal de maior energia (HCD, 28% energia de colisão normalizada com energia ±5% escalonada, tempo máximo de injeção de 100 ms); janela de isolamento de 0,6 Da; prioridade nos estados de maior carga.
      3. Exclusão dinâmica: janela de tempo de 120 s, janela de massa ±0.7 Da. Exclua estados de cobrança inferiores a 5 e estados de cobrança indeterminados.
   6. Execute algumas injeções de peptídeos ou padrões de histona em novas colunas para equilibrar e verificar o sistema, antes de executar as amostras reais. Para executar um grande número de amostras, adicione espaços curtos ou lavagens entre as amostras para minimizar o transporte. Deixe as colunas equilibrarem por 15-20 min na condição inicial (5% de solvente B) antes da próxima amostra.
      NOTA: Gradientes de LC mais longos e maior tempo máximo de injeção para MS2 podem melhorar a qualidade espectral para identificar mais proteoformes histonas.
2. Processamento de dados LC-MS e identificação proteoforme
   1. Obtenha a sequência de proteína (sorgo) no formato FASTA a partir de JGI (https://genome.jgi.doe.gov) ou UniProt (https://www.uniprot.org/).
   2. Use o MSConvert²¹ (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) para converter os arquivos de dados brutos do instrumento (*.raw) em formato mzML.
   3. Baixe o pacote TopPIC²² (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) para processamento de dados. O programa pode ser executado em linha de comando ou através da interface gráfica.
   4. Use o TopFD na suíte TopPIC para desconvoluir o espectro do arquivo mzML da etapa 4.2.2. Os parâmetros padrão podem ser usados. Mas a "janela precursora" (-w) precisa ser reduzida para 1 m/z porque uma janela de isolamento estreita é usada.
   5. Use TopPIC na suíte TopPIC para identificar proteoforms. A maioria dos parâmetros padrão pode ser usada. Defina o tipo de corte de espectro e proteoforme para FDR (taxa de detecção falsa) e defina o valor de corte para 0,01 (1% FDR) ou conforme desejado. Defina a "tolerância ao erro proteoform" para 5 (Dalton). Carregue o arquivo FASTA da etapa 4.2.1 e o arquivo "*_ms2.msalign" da etapa 4.2.4. Então comece a busca.
      NOTA: A configuração "tolerância a erros proteoformes" combinará proteoformes com massas semelhantes (± 5 Da) como uma. Isso ajuda a reduzir a redundância nas contagens de proteoformes. No entanto, deve ser usado com cautela, pois a grande tolerância irá mesclar proteoforms com pequenas ou sem diferenças de massa. Este parâmetro só está disponível na versão TopPIC 1.3 ou posterior.
   6. Os proteoforms identificados podem ser examinados no arquivo "*_proteoform.csv" ou visualizados usando o módulo Topview na pasta "*_html" da saída.
   7. A lista de proteoforms gerada a partir dos passos acima usando TopPIC anota os PTMs histonas como mudanças de massa. Para localização de PTMs individuais, uma lista de modificações deve ser incluída. A descrição detalhada pode ser encontrada no manual TopPIC. Alternativamente, prossiga para a próxima etapa para realizar uma análise complementar de dados utilizando o pacote Informação-Proteômica²³ (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
   8. Siga as instruções e use o módulo PbfGen para converter os dados brutos do instrumento em um arquivo PBF. Em seguida, desconvoluir os dados MS1 usando o módulo ProMex para produzir um arquivo MS1ft (lista de recursos, cada recurso representa uma combinação única de massa e tempo de retenção).
   9. Crie um FASTA focado para Proteômica Informada usando a lista de proteínas identificadas da TopPIC na etapa 4.2.6.
      NOTA: Pesquisar todo o genoma usando Proteômica Informada com grande número de PTMs variáveis pode ser extremamente lento e pode causar acidentes. Portanto, recomenda-se reduzir o tamanho do FASTA apenas incluindo as proteínas-alvo.
   10. Crie uma lista de modificações direcionada para procurar PTMs histone seguindo o formato no arquivo de exemplo. Os PTMs comuns a incluir são: acetilação de lysina, mono-metilação de lise, di-metilação de lisesina, tri-metilação de lysina, serina/threonina/fosforilação de tyrosina, acetilação n-terminal proteica, oxidação de metionina/cissteína. Para o sorgo, deve-se adicionar mono-metilação n-terminal de proteínas, dietetilação e trimetilação.
       NOTA: A Proteômica Informada só procura por PTMs especificados na lista. Se os PTMs não especificados estiverem presentes, o proteoforme pode não ser identificado ou pode ser mal identificado com outros proteoforms. No entanto, a lista ptm deve ser mantida o mais curto possível para minimizar o tempo de pesquisa.
   11. Execute o módulo MSPathFinder para identificar proteoforms usando os arquivos da etapa 4.2.8, o FASTA focado da etapa 4.2.9 e a lista de modificações da etapa 4.2.10. Os parâmetros padrão podem ser usados.
   12. Os resultados podem ser visualizados em LcMsSpectator carregando todos os arquivos de resultado.
       NOTA: Outras ferramentas de bioinformática estão disponíveis para processamento e visualização de dados de cima para baixo, cada uma com seus próprios pontos fortes^{24,25,26,27,28}. O sorgo e muitos outros organismos têm informações conhecidas limitadas sobre PTMs histone no banco de dados. Use o TopPIC primeiro para identificar mudanças em massa de PTMs. Esta análise pode facilmente descobrir tanto PTMs conhecidos quanto desconhecidos. Em seguida, os PTMs detectados podem ser pesquisados de forma direcionada, seja especificando uma lista de PTM no TopPIC, ou com outras ferramentas complementares.

Resultados

Seguindo o protocolo, as histonas podem ser extraídas e identificadas por meio da análise LC-MS. Os dados brutos e os resultados processados estão disponíveis no MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via adesão: MSV000085770. Com base nos resultados toppic da amostra representativa (disponível também no MassIVE), identificamos 303 proteoformes histona (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 e 22 proteoforms H4). Proteoformes ribossômicos co-purificados também foram detectados, tipicamente elundo no início da LC. Eles geralmente...

Discussão

O protocolo apresentado descreve como extrair histonas de amostras de folhas de sorgo (ou mais geralmente folha de plantas). Espera-se que o rendimento médio da histona seja de 2 a 20 μg por material de folha de sorgo de 4 a 5 g. Os materiais são suficientemente puros para a análise de histona a jusante por LC-MS (principalmente histones com ~20% de contaminação por proteína ribossômica). O rendimento mais baixo pode ser obtido devido a variações amostrais ou possíveis falhas/falhas ao longo do protocolo. Mant...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher Chemical	A955-4L
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	43815-5G
EDTA, 500mM Solution, pH 8.0	EMD Millipore Corp	324504-500mL
Formic Acid	Thermo Scientific	28905
Guanidine Hydrochloride	Sigma	G3272-100G
MgCl2	Sigma	M8266-100G
Potassium phosphate, dibasic	Sigma	P3786-100G
Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets	Roche	5892791001
Sodium butyrate	Sigma	303410-5G	Used for histone deacetylase inhibitor
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma	S1888
Sodium Fluoride	Sigma	S7020-100G	Used for phosphatase inhibitor
Sodium Orthovanadate	Sigma	450243-10G	Used for phosphatase inhibitor
Sucrose	Sigma	S7903-5KG
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-500 g
Triton X-100	Sigma	T9284-100ML
Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)	Bio-Rad	142-5842
Disposables
Chromatography column (Bio-Spin)	BIO-RAD	732-6008
Mesh 100 filter cloth	Millipore Sigma	NY1H09000	This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.
Micropipette tips (P20, P200, P1000)	Sigma
Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical	Genesee Scientific	28-103
Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL	Sigma
Equipment
Analytical Balance	Fisher Scientific	01-912-401
Beakers (50mL – 2L)
Microcentrifuge with cooling	Fisher Scientific	13-690-006
Micropipettes
Swinging-bucket centrifuge with cooling	Fisher Scientific
Vortex	Fisher Scientific	50-728-002
Water bath Sonicator	Fisher Scientific	15-336-120