Implantación de ECG telemétrico combinado y transmisores de presión arterial para determinar la sensibilidad barorrefleja espontánea en ratones conscientes

Resumen

El barorreflejo es un mecanismo de regulación de la frecuencia cardíaca por el sistema nervioso autónomo en respuesta a los cambios en la presión arterial. Describimos una técnica quirúrgica para implantar transmisores de telemetría para la medición continua y simultánea del electrocardiograma y la presión arterial en ratones. Esto puede determinar la sensibilidad barorrefleja espontánea, un marcador pronóstico importante para la enfermedad cardiovascular.

Resumen

La presión arterial (PA) y la frecuencia cardíaca (FC) están controladas por el sistema nervioso autónomo (SNA) y están estrechamente entrelazadas debido a mecanismos reflejos. El barorreflejo es un mecanismo homeostático clave para contrarrestar los cambios agudos a corto plazo en la PA arterial y para mantener la PA en un rango fisiológico relativamente estrecho. La PA es detectada por barorreceptores ubicados en el arco aórtico y el seno carotídeo. Cuando la PA cambia, las señales se transmiten al sistema nervioso central y luego se comunican a las ramas parasimpática y simpática del sistema nervioso autónomo para ajustar la FC. Un aumento en la PA causa una disminución refleja en la FC, una caída en la PA causa un aumento reflejo en la FC.

La sensibilidad barorrefleja (BRS) es la relación cuantitativa entre los cambios en la PA arterial y los cambios correspondientes en la FC. Las enfermedades cardiovasculares a menudo se asocian con una función barorrefleja deteriorada. En varios estudios se ha informado de BRS reducido en, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio o enfermedad arterial coronaria.

La determinación de BRS requiere información tanto de PA como de FC, que se puede registrar simultáneamente utilizando dispositivos telemétricos. El procedimiento quirúrgico se describe comenzando con la inserción del sensor de presión en la arteria carótida izquierda y el posicionamiento de su punta en el arco aórtico para monitorear la presión arterial, seguido de la colocación subcutánea del transmisor y los electrodos de ECG. También describimos los cuidados intensivos postoperatorios y el manejo analgésico. Después de un período de dos semanas de recuperación postoperatoria, se realizan registros de ECG y PA a largo plazo en ratones conscientes y sin restricciones. Finalmente, incluimos ejemplos de registros de alta calidad y el análisis de la sensibilidad espontánea de los barorreceptores utilizando el método de secuencia.

Introducción

El reflejo barorreceptor arterial es el principal sistema de control de retroalimentación en humanos que proporciona un control a corto plazo, y posiblemente también a largo plazo^1,2, de la presión arterial (PAA). Este reflejo amortigua las perturbaciones en la PA que ocurren en respuesta a desencadenantes fisiológicos o ambientales. Proporciona cambios reflejos rápidos en la frecuencia cardíaca, el volumen sistólico y la resistencia arterial periférica total. El reflejo se origina en las terminaciones nerviosas sensoriales en el arco aórtico y los senos carotídeos. Estas terminales nerviosas forman los barorreceptores arteriales. Los somáteres de las terminales nerviosas en el arco aórtico se encuentran en el ganglio nodoso, mientras que los de las terminales nerviosas en el seno carotídeo se encuentran en el ganglio petroso. El reflejo se desencadena por un aumento de la presión arterial, que estira y activa las terminales nerviosas barorreceptoras (Figura 1A). La activación da como resultado descargas potenciales de acción que se transmiten centralmente a través del depresor aórtico aferente y los nervios del seno carotídeo a los núcleos del tronco encefálico cardiovascular, como el núcleo tractus solitarii y el núcleo dorsal del nervio vago. Los cambios en la actividad nerviosa aferente a su vez modulan la actividad eferente autónoma. El aumento de la actividad de los nervios barorreceptores disminuye la actividad simpática y aumenta la actividad del nervio parasimpático. Así, las consecuencias de la activación de los barorreceptores son una reducción de la frecuencia cardíaca, del gasto cardíaco y de la resistencia vascular que en conjunto contrarrestan y amortiguan el aumento de la presión arterial³. Por el contrario, la disminución de la actividad de los nervios barorreceptores aumenta la actividad del nervio simpático y disminuye la actividad del nervio parasimpático, lo que aumenta la frecuencia cardíaca, el gasto cardíaco y la resistencia vascular y, por lo tanto, contrarresta la disminución de la presión arterial.

Numerosos estudios en humanos y animales han demostrado que el reflejo barorreceptor se puede ajustar en condiciones fisiológicas como el ejercicio⁴, el sueño⁵, el estrés por calor⁶ o el embarazo⁷. Además, hay evidencia de que el barorreflejo está crónicamente deteriorado en enfermedades cardiovasculares, como hipertensión, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. De hecho, la disfunción barorrefleja también es utilizada como marcador pronóstico en varias enfermedades cardiovasculares ^8,9,10. Además, la disfunción del barorreflejo también está presente en los trastornos del SNA. Dada la importancia del reflejo barorreceptor para la salud y los estados de enfermedad, la estimación in vivo de este reflejo es un componente importante de la investigación autonómica y cardiovascular con ciertas implicaciones clínicas graves.

Las líneas genéticas de ratón son herramientas esenciales en la investigación cardiovascular. Los estudios in vivo de tales líneas de ratones proporcionan información valiosa sobre la fisiología cardiovascular y la fisiopatología y, en muchos casos, sirven como sistemas modelo preclínicos para enfermedades cardiovasculares. Aquí proporcionamos un protocolo para el registro telemétrico in vivo de ECG y PA en ratones conscientes, sin restricciones y que se mueven libremente y describimos cómo se puede determinar la sensibilidad barorrefleja a partir de estas grabaciones utilizando el método de secuencia (Figura 1B). El método aplicado se denomina método de secuencia, porque la serie latido a latido de intervalos sistólicos de PA (PAS) y RR se examinan para secuencias cortas de tres o más latidos durante el aumento o disminución espontáneos de la PAS con adaptación refleja de la FC. Este método es el estándar de oro para la determinación de la sensibilidad barorrefleja, ya que solo se investigan los mecanismos reflejos espontáneos. La técnica es superior a las técnicas más antiguas que involucraban procedimientos invasivos como la inyección de fármacos vasoactivos para inducir cambios en la PA.

Figura 1: Representación esquemática de la evaluación de la sensibilidad barorrefleja y barorrefleja utilizando el método de secuencia . (A) Curso del barorreflejo durante un aumento agudo de la presión arterial. Un aumento a corto plazo en la PA es detectado por barorreceptores ubicados en el arco aórtico y el seno carotídeo. Esta información se transmite al sistema nervioso central e induce una disminución de la actividad nerviosa simpática en paralelo con un aumento de la actividad parasimpática. La liberación de acetilcolina de las terminaciones nerviosas ubicadas en la región del nódulo sinoauricular induce una disminución del segundo mensajero cAMP en las células marcapasos del nodo sinoauricular y, por lo tanto, una reducción en la frecuencia cardíaca. Una disminución a corto plazo de la presión arterial tiene el efecto contrario. (B) Trazas esquemáticas de BP durante una secuencia hacia arriba (panel superior izquierdo) y hacia abajo (panel superior derecho) de tres latidos consecutivos. Una secuencia ascendente se asocia con un aumento paralelo en los intervalos RR (panel inferior izquierdo) que es equivalente a una disminución en la FC. Una secuencia descendente se asocia con una disminución paralela en los intervalos RR (panel inferior derecho) que es equivalente a un aumento en la FC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Realizar todos los estudios en animales de conformidad con las directrices institucionales locales y las leyes nacionales sobre experimentación con animales. Para este experimento, los estudios fueron aprobados por el Regierung von Oberbayern y estaban de acuerdo con las leyes alemanas sobre experimentación animal. Animales WT (fondo C57BL/6J) y animales de un modelo de ratón con síndrome del seno enfermo que muestran una mayor sensibilidad al BRS (Hcn4^{tm3(Y527F; R669E; Para este estudio se utilizó T670A)Biel)11} (fondo mixto C57BL/6N y 129/SvJ).

1. Configuración del equipo

1. Retire un transmisor telemétrico de su paquete estéril y acorte los cables de ECG a la longitud adecuada para el tamaño del ratón. Para un ratón macho macho de seis años (C57BL / 6J), que pesa ~ 30 g, acorte el plomo positivo (rojo) a una longitud de ~ 45 mm y el cable negativo (incoloro) a una longitud de ~ 40 mm con tijeras.
   NOTA: Estos valores se dan como orientación y deben adaptarse según sea necesario (Figura 2).
2. Retire aproximadamente 6 mm del tubo de silicona del cable de ECG con un bisturí para exponer el cable. Cubra las puntas del cable con tubos excesivos dejando una porción de ~ 2 mm de cable de ECG descubierta para registrar señales eléctricas. Asegure el tubo de silicona con material de sutura de seda 5-0 no absorbible (Figura 2A).
3. Anote el número de serie del transmisor en el protocolo de operación (Archivo complementario 1).
4. Hidratar el transmisor en una solución tibia y estéril al 0,9 % de NaCl.
5. Pesa el ratón y registra su peso.
6. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía. Esterilizarlos durante la cirugía y entre diferentes animales operando por calor seco usando un esterilizador de cuentas de vidrio caliente.
   NOTA: Los instrumentos quirúrgicos deben enfriarse a temperatura ambiente antes de usarlos para prevenir quemaduras en la piel.
7. Desinfecte el banco de trabajo para asegurar condiciones asépticas.

2. Implantación quirúrgica de transmisores telemétricos para mediciones combinadas de ECG y presión arterial

1. Disección de la arteria carótida común izquierda.
   1. Anestesiar un ratón mediante inyección intraperitoneal de mezcla anestésica (100 mg/kg de ketamina; 15 mg/kg de xilazina; 1 mg/kg de acepromazina). Realice una prueba de pellizco del dedo del pie para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado antes de comenzar la cirugía.
   2. Use un recortador para afeitar el área quirúrgica desde debajo de la barbilla hacia los músculos pectorales transversales.
   3. Coloque el ratón en posición supina sobre una placa quirúrgica con temperatura controlada a 37 °C. Asegure las extremidades con cinta quirúrgica y controle continuamente la temperatura corporal con un termómetro rectal (Figura 2C). Si la temperatura corporal desciende por debajo de 37 °C, cubra el cuerpo del animal con una gasa de algodón estéril durante la cirugía.
   4. Aplique ungüento para los ojos para proteger los ojos del animal durante la anestesia.
   5. Aplique crema depilatoria en el área quirúrgica previamente afeitada. Retire el vello y la crema depilatoria con un disco de algodón y agua tibia después de 3-4 min. Asegúrese de que la piel esté limpia y libre de vello residual y crema depilatoria, para que la herida no se contamine durante la operación.
   6. Desinfecte la piel con varias rondas alternas de exfoliante de povidona yodada o clorhexidina seguido de alcohol.
   7. Coloque al animal bajo un microscopio de disección y coloque una cortina estéril alrededor del área quirúrgica.
   8. Haga una incisión de 1-1.5 cm en la línea media a través de la piel del cuello, comenzando inmediatamente debajo de la barbilla. Haga un esfuerzo para que la incisión sea lo más recta posible. (Figura 2D).
      NOTA: Durante los siguientes pasos, el área quirúrgica debe mantenerse húmeda mediante la aplicación regular de NaCl estéril, caliente (37 °C) al 0,9 %.
   9. Cree un espacio subcutáneo a ambos lados de la incisión separando la piel del tejido conectivo subyacente con tijeras de disección romas. Tenga cuidado de no pellizcar la piel demasiado fuerte con los fórceps, ya que esto puede causar necrosis y conducir a una cicatrización de heridas deteriorada después de la cirugía.
   10. Separe las glándulas parótidas y submandibulares usando aplicadores de punta de algodón para exponer la musculatura que recubre la tráquea.
   11. Retraiga la glándula salival izquierda con pinzas de disección curvas para identificar la arteria carótida izquierda ubicada lateralmente a la tráquea (Figura 2E).
   12. Diseccionar cuidadosamente la arteria carótida del tejido adyacente usando fórceps curvos. Tenga mucho cuidado de no lesionar el nervio vago que corre a lo largo del vaso. Continúe la disección roma para exponer la arteria carótida izquierda a aproximadamente 10 mm de longitud y sepárela completamente de la fascia vascular y el nervio vago (Figura 2F).
   13. Pase una sutura de seda 5-0 no absorbible debajo de la porción aislada de la arteria carótida mientras levanta ligeramente el vaso sanguíneo con pinzas curvas para reducir la fricción entre la sutura y la arteria carótida, ya que esto podría dañar fácilmente la pared vascular.
   14. Coloque la sutura cranealmente, solo proximalmente a la bifurcación de la arteria carótida, forme un nudo y átela para ligar permanentemente el vaso (Figura 2G). Fije ambos extremos de la sutura de oclusión craneal a la mesa de cirugía con cinta quirúrgica.
   15. Pasar una segunda sutura de oclusión debajo de la arteria carótida y colocarla caudalmente a ~5 mm de distancia de la sutura craneal (Figura 2H). Es necesario para la oclusión temporal del flujo sanguíneo durante la canulación de la arteria. Por lo tanto, ate un nudo suelto y fije ambos extremos de sutura con cinta quirúrgica.
   16. Coloque una tercera sutura (sutura segura) entre la sutura de oclusión craneal y caudal y haga un nudo suelto (Figura 2I). Esta sutura es necesaria para mantener el catéter en su lugar mientras se canula la arteria. Pegue un extremo de la sutura a la mesa de cirugía.
2. Canulación de la arteria carótida común izquierda.
   NOTA: El área sensora del catéter de presión arterial se encuentra a 4 mm del extremo distal y consiste en un tubo que contiene un líquido no compresible y un gel biocompatible (Figura 2B). Dado que esta área es muy sensible, asegúrese de que esté libre de burbujas de aire y no la toque en ningún momento durante el procedimiento.
   1. Doble la punta de una aguja de 24 G en un ángulo de ~100° para usarla como introductor de catéter.
   2. Tire suavemente de la sutura de oclusión caudal y fíjela con tensión para detener temporalmente el flujo sanguíneo y levantar ligeramente la arteria.
   3. Penetrar cuidadosamente la arteria proximal a la sutura de oclusión craneal con la aguja doblada (Figura 2J). Agarre el catéter con pinzas de canulación de vaso, introdúzcalo en la punción pequeña y deje que se deslice lentamente en el vaso. Tire suavemente hacia atrás de la aguja doblada simultáneamente (Figura 2K).
   4. Cuando el catéter alcance la sutura de oclusión caudal, apriete ligeramente la sutura segura para mantener el catéter en su lugar (Figura 2L).
   5. Afloje la sutura de oclusión caudal para que el catéter se pueda mover aún más hasta que su punta se coloque en el arco aórtico.
      NOTA: Asegúrese de determinar la longitud de inserción correcta del catéter, ya que esto depende del tamaño del ratón. Para ratones machos con un fondo C57BL / 6J a las 12 semanas de edad y ~ 30 g de peso corporal, recomendamos insertar el catéter hasta que la muesca integrada alcance la sutura de oclusión craneal. La profundidad de inserción correcta y la colocación del catéter para la línea de ratón específica se pueden verificar después de la eutanasia del animal.
   6. Una vez colocado correctamente, asegure el catéter con las tres suturas y corte los extremos lo más corto posible. No tire de los nudos demasiado apretados, ya que esto podría dañar el frágil catéter de presión arterial.

Figura 2: Implantación de un ECG combinado y transmisor de presión arterial - canulación de la arteria carótida izquierda . (A) El transmisor de telemetría está compuesto por un catéter de presión, dos electrodos de biopotencial y el cuerpo del dispositivo. (B) Representación esquemática del catéter de presión. El área del sensor consiste en un fluido no compresible y un gel biocompatible. El catéter debe insertarse en la arteria carótida hasta que la muesca esté al nivel de la sutura de oclusión craneal para asegurar la posición correcta en el vaso sanguíneo. (C) Ratón C57BL/6J anestesiado preparado para la implantación quirúrgica del transmisor. (D-L) Secuencia de imágenes que muestra el procedimiento quirúrgico para la canulación de la arteria carótida izquierda. (D) Incisión en la piel cervical. (E) Tráquea expuesta para identificar la arteria carótida izquierda ubicada lateralmente a la tráquea. (F) Disección roma para aislar la arteria del tejido adyacente y el nervio vago. (G) Ligadura permanente de la arteria carótida izquierda con sutura de oclusión craneal. (H) Tensión aplicada a la sutura de oclusión caudal para detener temporalmente el flujo sanguíneo. (I) Asegurar la sutura para mantener el catéter en su lugar durante la canulación . (J) Cánula con punta curva para la inserción del catéter en el vaso sanguíneo. (K) Se inserta un catéter de presión en la arteria carótida. (L) La punta del catéter se coloca en el arco aórtico y el catéter se asegura con la sutura media. La barra de escala en D - L muestra 4 mm. Reimpreso de¹⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Colocación del cuerpo del dispositivo de telemetría en un bolsillo subcutáneo en el flanco izquierdo del ratón (Figura 3).
   1. Forme un túnel subcutáneo desde el cuello dirigido hacia el flanco izquierdo del animal y forme una pequeña bolsa con tijeras de disección pequeñas y romas (Figura 3B).
   2. Irrigar el túnel con una jeringa de 1 ml llena de solución tibia y estéril al 0,9% de NaCl e introducir ~300 μL de la solución en la bolsa (Figura 3C).
   3. Levante cuidadosamente la piel con pinzas romas e introduzca el cuerpo del dispositivo transmisor en la bolsa (Figura 3D). Durante este paso, tenga mucho cuidado de no sacar el catéter de presión arterial de la arteria carótida.
4. Colocación de las derivaciones de ECG en la configuración de Einthoven II.
   1. Forme un túnel delgado hacia el músculo pectoral derecho con tijeras de disección romas y coloque el cable negativo (incoloro) en el túnel usando fórceps romos. Fije el extremo terminal del cable con una puntada al músculo pectoral utilizando material de sutura absorbible 6-0 (Figura 3E).
   2. Forme un bucle en el cable positivo (rojo), coloque su punta en la región de la costilla caudal izquierda y asegure su posición con una sutura utilizando material de sutura absorbible 6-0.
      NOTA: Es importante que ambos cables permanezcan planos contra el cuerpo en toda su longitud para evitar la irritación del tejido (Figura 3F).
   3. Cerrar la piel con nudos simples utilizando material de sutura no absorbible 5-0 (Figura 3H). Además, aplique una pequeña cantidad de adhesivo tisular en cada nudo para evitar que el animal muerda la sutura y evitar la dehiscencia.
   4. Aplique hidrogel de povidona yodada al 10% en la herida para prevenir la infección de la herida durante la fase de recuperación.
   5. Para el alivio preventivo del dolor, inyecte 5 mg / kg de carprofeno en NaCl al 0,9 % por vía subcutánea mientras el ratón todavía está bajo anestesia.
   6. Ajuste una plataforma calefactora a 39 ± 1 °C y coloque el ratón en una jaula de alojamiento separada. Coloque la mitad de la jaula en la plataforma durante 12 h después de la cirugía y transfiera el ratón en el área cálida. Cuando el animal se despierta de la anestesia, tiene la opción de permanecer en el área cálida o moverse a la parte más fría de la jaula.

Figura 3: Implantación de un ECG combinado y transmisor de presión arterial - colocación subcutánea de los electrodos de ECG y el cuerpo del dispositivo . (A) Ratón después de la inserción del catéter de presión arterial. La posición del catéter está asegurada por las suturas de oclusión. (B) Formando un bolsillo subcutáneo en el flanco izquierdo del animal con tijeras romas. (C) La bolsa se riega con ~300 μL de solución salina estéril tibia. (D) El cuerpo del dispositivo se coloca en el bolsillo subcutáneo. (E) El extremo terminal del electrodo negativo (incoloro) se fija al músculo pectoral derecho con material de sutura absorbible. (F) Fijación del electrodo positivo (rojo) a los músculos intercostales izquierdos. (G) Colocación de una sutura permanente en el músculo del pecho para asegurar la posición de los electrodos de ECG. (H) Ratón después del cierre de la piel. Las posiciones subcutáneas de las puntas de los electrodos de ECG se indican con círculos rojos. Para fines de demostración, se utilizó un animal muerto para tomar estas imágenes. Por favor, siga las prácticas estériles mientras usa un animal vivo. Reimpreso de¹⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Cuidados postoperatorios
   1. Para el alivio del dolor postoperatorio, inyecte 5 mg / kg de carprofeno en NaCl al 0,9% por vía subcutánea cada 12 h durante 3-5 días hasta que la herida haya cicatrizado.
   2. Inyecte 10 μL/g de solución tibia de anillo-lactato por vía intraperitoneal para proteger al animal de la deshidratación.
   3. Deje que el ratón se recupere durante 2-3 semanas antes de ejecutar las primeras mediciones telemétricas. Controle cuidadosamente las condiciones generales de salud, la cicatrización de heridas, el peso corporal y la ingesta de alimentos y agua durante el período de recuperación.
   4. Al final del experimento, sacrificar al ratón por inhalación de dióxido de carbono (CO₂).
      NOTA: La dislocación cervical o decapitación no se recomienda como método de eutanasia, ya que esto podría dañar partes del dispositivo transmisor de ECG y PA.
6. Adquisición de datos.
   1. Tomar medidas para evitar el ruido acústico y electrónico durante la grabación de datos. Además, limite el acceso del personal durante el registro de datos y complete todos los procedimientos de cría antes del experimento.
   2. Coloque la jaula del animal en la placa receptora de telemetría y encienda el transmisor telemétrico acercando un imán al animal.
   3. Adquiera registros continuos de ECG, presión arterial y actividad durante 72 h (ciclo oscuro/claro de 12 h) con el software de adquisición de datos (Figura 4).
7. Análisis del ritmo circadiano de frecuencia cardíaca, presión arterial y actividad.
   1. Verificar la presencia de un ritmo circadiano regular de FC, PA y actividad utilizando el software de adquisición de datos¹² (Figura 5).
8. Análisis de datos incluyendo la determinación de la sensibilidad de los barorreceptores utilizando el método de secuencia con ECG y software de análisis de PA.
   1. Exporte datos de BP y RRHH del software de adquisición de datos al software de análisis de ECG y PA (Archivo complementario 2). Utilice la siguiente secuencia de comandos: Software abierto de análisis de ECG y BP > Archivo > Datos sin procesar del convertidor > Convertir datos sin procesar que no sean IOX. En la nueva ventana, haga clic en Archivo > Cargar datos de Dataquest ART4. Nuevamente, se abrirá una nueva ventana, seleccione el archivo de datos para exportar > Se abre la nueva ventana, seleccione el animal de la lista "sujetos" y seleccione ECG y BP de la "lista de formas de onda" y presione OK. Elija los animales de los que se deben convertir los datos haciendo clic en Convertir datos > Crear archivo de sitio binario IOX.
   2. Abra el archivo de sitio binario IOX en el software de análisis de ECG y BP mediante la siguiente secuencia de comandos: Archivo > Cargar datos IOX > Seleccione Traza de BP y ECG > presione la marca de verificación verde.
      NOTA: Los siguientes parámetros de procesamiento de datos están optimizados para los datos adquiridos de ratones de tipo salvaje y, en principio, deben adaptarse a todos los modelos de ratón utilizados en el campo preclínico. Sin embargo, la adaptación de estos parámetros podría ser necesaria cuando se trabaja con modelos experimentales específicos, por ejemplo, ratones con valores extremadamente altos o bajos de HR y / o PA, o diferentes especies de roedores. En cualquier caso, los parámetros de procesamiento de datos deben revisarse cuidadosamente para garantizar que se ajusten al modelo específico en estudio.
   3. Para los ajustes para el análisis de ECG, PA y BRS, consulte el Archivo complementario 3,4. Para el análisis BRS en ratones, ajuste los parámetros BRS para detectar solo secuencias de tres (o más) latidos que exhiban un retraso entre PAS y RR de un latido, y establezca el umbral para el cambio de PAS y RR en 0.5 mmHg y 2 ms. Asegúrese de que el coeficiente de correlación de la pendiente de la línea de regresión de los gráficos RR/PAS sea mayor que 0,75 y analice solo las secciones que exhiben un ritmo sinusal estable. Establezca los parámetros para el análisis de ECG, BP y BRS en consecuencia mediante la siguiente secuencia de comandos: Ajuste > configuración de análisis > se abre una nueva ventana
      1. Configuración del ECG (haga clic con el botón derecho en la ventana "Modo de ECG y filtrado de señales" (Archivo complementario 3)). Establezca los parámetros como se detalla aquí. Modo: ECG, solo RR, modo de filtro: automático, según la FC establecida, frecuencia cardíaca esperada: lpm > 300, ancho del filtro de extracción de línea base (ms): 100.00, ancho del filtro de eliminación de ruido: 1.00 ms, filtro de muesca: 50.0 Hz, filtro de eliminación de picos: apagado, modo de detección de caídas: apagado, longitudes RR máximas (ms): 900.00, RR de picos R ajustados: apagado, modo de configuración de RR_only: Xsmall: ratón, ancho pico R (ms): 10,00, ancho PR (ms): 20,00, ancho RT (ms): 50,00, artefacto máximo entre latidos (%): 50,00, relación de amplitud R a otra: 3,00, signo de pico R: positivo y parámetro adicional de cálculo: desactivado
      2. Para la configuración de la presión arterial (PA, configuración de presión), haga clic con el botón derecho en la ventana "Analizador de presión arterial" (Archivo complementario 4). Establezca los parámetros como se detalla aquí. Ancho del filtro de eliminación de ruido (ms): 10.00, Ancho del filtro derivado (ms): 6.00, Filtro de muesca: 50.0 Hz, Filtro de eliminación de picos: apagado, Umbral de validación (unidad de cal.): 12.00, Umbral de rechazo (unidad de cal.): 8.00, Derivada al comienzo de carrera ascendente (cal U/s): 10.00, Límites de rechazo: apagado, Retraso del ECG de referencia: ventana definida por el usuario, Retraso mínimo del ECG Rpeak (ms): 10.00, Retraso máximo del ECG Rpeak (ms): 250.00, Conduct_time_1 de la marca: no calculada, Conduct_time_2 de la marca: no calculada, BR (frecuencia respiratoria): apagada, BRS (sensibilidad barorrefleja): activada, Número mínimo de latido consecutivo: 3, Número de latido de latencia: 1, Valor de presión: PAS, Marca para calcular el intervalo de pulso: R, Variación de presión mínima (caIU): 0.50, Variación de intervalo mínimo (ms): 2.00, Correlación mínima: 0.75
   4. Filtre la señal de actividad para una secuencia de 3 horas con baja actividad. Realizar el análisis BRS en esta ventana de tiempo ya que la alta actividad de los animales interfiere con la correlación de PA y RR.
   5. Realice un análisis de PA y RR durante este período de tiempo de 3 horas mientras subdivide el análisis de 3 horas en pasos de 10 minutos.
   6. Realice el análisis BRS mediante la siguiente secuencia de comandos: Abra la ventana de análisis BRS > Ver > análisis BRS. Se abrirá el panel de análisis BRS. Inspeccione manualmente cada secuencia mostrada en el panel de análisis BRS y excluya latidos ectópicos, pausas sinusales, eventos arrítmicos o datos ruidosos. Asegúrese de invalidar cada latido de tales secuencias para excluirlas con éxito del análisis.
   7. Exporte los resultados del análisis BRS a un archivo de hoja de cálculo (Archivo de resultados). Modifique los parámetros que se exportan al archivo de hoja de cálculo mediante la siguiente secuencia de comandos (archivos complementarios 5-7):
      1. Ajuste > parámetros en las secciones de > de lista/archivo > txt (Archivo complementario 5). Seleccione la sección "ritmos" y cualquier otra sección que contenga información de interés, excepto la sección de ritmos invalidados.
      2. Ajuste > parámetros en los pasos de > de lista/archivo > txt (Archivo complementario 6). Elija los valores de paso que desea exportar.
      3. Ajuste > parámetros en la lista/para archivar > beats -> txt (Archivo complementario 7).
      4. Asegúrese de que la sección de pulsaciones del archivo contenga al menos los siguientes datos para cada pulsación. ECG_RR, ECG_HR, BP_SBP, BP_BRS_deltaP, BP_BRS_# (=intervalos de latidos consecutivos de la secuencia), BP_BRS_slope, BP_BRS_correl, BP_BRS_shiftl (=RR del latido posterior)
      5. A continuación, haga clic en Archivo > Guardar archivo de resultados.
   8. Ordene los datos exportados para secuencias ascendentes y descendentes mediante la función de filtro de Excel (archivo complementario 8). Calcule el número de secuencias, la pendiente media de BRS, la desviación estándar y el error estándar de la pendiente BRS para secuencias ascendentes y descendentes por separado. También calcula la cantidad total de secuencias por cada 1000 pulsaciones.
      NOTA: En el Suplemento (Archivo suplementario 8) se proporciona una plantilla de hoja de cálculo (TemplateBRS) para la clasificación y el análisis automatizados de secuencias ascendentes y descendentes, que facilita el análisis. Al ajustar la función de filtro, puede ordenar las secuencias por diferentes números de compás (por ejemplo, secuencias de tres o cuatro tiempos). Para más detalles, consulte los archivos complementarios 9-13.
      1. Abra el archivo de resultados y el archivo de Excel TemplateBRS (archivo complementario 8). Copie los datos de las siguientes columnas del archivo de resultados: (Presión)_BRS_deltaP, (Presión)_BRS_# y (Presión)_BRS_slope (Archivo complementario 9). Pegue los datos en las columnas respectivas de las hojas de cálculo "Secuencias ascendentes" y "Secuencias descendentes" en el archivo TemplateBRS (archivo complementario 10). Además, copie los datos de la columna (Presión)_BRS_SBP del archivo de resultados (archivo complementario 11) y péguelos en la hoja de cálculo "Todas las secuencias" en el archivo TemplateBRS (archivo complementario 12).
         NOTA: El número de la columna (Presión)_BRS_# aparece sólo en el último pulso de una secuencia y representa la longitud de la secuencia. Las secuencias hacia arriba y hacia abajo se pueden distinguir por el signo del valor (Presión)_deltaP. Los valores negativos para el segundo y tercer tiempo de una secuencia de tres tiempos indican una secuencia descendente. Los valores positivos indican una secuencia ascendente, respectivamente.
      2. Filtre los datos copiados con la configuración de filtro predeterminada. Haga clic en el icono de filtro de la columna (Presión)_BRS_# y pulse "ok" (Archivo complementario 13). Aplica este paso a las hojas de cálculo "Secuencias arriba" y "Secuencias abajo".
         NOTA: La hoja de cálculo filtra las secuencias de tres tiempos. Si se solicitan otras longitudes de secuencia, la configuración de esta columna debe cambiarse en el menú desplegable. Los cálculos para el número de secuencias, la pendiente media de BRS, la desviación estándar y el error estándar de la pendiente BRS se muestran en los cuadros verdes de las hojas de cálculo "Secuencias hacia arriba" y "Secuencias hacia abajo". Los cálculos para el número total de secuencias por 1000 pulsaciones aparecen en el cuadro verde de la hoja de cálculo "Todas las secuencias".

Resultados

Resultados positivos para los datos brutos de ECG y PA
Usando este protocolo se pueden adquirir datos de ECG y PA de alta calidad (Figura 4 y Archivo Suplementario 14), lo que permite no solo un análisis preciso de BRS sino también un análisis de una amplia gama de parámetros derivados de ECG o PA, por ejemplo, intervalos de ECG (Figura 4B, panel superior), parámetros de presión arterial (Figura 4B, panel inferior), frecuencia cardíaca y variabilidad de la presión arterial, detección de arritmias, etc.^12,13,14,15.

Figura 4: Registros telemétricos de ECG y PA. (A) Traza de ECG representativa de alta calidad (panel superior) y registros de PA sin procesar de alta calidad correspondientes (panel inferior). (B) Aumento de las trazas de ECG (panel superior). Se indican la onda P, el complejo QRS, la onda T y el intervalo RR. Ampliación de los datos de PA correspondientes (panel inferior). La PA diastólica (PAD) y la PA sistólica (PAS) están indicadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados positivos para el ritmo circadiano
Un ratón sano que se ha recuperado suficientemente de la cirugía muestra un aumento fisiológico de la actividad, la FC y la PA durante la fase de actividad (oscura) (Figura 5). Muchos factores diferentes pueden alterar este ritmo circadiano regular. Estos incluyen estrés psicológico, ruido acústico o eléctrico y dolor. Por ejemplo, una condición de dolor agudo inmediatamente después de la cirugía resultaría en un aumento de la frecuencia cardíaca con una disminución simultánea de la actividad. Por lo tanto, el ritmo circadiano es un indicador importante para la salud y el bienestar de los animales y debe verificarse rutinariamente antes del análisis BRS.

Figura 5: Análisis de mediciones de telemetría a largo plazo para determinar las variaciones del ritmo circadiano. El ritmo circadiano de la frecuencia cardíaca (A), la actividad (B), la presión arterial sistólica (C) y la presión arterial diastólica (D) promediaron 9 ratones machos C57BL / 6J de tipo salvaje durante ciclos de luz y oscuridad de 12 h. Las áreas grises representan la fase de actividad (oscura) y las áreas blancas representan la fase de reposo (luz) de los animales. Todos los parámetros son fisiológicamente elevados durante la fase de actividad (oscuridad) del animal. Los datos se representan como media +/- SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados positivos para el análisis BRS
Después de realizar el análisis como se describe en la sección 2.8 del protocolo, el software detectará secuencias ascendentes y descendentes, respectivamente. El método utilizado se denomina método de secuencia, ya que los cambios en los intervalos PAS y RR se examinan latido a latido durante secuencias cortas de tres o más latidos con un aumento o disminución espontáneo de la PAS (Figura 6). Una elevación continua de la PAS durante tres latidos del corazón provoca un aumento reflejo de la actividad parasimpática y, en consecuencia, ralentiza la FC, lo que equivale a intervalos de RR más largos. La latencia para la adaptación de FC refleja es de un latido. Dicha secuencia se muestra en la Figura 6A y se define como una secuencia hacia arriba. En contraste, una disminución continua de la PAS durante tres latidos con aumento paralelo de la FC (disminución en el intervalo RR) se define como una secuencia descendente (Figura 6B). Para evaluar la correlación entre RR y PAS, ambos parámetros se trazan entre sí y se calcula la pendiente (ms/mmHg) de la línea de regresión lineal para cada secuencia (Figura 6A,B, paneles inferiores). Después de ordenar por secuencias hacia arriba y hacia abajo, el número promedio de secuencias por 1000 latidos (Figura 6C) y la ganancia promedio de BRS espontáneos se pueden calcular para secuencias ascendentes y descendentes, respectivamente (Figura 6D, E). La ganancia de BRS espontáneo se refleja en la pendiente de la línea de regresión lineal calculada a partir de la relación RR/PAS. La desviación de los valores normales de BRS puede tener varias causas. Estos incluyen cambios en la entrada del SNA o cambios en la capacidad de respuesta del nódulo sinoauricular a la entrada del sistema nervioso autónomo. En la Figura 6 se muestra un aumento del BRS en un modelo de ratón para el síndrome del seno enfermo (SSS) con una respuesta exagerada del nódulo sinoauricular a la entrada vagal¹¹.

Figura 6: Estimación de BRS utilizando el método de secuencia. (A) Traza de PA representativa de un ratón C57BL / 6J de tipo salvaje durante una secuencia ascendente de tres latidos consecutivos (panel superior) asociada con un aumento paralelo en el intervalo RR (panel medio) que es equivalente a una disminución en la FC. Los intervalos RR se graficaron contra la PAS (panel inferior). La pendiente de la línea de regresión (línea roja) para la secuencia ascendente representada en el panel superior y medio (WT, círculos negros) fue de 4,10 ms/mmHg. Una relación representativa RR/PAS del modelo de ratón con síndrome del seno enfermo produjo una pendiente aumentada de 6,49 ms/mmHg, lo que indica BRS elevado (SSS, círculos grises). (B) Secuencia descendente representativa de un ratón de tipo salvaje con una caída en la PAS (panel superior) y una disminución posterior en el intervalo RR (panel medio) que da como resultado una pendiente BRS de 4.51 ms/mmHg (panel inferior; WT, círculos negros). Una relación representativa RR/PAS del modelo de ratón con síndrome del seno enfermo (SSS, círculos grises) con una pendiente de 7,10 ms/mmHg. La orientación de las puntas de flecha rojas indica la dirección de las secuencias (secuencia hacia arriba o hacia abajo). (C) Cantidad total de secuencias por 1000 latidos para ratones WT y SSS. (D) Pendiente media de la relación RR/PAS para secuencias up para ratones WT y SSS. (E) Pendiente media de la relación RR/PAS para secuencias descendentes para ratones WT y SSS. Las estadísticas en (C-E) se realizaron a partir de los resultados de seis animales WT machos y ocho animales machos del modelo de ratón con síndrome del seno enfermo. Los diagramas de caja muestran la línea mediana, perc 25/75, y el valor min/max; Los símbolos abiertos representan el valor medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultado negativo para la calidad de los datos sin procesar
Especialmente durante las fases de mayor actividad, la calidad de la señal puede disminuir (Figura 7 y Archivos suplementarios 15,16). Esto puede ser causado por un desplazamiento temporal o una posición incorrecta del catéter de PA o de las derivaciones del ECG o de ambos debido al movimiento del animal. Además, la actividad del músculo esquelético puede detectarse a partir de las derivaciones del ECG e inducir ruido (Figura 7B, panel superior). Con la configuración de software descrita anteriormente, estos ritmos de baja calidad no se detectan y, por lo tanto, se excluyen del análisis. Sin embargo, la inspección manual de los datos brutos analizados es obligatoria.

Figura 7: Ejemplos de señales brutas de baja calidad. (A) La señal de ECG (panel superior) se detecta con buena calidad, pero la calidad de la señal BP (panel inferior) es baja. (B) Las cualidades de la señal de ECG (panel superior) y BP (panel inferior) no son suficientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados negativos para el análisis BRS
Los ajustes de análisis BRS enumerados en la sección 2.8.3 del protocolo son, en general, esenciales para la detección rápida y correcta de secuencias ascendentes y descendentes. El coeficiente de correlación mínimo para la línea de regresión se establece en 0,75. El establecimiento de valores demasiado bajos para el coeficiente de correlación mínimo da como resultado detecciones falsas de secuencias que no reflejan la actividad barorrefleja, sino que son el resultado de latidos arrítmicos (Figura 8). Para el análisis de BRS sólo se deben analizar los episodios con ritmo sinusal estable. Los latidos ectópicos u otros eventos arrítmicos, por ejemplo, pausas sinusales, se pueden encontrar con la opción de VFC del software de análisis de ECG y PA y deben invalidarse.

Figura 8: Secuencias que no reflejan la actividad barorrefleja . (A) Traza de ECG de un ratón con arritmia sinusal leve. (B) Registro de PA que representa un aumento espontáneo de la PAS. (C) Los intervalos RR correspondientes indican una disminución de la FC tras el aumento de la PA. (D) Gráfica de PAS e intervalos RR correspondientes. El bajo coeficiente de correlación de la línea de regresión indica que la reducción de la FC no fue causada por la actividad del barorreflejo sino más bien por la arritmia sinusal. (E) Traza de ECG sin procesar que representa una pausa sinusal. (F) Señal BP bruta correspondiente. La pausa sinusal causa una caída en la presión arterial diastólica. La presión arterial sistólica del latido posterior casi no se ve afectada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Protocolo quirúrgico. Plantilla para la documentación del procedimiento quirúrgico y la atención postoperatoria. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Conversión de datos Dataquest A.R.T en datos IOX para su análisis en el software ecgAUTO. Seleccione animales en la lista de sujetos (izquierda) y Presión y ECG en la lista de formas de onda (derecha). Pulse OK para convertir datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Configuración de ECG para el análisis BRS. Establezca los parámetros como se indican, presione ok y aplique la configuración. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Configuración de PA para el análisis BRS. Establezca los parámetros como se indican, presione ok y aplique la configuración. Guarde la configuración como un archivo de configuración para poder cargar la configuración fácilmente. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 5: Parámetros en la ventana de lista/archivo para "secciones". Elija las secciones que desea exportar en las secciones > txt header (selected) y pulse Apply!. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 6: Parámetros en la ventana de lista/archivo para "pasos". Elija los datos de paso que desea exportar en los pasos > encabezado txt (seleccionado) y pulse ¡Aplicar!. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 7: Parámetros en la ventana de lista/archivo para "beats". Elija los valores que desea exportar bajo el encabezado beats > txt (seleccionado) y pulse ¡Aplicar!. Para el análisis BRS son necesarios los parámetros marcados. Tenga en cuenta el orden de selección indicado por los números. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 8: archivo de hoja de cálculo TemplateBRS. Plantilla de hoja de cálculo para la clasificación y el análisis automatizados de secuencias hacia arriba y hacia abajo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 9: Copia de datos relevantes del archivo de resultados I. Copie las columnas (Presión)_BRS_deltaP, (Presión)_BRS_# y (Presión)_BRS_slope del archivo de resultados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 10: Archivo de plantilla de hoja de cálculo (TemplateBRS) para clasificación y análisis de datos I. Pegue los datos copiados en las columnas respectivas de la hoja de cálculo "Secuencias ascendentes" y "Secuencias descendentes" en el archivo de hoja de cálculo TemplateBRS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 11: Copia de datos relevantes del archivo de resultados II. Copie la columna (Presión)_BRS_SBP del archivo de resultados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 12: Un archivo de plantilla de hoja de cálculo (TemplateBRS) para la clasificación y el análisis de datos II. Pegue los datos SBP copiados en la hoja de cálculo "Todas las secuencias" del archivo de hoja de cálculo TemplateBRS para calcular el número total de secuencias. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 13: Filtrado y análisis de las secuencias. En la hoja de cálculo "Subir secuencias" del archivo de hoja de cálculo TemplateBRS, abra el menú desplegable del filtro de columna (Presión)_BRS_# y pulse OK sin cambiar ningún parámetro. Esto ordenará automáticamente los datos y actualizará los cálculos para secuencias con 3 tiempos. Repita esto para la hoja de cálculo "Secuencias hacia abajo". Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 14: Captura de pantalla de una grabación de alta calidad detectada con software de análisis de ECG y PA. El trazado superior (ECG) muestra la detección de cada pico R y el trazado inferior (PA) muestra la detección de cada pico de presión diastólica (DP) y presión sistólica (SP). Las áreas bajo picos detectados correctamente están marcadas en rojo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 15: Captura de pantalla de una grabación de PA de baja calidad donde los parámetros de PA solo se detectan parcialmente. La traza superior (ECG) muestra la detección de cada pico R, pero la traza inferior (PA) muestra brechas entre los picos de PA detectados. Los picos detectados de presión diastólica (DP) y presión sistólica (SP) están marcados con áreas rojas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 16: Captura de pantalla de un ECG de baja calidad y registro de PA donde no se pudieron detectar los parámetros de ECG y PA. La traza superior (ECG) muestra una región (fondo púrpura) donde no se pudieron detectar los parámetros del ECG. La detección de BP (traza inferior) también falló debido a la baja calidad de la señal. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Importancia del método con respecto a métodos alternativos
En el presente trabajo, presentamos un protocolo detallado para cuantificar BRS espontáneo utilizando el método de secuencia. Este enfoque utiliza cambios espontáneos de PA y FC refleja medidos por telemetría de ECG y PA. La ventaja de este método es que ambos parámetros se pueden registrar en animales conscientes, que se mueven libremente y sin restricciones sin molestar a los animales al entrar en la habitación donde se realizan las mediciones o incluso mediante la interacción física requerida para la inyección de drogas. Este punto es muy importante ya que se ha demostrado claramente que tales alteraciones interfieren gravemente con las grabaciones de FC y PA. Por ejemplo, la inyección de drogas requiere la fijación de los ratones, lo que provoca una respuesta de estrés máxima que aumenta la FC hasta 650-700 lpm. Para eludir estas respuestas al estrés, BRS se ha determinado previamente en ratones anestesiados. Sin embargo, los anestésicos estándar utilizados en medicina veterinaria como la ketamina/xilazina o el isoflurano inducen bradicardia e influyen en las respuestas reflejas autonómicas, lo que limita la validez de estos enfoques y la interpretación de los resultados. Para superar parcialmente estas limitaciones se utilizaron dispositivos implantables de administración de fármacos, es decir, bombas osmóticas, que pueden liberar fármacos en la cavidad peritoneal. Sin embargo, con las bombas osmóticas no es posible aplicar un bolo de una dosis definida de fármaco que limite la aplicación de tales dispositivos. Alternativamente, catéteres de infusión complejos¹⁷ Se puede implantar en ratones para administrar medicamentos. Sin embargo, estos catéteres son difíciles de manejar y requieren habilidades quirúrgicas comparables a las requeridas para la implantación de dispositivos telemétricos, mientras que producen menos resultados científicos en comparación con las mediciones de BRS espontáneo. Además de los problemas técnicos asociados con la medición de BRS mediante inyección de drogas, existen algunas limitaciones relacionadas con la acción del fármaco per se. Los enfoques tradicionales para determinar BRS incluyen inyecciones en bolo de fármacos vasoactivos. Sin embargo, la inyección en bolo de vasoconstrictores (p. ej., fenilefrina) o vasodilatadores (p. ej., nitroprusiato de sodio) se ha considerado un estímulo excesivo y no fisiológico para la adaptación refleja de la FC a los cambios en la PA.¹⁸. La actividad espontánea del reflejo barorreceptor también se puede cuantificar utilizando métodos espectrales. Uno de estos métodos evalúa BRS en el dominio de la frecuencia mediante el cálculo de la relación entre los cambios en la FC y los cambios en la presión arterial en una banda de frecuencia específica^18,19. Otros métodos espectrales implican la determinación de la función de transferencia de PA y FC o la cuantificación de la coherencia entre PA y FC^20,21. Estos métodos también requieren la adquisición telemétrica de parámetros espontáneos de PA y FC y, si bien son apropiados para la determinación de BRS espontáneo, requieren herramientas computacionales intensivas y son difíciles de aplicar. Además, todos los métodos espectrales adolecen de la limitación de que las señales no estacionarias impiden la aplicación de métodos espectrales. En particular, los picos espectrales inducidos por los ritmos respiratorios pueden reducirse en pacientes humanos pidiéndole al paciente que deje de respirar, mientras que esto obviamente no es posible en ratones. Por lo tanto, la relación señal-ruido es con frecuencia bastante baja en ratones. Dadas las limitaciones de los métodos discutidos anteriormente, favorecemos el método de secuencia para determinar BRS en ratones. Una ventaja considerable de este método es el hecho de que es una técnica no invasiva que proporciona datos sobre BRS espontáneo en condiciones de la vida real.²². Otro punto importante es que la duración de las secuencias analizadas utilizando el método de secuencia es bastante corta, involucrando 3-5 latidos. La regulación refleja de la FC por el nervio vago es muy rápida y bien dentro del marco temporal de estas secuencias. Por lo tanto, el método de secuencia es muy adecuado para evaluar la contribución del nervio vago al BRS. Por el contrario, la regulación por el sistema nervioso simpático es mucho más lenta. De hecho, durante estas secuencias cortas se puede suponer que la actividad del sistema nervioso simpático es casi constante. Por lo tanto, el método está personalizado para detectar selectivamente cambios reflejos de la FC impulsados por la actividad del nervio vago.

Interpretación de los datos de BRS
Para la interpretación de la disfunción BRS o los datos de BRS per se es importante considerar los niveles funcionales individuales que están involucrados en el reflejo barorreceptor. A nivel neuronal, los componentes aferentes, centrales o eferentes del reflejo pueden verse afectados²³. A nivel cardiovascular, la capacidad de respuesta reducida o exagerada del nódulo sinoauricular a la entrada del SNA podría estar presente ^11,24. Un cambio en cada nivel podría conducir a cambios en el BRS. Para diseccionar si los mecanismos neuronales y/o cardíacos son responsables de los cambios observados en BRS, se podrían utilizar enfoques de deleción génica, knock down o edición de genes específicos de neuronas o cardíacas.

Pasos críticos en el protocolo
El paso más sofisticado y crítico en este protocolo es la preparación y canulación de la arteria carótida izquierda (Paso 2.3). La tensión de la sutura de oclusión caudal debe ser lo suficientemente alta como para detener completamente el flujo sanguíneo antes de la canulación . De lo contrario, incluso una pequeña fuga de sangre durante la canulación puede restringir severamente la visibilidad o incluso hacer que el ratón se desangre hasta la muerte. La canulación debe tener éxito en el primer intento. Sin embargo, tras el fracaso del primer intento, todavía es posible volver a intentar cuidadosamente la canulación .

La incisión en la línea media y el túnel subcutáneo desde el cuello hasta el flanco izquierdo (Paso 2.3) deben ser lo suficientemente grandes como para introducir fácilmente el transmisor sin fuerza, pero también deben ser lo más pequeños posible para mantener el transmisor en su lugar. De lo contrario, uno tendrá que bloquearlo en su posición con material de sutura o adhesivo tisular. Dado que los ratones tienen una piel muy delicada, la necrosis de la piel puede ocurrir si el túnel para el transmisor es demasiado pequeño.

Si los electrodos de ECG son demasiado largos para caber en el túnel subcutáneo (Paso 2.4), es necesario formar una nueva punta acortando el electrodo a una longitud adecuada. El electrodo debe estar plano contra el cuerpo en toda la longitud del cable. Los electrodos demasiado largos molestarán a los animales e intentarán abrir la herida para eliminar el transmisor, lo que provocará un riesgo de irritación tisular y dehiscencia de la herida. Por supuesto, los cables demasiado cortos no se pueden extender y puede ser que en este caso los electrodos no se puedan colocar de tal manera que correspondan a la configuración de Einthoven II. Por lo tanto, recomendamos determinar la longitud óptima de las derivaciones del ECG en un ratón muerto del mismo sexo, peso y antecedentes genéticos.

Los ratones deben tener un tiempo de recuperación más largo después de la implantación del transmisor si no tienen un ritmo circadiano normal y este no es el fenotipo de la línea de ratones en estudio (paso 2.7). Otra razón para los ritmos circadianos alterados podría ser el aislamiento acústico inadecuado de la instalación de animales o del personal que ingresa a la habitación durante la medición.

El análisis de datos de ECG, PA y BRS es sencillo (Paso 2.8). El paso más crítico es excluir los latidos ectópicos, las pausas sinusales, los episodios arrítmicos o las secciones con señales de baja calidad del análisis de datos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL	CP-Pharma, Germany	1229	anesthesia
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe	Wolfram Droh GmbH, Germany	9166017V
Bepanthen eye and nose ointment	Bayer AG, Germany
Blunt dissecting scissors	Fine Science Tools GmbH, Germany	14078-10
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL	CP-Pharma, Germany	115	preemptive and post-operative pain relief
Cutasept F skin desinfectant	BODE Chemie GmbH, Germany	9803650
Cotton Tipped Applicator sterile	Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany	09-119-9100
Forceps - Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools GmbH, Germany	11253-25
Forceps - straight	Fine Science Tools GmbH, Germany	11008-13
Gauze swabs with cut edges, 7.5x7.5 cm, cotton	Paul Hartmann AG. Germany	401723
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters	Data Sciences International, United States
Homothermic blanket system with flexible probe	Harvard Apparatus, United States
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools GmbH, Germany	18000-45
Ketamine 10%	Ecuphar GmbH, Germany	799-760	anesthesia
Magnet	Data Sciences International, United States		transmitter turn on/off
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter	Fine Science Tools GmbH, Germany	12502-12
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710005525	24 G needle
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710004020	27 G needle
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided)	Resorba Medical, Germany	PA10273	lead fixation
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided)	Resorba Medical, Germany	4023	skin closure
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope	Zeiss, Germany
Pilca depilatory mousse	Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany	6943151
PVP-Iodine hydrogel 10%	Ratiopharm, Germany
Ringer's lactate solution	B. Braun Melsungen AG, Germany	401-951
Sensitive plasters, Leukosilk	BSN medical GmbH, Germany	102100	surgical tape
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml	B. Braun Melsungen AG, Germany
Surgibond tissue adhesive	SMI, Belgium	ZG2
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided)	Resorba Medical, Germany	G2105	lead preparation, ligation sutures
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1	Procter & Gamble
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools GmbH, Germany	18403-11
Xylazine (Xylariem) 2%	Ecuphar GmbH, Germany	797469	anesthesia
Data acquisition and analysis	Source
DSI Data Exchange Matrix	Data Sciences International, United States
DSI Dataquest ART 4.33	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI Ponemah	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI PhysioTel HDX-11 for mice	Data Sciences International, United States
DSI PhysioTel receivers RPC1	Data Sciences International, United States
ecgAUTO v3.3.5.11	EMKA Technologies		ECG and BP analysis software
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, United States