Implantação de ECG Telemétrico Combinado e Transmissores de Pressão Arterial para Determinação da Sensibilidade Barorreflexa Espontânea em Camundongos Conscientes

Resumo

O barorreflexo é um mecanismo de regulação da frequência cardíaca pelo sistema nervoso autônomo em resposta a alterações da pressão arterial. Descrevemos uma técnica cirúrgica para implantar transmissores de telemetria para medição contínua e simultânea de eletrocardiograma e pressão arterial em camundongos. Isso pode determinar a sensibilidade barorreflexa espontânea, um importante marcador prognóstico para doença cardiovascular.

Resumo

A pressão arterial (PA) e a frequência cardíaca (FC) são controladas pelo sistema nervoso autônomo (SNA) e estão intimamente interligadas devido a mecanismos reflexos. O barorreflexo é um mecanismo homeostático chave para neutralizar alterações agudas e de curto prazo na PA arterial e manter a PA em uma faixa fisiológica relativamente estreita. A PA é detectada por barorreceptores localizados no arco aórtico e seio carotídeo. Quando a PA se altera, os sinais são transmitidos ao sistema nervoso central e são então comunicados aos ramos parassimpático e simpático do sistema nervoso autônomo para ajustar a FC. Um aumento na PA causa uma diminuição reflexa na FC, uma queda na PA causa um aumento reflexo na FC.

A sensibilidade barorreflexa (SBR) é a relação quantitativa entre alterações na PA arterial e alterações correspondentes na FC. Em vários estudos, foi relatada redução da SBR em, por exemplo, insuficiência cardíaca, infarto do miocárdio ou doença arterial coronariana.

A determinação da SBR requer informações tanto da PA quanto da FC, que podem ser registradas simultaneamente por meio de aparelhos telemétricos. O procedimento cirúrgico é descrito iniciando-se com a inserção do sensor de pressão na artéria carótida esquerda e posicionamento de sua ponta no arco aórtico para monitorização da pressão arterial, seguido da colocação subcutânea dos eletrodos transmissor e ECG. Descrevemos também os cuidados intensivos pós-operatórios e o manejo analgésico. Após um período de duas semanas de recuperação pós-cirurgia, os registros de ECG e PA de longo prazo são realizados em camundongos conscientes e irrestritos. Finalmente, incluímos exemplos de gravações de alta qualidade e a análise da sensibilidade espontânea dos barorreceptores usando o método de sequência.

Introdução

O reflexo barorreceptor arterial é o principal sistema de controle de feedback em humanos que proporciona um controle da pressão arterial (PA) em curto prazo e, possivelmente, também em longo^prazo1,2. Esse reflexo tampona perturbações na PA que ocorrem em resposta a gatilhos fisiológicos ou ambientais. Proporciona mudanças reflexas imediatas na frequência cardíaca, volume sistólico e resistência arterial periférica total. O reflexo origina-se nas terminações nervosas sensitivas do arco aórtico e seios carotídeos. Esses terminais nervosos compõem os barorreceptores arteriais. Os somatas dos terminais nervosos no arco aórtico estão localizados no gânglio nodoso, enquanto os dos terminais nervosos no seio carotídeo estão localizados no gânglio petroso. O reflexo é desencadeado pelo aumento da pressão arterial, que estica e ativa os terminais nervosos barorreceptores (Figura 1A). A ativação resulta em voleios de potencial de ação que são transmitidos centralmente através dos nervos aferentes depressores da aorta e do seio carotídeo para núcleos cardiovasculares do tronco cerebral, como o núcleo do trato solitário e o núcleo dorsal do nervo vago. Alterações na atividade nervosa aferente, por sua vez, modulam a atividade eferente autonômica. O aumento da atividade dos nervos barorreceptores diminui a atividade simpática e aumenta a atividade nervosa parassimpática. Assim, as consequências da ativação dos barorreceptores são a redução da frequência cardíaca, do débito cardíaco e da resistência vascular que, em conjunto, neutralizam e tamponam o aumento da pressão arterial³. Por outro lado, a diminuição da atividade dos nervos barorreceptores aumenta a atividade simpática e diminui a atividade nervosa parassimpática, o que aumenta a frequência cardíaca, o débito cardíaco e a resistência vascular e, assim, neutraliza a diminuição da pressão arterial.

Numerosos estudos em humanos e animais têm demonstrado que o reflexo barorreceptor pode ser ajustado em condições fisiológicas como exercício⁴, sono⁵, estresse térmico⁶ ou gravidez⁷. Além disso, há evidências de que o barorreflexo é cronicamente prejudicado em doenças cardiovasculares, como hipertensão, insuficiência cardíaca, infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. De fato, a disfunção barorreflexa também é utilizada como marcador prognóstico em diversas doenças cardiovasculares8,9,10. Além disso, a disfunção do barorreflexo também está presente nas desordens do SNA. Dada a importância do reflexo barorreceptor para estados de saúde e doença, a estimativa in vivo desse reflexo é um componente importante da pesquisa autonômica e cardiovascular com certas implicações clínicas sérias.

Linhagens genéticas de camundongos são ferramentas essenciais na pesquisa cardiovascular. Estudos in vivo de tais linhagens de camundongos fornecem informações valiosas sobre fisiologia e fisiopatologia cardiovascular e, em muitos casos, servem como sistemas modelo pré-clínicos para doenças cardiovasculares. Aqui fornecemos um protocolo para registro telemétrico in vivo de ECG e PA em camundongos conscientes, irrestritos e em movimento livre e descrevemos como a sensibilidade barorreflexa pode ser determinada a partir desses registros usando o método de sequência (Figura 1B). O método aplicado é chamado de método sequencial, pois as séries batimento a batimento da PA sistólica (PAS) e dos intervalos RR são triadas para sequências curtas de três ou mais batimentos durante aumento ou diminuição espontânea da PAS com adaptação reflexa da FC. Este método é o padrão-ouro para a determinação da sensibilidade barorreflexa, uma vez que apenas os mecanismos reflexos espontâneos são investigados. A técnica é superior às técnicas mais antigas, que envolviam procedimentos invasivos, como a injeção de drogas vasoativas para induzir alterações da PA.

Figura 1: Representação esquemática da avaliação da sensibilidade barorreflexa e barorreflexa pelo método sequencial. (A) Curso do barorreflexo durante um aumento agudo da pressão arterial. Um aumento em curto prazo da PA é detectado por barorreceptores localizados no arco aórtico e seio carotídeo. Essa informação é transmitida ao sistema nervoso central e induz uma diminuição da atividade nervosa simpática em paralelo com um aumento da atividade parassimpática. A liberação de acetilcolina das terminações nervosas localizadas na região do nó sinoatrial induz uma diminuição do segundo AMPc mensageiro nas células do marcapasso do nó sinoatrial e, consequentemente, uma redução da frequência cardíaca. Uma diminuição a curto prazo da pressão arterial tem o efeito oposto. (B) Traçados esquemáticos da PA durante uma sequência ascendente (painel superior esquerdo) e sequência descendente (painel superior direito) de três batimentos consecutivos. Uma sequência ascendente está associada a um aumento paralelo nos intervalos RR (painel inferior esquerdo) que é equivalente a uma diminuição na FC. Uma sequência descendente está associada a uma diminuição paralela nos intervalos RR (painel inferior direito) que equivale a um aumento na FC.

Protocolo

Realizar todos os estudos em animais em conformidade com as diretrizes institucionais locais e as leis nacionais sobre experimentação animal. Para este experimento, os estudos foram aprovados pelo Regierung von Oberbayern e estavam de acordo com as leis alemãs sobre experimentação animal. Animais WT (fundo C57BL/6J) e animais de um modelo de camundongo com síndrome sinusal doente exibindo sensibilidade aumentada à SBR (Hcn4^{tm3(Y527F; R669E; T670A)Biel)11} (fundo misto C57BL/6N e 129/SvJ) foram utilizados para este estudo.

1. Configuração do equipamento

1. Remova um transmissor telemétrico de sua embalagem estéril e encurte os cabos de ECG para o comprimento apropriado para o tamanho do mouse. Para um camundongo preto de seis anos de 12 semanas (C57BL/6J), pesando ~30 g, encurte o chumbo positivo (vermelho) para um comprimento de ~45 mm e o chumbo negativo (incolor) para um comprimento de ~40 mm usando tesoura.
   NOTA: Esses valores são dados como orientação e devem ser adaptados conforme necessário (Figura 2).
2. Remova aproximadamente 6 mm da tubulação de silicone do eletrodo de ECG usando um bisturi para expor o fio. Cubra as pontas do fio com tubulação excessiva deixando uma porção de ~2 mm do fio de ECG descoberto para registrar sinais elétricos. Fixar a tubulação de silicone com material de sutura de seda 5-0 inabsorvível (Figura 2A).
3. Anote o número de série do transmissor no protocolo de operação (Arquivo Suplementar 1).
4. Hidratar o transmissor em solução quente e estéril de NaCl a 0,9%.
5. Pese o rato e registe o seu peso.
6. Autoclave de todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Esterilizá-los durante a cirurgia e entre a operação de diferentes animais por calor seco usando um esterilizador de esferas de vidro quente.
   NOTA: Os instrumentos cirúrgicos devem resfriar até a temperatura ambiente antes do uso para evitar queimaduras na pele.
7. Desinfete a bancada de trabalho para garantir condições assépticas.

2. Implante cirúrgico de transmissores telemétricos para medidas combinadas de ECG e pressão arterial

1. Dissecção da artéria carótida comum esquerda.
   1. Anestesiar um camundongo por injeção intraperitoneal de mistura de anestesia (100 mg/kg de cetamina; 15 mg/kg de xilazina; 1 mg/kg de acepromazina). Realize um teste de pinça do dedo do pé para garantir que o mouse esteja totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia.
   2. Use um aparador para raspar a área cirúrgica abaixo do queixo em direção aos músculos peitorais transversais.
   3. Coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma placa cirúrgica com temperatura controlada regulada para 37 °C. Fixar os membros com fita cirúrgica e monitorar continuamente a temperatura corporal com termômetro retal (Figura 2C). Se a temperatura corporal cair abaixo de 37 °C, cubra o corpo do animal com gaze de algodão estéril durante a cirurgia.
   4. Aplique pomada ocular para proteger os olhos do animal durante a anestesia.
   5. Aplicar creme depilatório na área cirúrgica previamente raspada. Retire o cabelo e o creme depilatório usando um algodão e água morna após 3-4 min. Certifique-se de que a pele está limpa e livre de qualquer resíduo de cabelo e creme depilatório, para que a ferida não seja contaminada durante a operação.
   6. Desinfetar a pele com várias rodadas alternadas de esfoliação com iodopovidona ou clorexidina seguidas de álcool.
   7. Posicionar o animal sob microscópio dissecante e colocar um pano estéril ao redor da área cirúrgica.
   8. Faça uma incisão mediana de 1-1,5 cm através da pele do pescoço, começando imediatamente abaixo do queixo. Esforce-se para tornar a incisão o mais reta possível. (Figura 2D).
      NOTA: Durante as etapas seguintes, a área cirúrgica deve ser mantida úmida pela aplicação regular de NaCl 0,9% estéril, quente (37 °C).
   9. Crie um espaço subcutâneo em ambos os lados da incisão separando a pele do tecido conjuntivo subjacente com tesoura de dissecção romba. Tenha cuidado para não beliscar a pele muito fortemente com a pinça, pois isso pode causar necrose e levar à cicatrização prejudicada após a cirurgia.
   10. Separe as glândulas parótida e submandibular com aplicadores de ponta de algodão para expor a musculatura que recobre a traqueia.
   11. Retrair a glândula salivar esquerda com pinça de dissecção curva para identificar a artéria carótida esquerda localizada lateralmente à traqueia (Figura 2E).
   12. Dissecar cuidadosamente a artéria carótida do tecido adjacente usando pinças curvas. Tenha muito cuidado para não lesionar o nervo vago que está correndo ao longo do vaso. Continuar a dissecção romba para expor a artéria carótida esquerda a cerca de 10 mm de comprimento e separá-la completamente da fáscia vascular e do nervo vago (Figura 2F).
   13. Passar uma sutura de seda 5-0 inabsorvível sob a porção isolada da artéria carótida enquanto levanta levemente o vaso sanguíneo com pinça curva para reduzir o atrito entre a sutura e a artéria carótida, pois isso poderia facilmente danificar a parede vascular.
   14. Colocar a sutura cranialmente, apenas proximalmente à bifurcação da artéria carótida, formar um nó e amarrá-la para ligar definitivamente o vaso (Figura 2G). Fixar ambas as extremidades da sutura da oclusão craniana na mesa cirúrgica com fita cirúrgica.
   15. Passar uma segunda sutura de oclusão abaixo da artéria carótida e colocá-la caudalmente a ~5 mm de distância da sutura cranial (Figura 2H). É necessário para a oclusão temporária do fluxo sanguíneo durante a canulação da artéria. Portanto, amarre um nó solto e fixe ambas as extremidades da sutura com fita adesiva cirúrgica.
   16. Posicionar uma terceira sutura (ponto seguro) entre a sutura de oclusão cranial e caudal e fazer um nó solto (Figura 2I). Essa sutura é necessária para manter o cateter no lugar enquanto se canula a artéria. Colocar uma das extremidades da sutura na mesa cirúrgica.
2. Canulação da artéria carótida comum esquerda.
   OBS: A área sensor do cateter de pressão arterial está localizada a 4 mm da extremidade distal e consiste de um tubo contendo um líquido não compressível e um gel biocompatível (Figura 2B). Como essa área é muito sensível, certifique-se de que ela esteja livre de bolhas de ar e não toque nela em nenhum momento durante o procedimento.
   1. Dobre a ponta de uma agulha de 24 G para um ângulo de ~100° para usá-la como introdutor de cateter.
   2. Puxe suavemente a sutura de oclusão caudal e fixe-a com tensão para interromper temporariamente o fluxo sanguíneo e levantar levemente a artéria.
   3. Penetrar cuidadosamente a artéria proximal à sutura da oclusão craniana com a agulha dobrada (Figura 2J). Segure o cateter com pinça de canulação do vaso, introduza-o na pequena punção e deixe-o deslizar lentamente para dentro do vaso. Puxe suavemente a agulha dobrada simultaneamente (Figura 2K).
   4. Quando o cateter atingir a sutura de oclusão caudal, aperte levemente a sutura segura para manter o cateter no lugar (Figura 2L).
   5. Soltar a sutura da oclusão caudal para que o cateter possa ser movimentado até que sua ponta seja posicionada no arco aórtico.
      NOTA: Certifique-se de determinar o comprimento de inserção correto do cateter, pois isso depende do tamanho do mouse. Para camundongos machos com fundo C57BL/6J com 12 semanas de idade e ~30 g de peso corporal, recomendamos a inserção do cateter até que a incisura integrada atinja a sutura de oclusão craniana. A correta profundidade de inserção e posicionamento do cateter para a linhagem específica do camundongo pode ser verificada após a eutanásia do animal.
   6. Uma vez posicionado adequadamente, fixe o cateter com as três suturas e corte as extremidades o mais curto possível. Não puxe os nós muito apertados, pois isso pode danificar o frágil cateter de pressão arterial.

Figura 2: Implante de ECG combinado e transmissor de pressão arterial - canulação da artéria carótida esquerda . (A) O transmissor de telemetria é composto por um cateter de pressão, dois eletrodos de biopotencial e o corpo do dispositivo. (B) Representação esquemática do cateter de pressão. A área do sensor consiste em um fluido não compressível e um gel biocompatível. O cateter deve ser inserido na artéria carótida até que a incisura esteja no nível da sutura da oclusão craniana para garantir a posição adequada no vaso sanguíneo. (C) Camundongo C57BL/6J anestesiado preparado para implante cirúrgico de transmissor. (D-L) Sequência de imagens mostrando procedimento cirúrgico para canulação da artéria carótida esquerda. (D) Incisão cutânea cervical. (E) Traqueia exposta para identificar a artéria carótida esquerda localizada lateralmente à traqueia. (F) Dissecção romba para isolar a artéria do tecido adjacente e do nervo vago. (G) Ligadura permanente da artéria carótida esquerda com sutura da oclusão cranial. (H) Tensão aplicada à sutura de oclusão caudal para interromper temporariamente o fluxo sanguíneo. (I) Sutura segura para manter o cateter no lugar durante a canulação. (J) Cânula com ponta curva para inserção do cateter no vaso sanguíneo. (K) O cateter de pressão é inserido na artéria carótida. (L) A ponta do cateter é posicionada no arco aórtico e o cateter fixado com sutura média. A barra de escala em D - L mostra 4 mm. Reimpresso a partir de¹⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Colocação do corpo do aparelho de telemetria em uma bolsa subcutânea no flanco esquerdo do mouse (Figura 3).
   1. Formar um túnel subcutâneo a partir do pescoço direcionado para o flanco esquerdo do animal e formar uma pequena bolsa com uma pequena tesoura dissecante romba (Figura 3B).
   2. Irrigar o túnel com uma seringa de 1 mL preenchida com solução quente e estéril de NaCl a 0,9% e introduzir ~300 μL da solução na bolsa (Figura 3C).
   3. Levante cuidadosamente a pele com pinça romba e introduza o corpo do dispositivo transmissor na bolsa (Figura 3D). Durante esta etapa, tenha muito cuidado para não puxar o cateter de pressão arterial para fora da artéria carótida.
4. Colocação das derivações do ECG na configuração de Einthoven II.
   1. Formar um túnel fino para o músculo peitoral direito com tesoura dissecante romba e colocar o chumbo negativo (incolor) no túnel usando pinça romba. Fixar a extremidade terminal do cabo-eletrodo com um ponto no músculo peitoral com material de sutura absorvível 6-0 (Figura 3E).
   2. Formar uma alça no eletrodo positivo (vermelho), posicionar sua ponta na região da costela caudal esquerda e fixar sua posição com sutura com sutura absorvível 6-0.
      OBS: É importante que ambos os eletrodos fiquem encostados ao corpo por toda a sua extensão para evitar irritação tecidual (Figura 3F).
   3. Fechar a pele com nós únicos com sutura inabsorvível 5-0 (Figura 3H). Além disso, aplique uma pequena quantidade de adesivo tecidual em cada nó para evitar que o animal morda a sutura e evite deiscências.
   4. Aplique hidrogel de iodopovidona 10% na ferida para prevenir a infecção da ferida durante a fase de recuperação.
   5. Para alívio preemptivo da dor, injetar 5 mg/kg de carprofeno em NaCl a 0,9 % por via subcutânea enquanto o rato ainda estiver sob anestesia.
   6. Ajuste uma plataforma de aquecimento para 39 ± 1 °C e coloque o rato numa gaiola separada. Posicione metade da gaiola na plataforma por 12 h após a cirurgia e transfira o mouse para a área quente. Quando o animal acorda da anestesia, ele tem a opção de ficar na área quente ou se deslocar para a parte mais fria da gaiola.

Figura 3: Implante de um ECG combinado e transmissor de pressão arterial - colocação subcutânea dos eletrodos de ECG e corpo do dispositivo . (A) Camundongo após inserção do cateter de pressão arterial. A posição do cateter é assegurada pelas suturas de oclusão. (B) Formação de uma bolsa subcutânea no flanco esquerdo do animal com tesoura romba. (C) A bolsa é irrigada com ~300 μL de soro fisiológico estéril aquecido. (D) O corpo do dispositivo é colocado na bolsa subcutânea. (E) A extremidade terminal do eletrodo negativo (incolor) é fixada ao músculo peitoral direito com material de sutura absorvível. (F) Fixação do eletrodo positivo (vermelho) nos músculos intercostais esquerdos. (G) Colocação de uma sutura permanente no músculo torácico para assegurar a posição dos eletrodos de ECG. (H) Camundongo após o fechamento da pele. As posições subcutâneas das pontas dos eletrodos de ECG são indicadas por círculos vermelhos. Para fins de demonstração, um animal morto foi usado para tirar essas imagens. Por favor, siga práticas estéreis ao usar um animal vivo. Reproduzido a partir de¹⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Cuidados pós-operatórios
   1. Para alívio da dor pós-operatória, injetar 5 mg/kg de carprofeno em NaCl a 0,9% por via subcutânea a cada 12 h por 3-5 dias até que a ferida tenha cicatrizado.
   2. Injetar 10 μL/g de solução quente de ringer-lactato por via intraperitoneal para proteger o animal da desidratação.
   3. Deixe o mouse se recuperar por 2-3 semanas antes de executar as primeiras medições telemétricas. Monitore cuidadosamente as condições gerais de saúde, cicatrização de feridas, peso corporal e ingestão de alimentos e água durante o período de recuperação.
   4. Ao final do experimento, eutanasiar o camundongo por inalação de dióxido de carbono (CO₂).
      NOTA: A luxação ou decapitação cervical não é recomendada como método de eutanásia, uma vez que isso poderia danificar partes do dispositivo transmissor de ECG e BP.
6. Aquisição de dados.
   1. Tomar medidas para evitar ruídos acústicos e eletrônicos durante a gravação de dados. Além disso, limite o acesso do pessoal durante o registro dos dados e conclua todos os procedimentos de criação antes do experimento.
   2. Coloque a gaiola do animal na placa receptora de telemetria e ligue o transmissor telemétrico aproximando um ímã do animal.
   3. Adquira registros contínuos de ECG, pressão arterial e atividade ao longo de 72 h (ciclo escuro/claro de 12 h) com software de aquisição de dados (Figura 4).
7. Análise do ritmo circadiano da frequência cardíaca, pressão arterial e atividade.
   1. Verificar a presença de ritmo circadiano regular de FC, PA e atividade por meio de software de aquisição de^dados12 (Figura 5).
8. Análise dos dados incluindo a determinação da sensibilidade dos barorreceptores usando o método de sequência com ECG e software de análise de PA.
   1. Exportar dados de PA e FC do software de aquisição de dados para o software de análise de ECG e PA (Arquivo Suplementar 2). Use a seguinte sequência de comandos: Abra o software de análise de ECG e BP > File > Dados brutos do conversor > Converter dados brutos não-IOX. Na nova janela, clique em Arquivo > Carregar dados do Dataquest ART4. Novamente, uma nova janela será aberta, selecione o arquivo de dados para exportação > Nova janela se abre, selecione animal na lista de "assuntos" e selecione ECG e BP na "lista de formas de onda" e pressione OK. Escolha animais dos quais os dados devem ser convertidos clicando em Converter dados > Criar arquivo de site binário IOX.
   2. Abra o arquivo de site binário IOX no software de análise de ECG e BP usando a seguinte sequência de comandos: Arquivo > Carregar dados IOX > Selecione rastreamento de BP e ECG > pressione a marca de seleção verde.
      NOTA: Os seguintes parâmetros de processamento de dados são otimizados para dados adquiridos de ratos wildtype e devem, em princípio, ajustar-se a todos os modelos de rato utilizados no campo pré-clínico. No entanto, a adaptação desses parâmetros pode ser necessária ao trabalhar com modelos experimentais específicos, por exemplo, camundongos com valores extremamente altos ou baixos de FC e/ou PA, ou diferentes espécies de roedores. De qualquer forma, os parâmetros de processamento de dados precisam ser cuidadosamente revisados para garantir que se ajustem ao modelo específico em estudo.
   3. Para configurações para análise de ECG, BP e BRS, consulte Arquivo Suplementar 3,4. Para a análise da SBR em camundongos, ajustar os parâmetros da SBR para detectar apenas sequências de três (ou mais) batimentos exibindo um atraso entre PAS e FR de um batimento e definir o limiar para mudança de PAS e FR para 0,5 mmHg e 2 ms. Certifique-se de que o coeficiente de correlação da inclinação da reta de regressão dos gráficos RR/PAS seja maior que 0,75 e analise apenas os cortes que apresentam ritmo sinusal estável. Defina parâmetros para análise de ECG, BP e BRS de acordo usando a seguinte sequência de comandos: Ajuste > configurações de análise > nova janela é aberta
      1. Configurações de ECG (clique com o botão direito do mouse na janela "Modo ECG e filtragem de sinal" (Arquivo Suplementar 3)). Defina os parâmetros conforme detalhado aqui. Modo: ECG, RR-only, Modo de filtro: auto, de acordo com a FC definida, Frequência cardíaca esperada: bpm > 300, Largura do filtro de remoção de linha de base (ms): 100,00, Largura do filtro de remoção de ruído: 1,00 ms, Filtro de entalhe: 50,0 Hz, Filtro de remoção de pico: desligado, Modo de detecção de drop-out: desligado, Comprimentos máximos de RR (ms): 900,00, RR de picos de R ajustados: desligado, modo de configurações de RR_only: Xsmall: mouse, largura de pico R (ms): 10,00, largura PR (ms): 20,00, largura RT (ms): 50,00, artefato interbatimento máximo (%): 50,00, relação R para outra amplitude: 3,00, sinal de pico R: positivo e parâmetro extra de computação: desativado
      2. Para as configurações de pressão arterial (PA, configurações de pressão) clique com o botão direito do mouse na janela "Analisador de PA" (Arquivo Suplementar 4). Defina os parâmetros conforme detalhado aqui. Largura do filtro de remoção de ruído (ms): 10,00, Largura do filtro derivado (ms): 6,00, Filtro de entalhe: 50,0 Hz, Filtro de remoção de pico: desligado, Limite de validação (unidade cal.): 12,00, Limiar de rejeição (unidade cal.): 8,00, Derivada no início do upstroke (cal U/s): 10,00, Limites de rejeição: desligado, Atraso do ecg de referência: janela definida pelo usuário, Atraso mínimo do ecg Rpico (ms): 10,00, Atraso máximo do ecg Rpico (ms): 250,00, Conduct_time_1 da marca: não computada, Conduct_time_2 da marca: não computada, BR (frequência respiratória): off, BRS (sensibilidade barorreflexa): ligado, Número mínimo de batimentos consecutivos: 3, Número de batimento de latência: 1, Valor de pressão: PAS, Marcar para calcular o intervalo de pulso: R, Variação de pressão mínima (caIU): 0,50, Variação mínima do intervalo (ms): 2,00, Correlação mínima: 0,75
   4. Rastreie o sinal de atividade para uma sequência de 3 horas com baixa atividade. Realizar a análise da SBR nessa janela de tempo, uma vez que a alta atividade dos animais interfere na correlação da PA e FR.
   5. Realize uma análise da PA e FR durante essa janela de tempo de 3 horas enquanto subdivide a análise de 3 horas em etapas de 10 minutos.
   6. Execute a análise BRS usando a seguinte sequência de comandos: Abra a janela de análise BRS > Exibir > análise BRS. Isso abre o painel de análise do BRS. Inspecione manualmente todas as sequências exibidas no painel de análise do BRS e exclua batimentos ectópicos, pausas sinusais, eventos arrítmicos ou dados ruidosos. Certifique-se de invalidar cada batida dessas sequências para excluí-las com sucesso da análise.
   7. Exporte os resultados da análise BRS para um arquivo de planilha (Arquivo de Resultados). Modifique os parâmetros que são exportados para o arquivo de planilha usando a seguinte sequência de comandos (arquivos suplementares 5-7):
      1. Ajuste > parâmetros nas seções de > de lista/arquivo > txt (Arquivo Suplementar 5). Selecione a seção "beats" e qualquer outra seção que contenha informações de interesse, exceto a seção de batidas invalidadas.
      2. Ajuste > parâmetros na lista/para arquivo > etapas > txt (Arquivo Suplementar 6). Escolha os valores da etapa a serem exportados.
      3. Tune > Parameters na lista/para arquivo > bate -> txt (Arquivo Suplementar 7).
      4. Certifique-se de que a seção beats do arquivo contenha pelo menos os seguintes dados para cada batida. ECG_RR, ECG_HR, BP_SBP, BP_BRS_deltaP, BP_BRS_# (=intervalos de batimentos consecutivos da sequência), BP_BRS_slope, BP_BRS_correl, BP_BRS_shiftl (=RR do batimento subsequente)
      5. Em seguida, clique em Arquivo > Salvar arquivo de resultados.
   8. Classifique os dados exportados para sequências para cima e para baixo usando a função de filtro do Excel (Arquivo Suplementar 8). Calcular o número de sequências, a inclinação média da BRS, o desvio padrão e o erro padrão da inclinação da BRS para as sequências ascendentes e descendentes separadamente. Calcule também a quantidade total de sequências por 1000 batidas.
      NOTA: Um modelo de planilha (TemplateBRS) para classificação e análise automatizada de sequências para cima e para baixo é fornecido no Suplemento (Arquivo Suplementar 8) e facilita a análise. Ao ajustar a função de filtro, você pode classificar sequências por diferentes números de batida (por exemplo, sequências de três ou quatro batidas). Para mais detalhes, ver Arquivos suplementares 9-13.
      1. Abra o arquivo de resultados e o arquivo TemplateBRS Excel (arquivo suplementar 8). Copie os dados das seguintes colunas do arquivo de resultados: (Pressão)_BRS_deltaP, (Pressão)_BRS_# e (Pressão)_BRS_slope (Arquivo suplementar 9). Cole os dados nas respectivas colunas das planilhas "Sequências para cima" e "Sequências para baixo" no arquivo TemplateBRS (Arquivo suplementar 10). Além disso, copie os dados da coluna (Pressão)_BRS_SBP do arquivo de resultados (arquivo suplementar 11) e cole-os na planilha "Todas as sequências" no arquivo TemplateBRS (arquivo suplementar 12).
         Observação : o número na coluna (Pressão)_BRS_# é listado somente na última batida de uma sequência e representa o comprimento da sequência. As sequências para cima e para baixo podem ser distinguidas pelo sinal do valor (Pressão)_deltaP. Valores negativos para o segundo e terceiro batimento de uma sequência de três batimentos indicam uma sequência para baixo. Valores positivos indicam uma sequência ascendente, respectivamente.
      2. Filtre os dados copiados com as configurações de filtro padrão. Clique no ícone de filtro da coluna (Pressão)_BRS_# e pressione "ok" (Arquivo Suplementar 13). Aplique esta etapa às planilhas "Sequências para cima" e "Sequências para baixo".
         Observação : a planilha filtra para sequências de três batidas. Se outros comprimentos de sequência forem solicitados, a configuração desta coluna deverá ser alterada no menu suspenso. Os cálculos do número de sequências, da inclinação média da SBR, do desvio padrão e do erro padrão da inclinação da SBR são apresentados nas caixas verdes das planilhas "Sequências para cima" e "Sequências para baixo". Os cálculos para o número total de sequências por 1000 batidas aparecem na caixa verde da planilha "Todas as sequências".

Resultados

Resultados positivos para dados brutos de ECG e PA
Usando este protocolo, dados de ECG e PA de alta qualidade podem ser adquiridos (Figura 4 e Arquivo Suplementar 14), permitindo não apenas uma análise precisa da SBR, mas também a análise de uma ampla gama de parâmetros derivados do ECG ou da PA, por exemplo, intervalos de ECG (Figura 4B, painel superior), parâmetros de pressão arterial (Figura 4B, painel inferior), frequência cardíaca e variabilidade da pressão arterial, detecção de arritmias etc^12,13,14,15.

Figura 4: Registros telemétricos de ECG e PA. (A) Traçado de ECG representativo e de alta qualidade (painel superior) e correspondentes registros brutos de PA de alta qualidade (painel inferior). (B) Ampliação dos traços de ECG (painel superior). Onda P, complexo QRS, onda T e intervalo RR são indicados. Ampliação dos dados de PA correspondentes (painel inferior). A PA diastólica (PAD) e a PA sistólica (PAS) estão indicadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados positivos para ritmo circadiano
Um camundongo hígido que se recuperou suficientemente da cirurgia apresenta aumento fisiológico da atividade, FC e PA durante a fase de atividade (escuro) (Figura 5). Muitos fatores diferentes podem perturbar esse ritmo circadiano regular. Estes incluem estresse psicológico, ruído acústico ou elétrico e dor. Por exemplo, uma condição de dor aguda imediatamente após a cirurgia resultaria em um aumento na frequência cardíaca com uma diminuição simultânea da atividade. Portanto, o ritmo circadiano é um importante indicador para a saúde e bem-estar animal e deve ser verificado rotineiramente antes da análise da SBR.

Figura 5: Análise das medidas de telemetria de longo prazo para determinar as variações do ritmo circadiano. O ritmo circadiano da frequência cardíaca (A), atividade (B), pressão arterial sistólica (C) e pressão arterial diastólica (D) foi medido em 9 camundongos C57BL/6J selvagens machos durante ciclos claros e escuros de 12 h. Áreas cinzentas retratam a fase de atividade (escura) e áreas brancas retratam a fase de repouso (clara) dos animais. Todos os parâmetros são fisiologicamente elevados durante a fase de atividade (escura) do animal. Os dados são representados como média +/- MEV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados positivos para a análise da SBR
Após a realização da análise conforme descrito na seção 2.8 do protocolo, o software detectará sequências ascendentes e descendentes, respectivamente. O método utilizado é denominado método sequencial, uma vez que as mudanças nos intervalos PAS e RR são examinadas batimento a batimento durante sequências curtas de três ou mais batimentos com elevação ou queda espontânea da PAS (Figura 6). Uma elevação contínua da PAS ao longo de três batimentos cardíacos causa um aumento reflexo da atividade parassimpática e, em consequência, retarda a FC, o que equivale a intervalos RR mais longos. A latência para a adaptação da FC reflexa é de um batimento. Tal sequência é mostrada na Figura 6A e é definida como uma sequência ascendente. Em contraste, uma queda contínua da PAS ao longo de três batimentos com elevação paralela da FC (diminuição do intervalo RR) é definida como uma sequência descendente (Figura 6B). Para avaliar a correlação entre FR e PAS, ambos os parâmetros são plotados entre si e a inclinação (ms/mmHg) da reta de regressão linear é calculada para cada sequência (Figura 6A,B, painéis inferiores). Após a classificação por sequências para cima e para baixo, pode-se calcular o número médio de sequências por 1000 batimentos (Figura 6C) e o ganho médio de SBR espontânea para as sequências para cima e para baixo, respectivamente (Figura 6D,E). O ganho da SB espontânea é refletido pela inclinação da reta de regressão linear calculada a partir da relação RR/PAS. O desvio dos valores normais da SBR pode ter várias causas. Estes incluem alterações na entrada do SNA ou alterações na responsividade do nó sinoatrial à entrada do sistema nervoso autônomo. Na Figura 6 é mostrado aumento da SBR em um modelo de camundongo para síndrome do seio doente (SSS) com responsividade exagerada do nó sinoatrial à entrada^vagal11.

Figura 6: Estimativa da SBR pelo método de sequências. (A) Traço representativo da PA de um camundongo selvagem C57BL/6J durante uma sequência ascendente de três batimentos consecutivos (painel superior) associado a um aumento paralelo no intervalo RR (painel médio) que é equivalente a uma diminuição na FC. Os intervalos RR foram plotados contra a PAS (painel inferior). A inclinação da reta de regressão (linha vermelha) para a sequência ascendente representada no painel superior e médio (WT, círculos pretos) foi de 4,10 ms/mmHg. Uma relação RR/PAS representativa do modelo de camundongos com síndrome do seio doente produziu um aumento da inclinação de 6,49 ms/mmHg, indicando SBR elevada (SSS, círculos cinzentos). (B) Sequência descendente representativa de um camundongo selvagem com queda da PAS (painel superior) e subsequente diminuição do intervalo RR (painel médio) que resulta em inclinação da SBR de 4,51 ms/mmHg (painel inferior; WT, círculos pretos). Relação RR/PAS representativa do modelo de camundongos com síndrome do seio doente (SSS, grey circles) com inclinação de 7,10 ms/mmHg. A orientação das pontas de seta vermelhas indica a direção das sequências (sequência para cima ou para baixo). (C) Quantidade total de sequências por 1000 batimentos para camundongos WT e SSS. (D) Inclinação média da relação RR/PAS para sequências up para camundongos WT e SSS. (E) Inclinação média da relação RR/PAS para sequências descendentes de camundongos WT e SSS. A estatística em (C-E) foi realizada a partir dos resultados de seis animais WT machos e oito animais machos do modelo camundongo com síndrome do seio doente. Boxplots mostram a linha mediana, perc 25/75 e valor min/max; Os símbolos abertos representam o valor médio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultado negativo para a qualidade dos dados brutos
Especialmente durante as fases de maior atividade, a qualidade do sinal pode diminuir (Figura 7 e Arquivos Suplementares 15,16). Isso pode ser causado por deslocamento temporário ou posição incorreta do cateter de PA ou das derivações de ECG ou de ambos devido ao movimento do animal. Além disso, a atividade muscular esquelética pode ser detectada a partir das derivações do ECG e induzir ruído (Figura 7B, painel superior). Com as configurações de software descritas acima, esses batimentos de baixa qualidade não são detectados e, portanto, são excluídos da análise. No entanto, a inspeção manual dos dados brutos analisados é obrigatória.

Figura 7: Exemplos de sinais brutos de baixa qualidade. (A) O sinal de ECG (painel superior) é detectado com boa qualidade, mas a qualidade do sinal BP (painel inferior) é baixa. (B) As qualidades do sinal de ECG (painel superior) e BP (painel inferior) não são suficientes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados negativos para a análise da SBR
As configurações de análise BRS listadas na seção 2.8.3 do protocolo são, em geral, essenciais para a detecção rápida e correta de sequências ascendentes e descendentes. O coeficiente de correlação mínimo para a reta de regressão é definido como 0,75. O estabelecimento de valores muito baixos para o coeficiente de correlação mínimo resulta em falsas detecções de sequências que não refletem a atividade barorreflexa, mas resultam de batimentos arrítmicos (Figura 8). Para a análise da SBR devem ser analisados apenas os episódios com ritmo sinusal estável. Batimentos ectópicos ou outros eventos arrítmicos, por exemplo, pausas sinusais, podem ser encontrados com a opção VFC do software de análise de ECG e PA e devem ser invalidados.

Figura 8: Sequências que não refletem a atividade barorreflexa . (A) Traçado eletrocardiográfico de camundongo com disritmia sinusal leve. (B) Registro da PA mostrando aumento espontâneo da PAS. (C) Intervalos RR correspondentes indicam diminuição da FC com o aumento da PA. (D) Gráfico da PAS e intervalos RR correspondentes. O baixo coeficiente de correlação da reta de regressão indica que a redução da FC não foi causada pela atividade do barorreflexo, mas sim pela disritmia sinusal. (E) Vestígio bruto de ECG mostrando uma pausa sinusal. (F) Sinal de PA bruto correspondente. A pausa sinusal provoca queda da pressão arterial diastólica. A pressão arterial sistólica do batimento subsequente quase não é afetada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Protocolo cirúrgico. Gabarito para documentação do procedimento cirúrgico e cuidados pós-operatórios. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Convertendo dados do Dataquest A.R.T em dados IOX para análise no software ecgAUTO. Selecione animais na lista de sujeitos (esquerda) e Pressão e ECG na lista de formas de onda (direita). Pressione OK para converter dados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 3: configurações de ECG para análise de BRS. Defina os parâmetros conforme listado, pressione ok e aplique a configuração. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 4: Configurações de PA para análise de BRS. Defina os parâmetros conforme listado, pressione ok e aplique a configuração. Salve a configuração como um arquivo de configuração para poder carregar as configurações facilmente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 5: Parâmetros na janela de lista/arquivo para "seções". Escolha as seções a serem exportadas sob as seções > cabeçalho txt (selecionado) e pressione Aplicar!. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 6: Parâmetros na janela de lista/arquivo para "etapas". Escolha os dados da etapa a serem exportados nas etapas > cabeçalho txt (selecionado) e pressione Aplicar!. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 7: Parâmetros na janela de lista/arquivo para "batidas". Escolha os valores a serem exportados sob o cabeçalho beats > txt (selecionado) e pressione Aplicar!. Para a análise da BRS são necessários os parâmetros assinalados. Observe a ordem de seleção indicada pelos números. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 8: arquivo de planilha TemplateBRS. Modelo de planilha para classificação automatizada e análise de sequências para cima e para baixo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 9: Copiando dados relevantes do Arquivo de Resultados I. Copie as colunas (Pressão)_BRS_deltaP, (Pressão)_BRS_# e (Pressão)_BRS_slope do Arquivo de Resultados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 10: Arquivo de modelo de planilha (TemplateBRS) para classificação e análise de dados I. Cole os dados copiados nas respectivas colunas da planilha "Sequências para cima" e "Sequências para baixo" no arquivo de planilha TemplateBRS. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 11: Copiando dados relevantes do Arquivo de Resultados II. Copie a coluna (Pressão)_BRS_SBP do arquivo de resultados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 12: Um arquivo de modelo de planilha (TemplateBRS) para classificação e análise de dados II. Cole os dados SBP copiados na planilha "Todas as sequências" no arquivo de planilha TemplateBRS para calcular o número total de sequências. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 13: Filtrando e analisando as sequências. Na planilha "Sequências para cima" do arquivo de planilha TemplateBRS, abra o menu suspenso do filtro de coluna (Pressão)_BRS_# e pressione OK sem alterar nenhum parâmetro. Isso classificará automaticamente os dados e atualizará os cálculos para sequências com 3 batidas. Repita isso para a planilha "Sequências para baixo". Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 14: Captura de tela de uma gravação de alta qualidade detectada com o software de análise de ECG e BP. O traçado superior (ECG) mostra a detecção de cada pico R e o traçado inferior (PA) mostra a detecção de cada pico de pressão diastólica (PD) e pressão sistólica (PS). As áreas sob picos detectados com sucesso são marcadas em vermelho. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 15: Captura de tela de uma gravação de PA de baixa qualidade onde os parâmetros de PA são detectados apenas parcialmente. O traçado superior (ECG) mostra a detecção de cada pico R, mas o traçado inferior (BP) mostra lacunas entre os picos de PA detectados. Os picos detectados de pressão diastólica (PD) e pressão sistólica (PS) são marcados com áreas vermelhas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 16: Captura de tela de um registro de ECG e PA de baixa qualidade onde os parâmetros de ECG e PA não puderam ser detectados. O traçado superior (ECG) mostra uma região (fundo roxo) onde os parâmetros do ECG não puderam ser detectados. A detecção de PA (rastreamento mais baixo) também falhou devido à baixa qualidade do sinal. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Importância do método em relação a métodos alternativos
No presente trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para quantificar a SBR espontânea usando o método de sequências. Essa abordagem utiliza alterações espontâneas da PA e da FC reflexa, medidas pelo ECG e telemetria da PA. A vantagem desse método é que ambos os parâmetros podem ser registrados em animais conscientes, em movimento livre, sem perturbar os animais, caminhando até a sala onde as medições são realizadas ou mesmo pela interação física necessária para a injeção de drogas. Esse ponto é muito importante, pois foi claramente demonstrado que tais distúrbios interferem severamente nos registros da FC e da PA. Por exemplo, a injeção de drogas requer fixação dos camundongos, o que causa uma resposta máxima ao estresse que aumenta a FC até 650-700 bpm. Para contornar essas respostas ao estresse, a SBR foi previamente determinada em camundongos anestesiados. Entretanto, os anestésicos padrão utilizados em medicina veterinária, como cetamina/xilazina ou isoflurano, induzem bradicardia e influenciam as respostas reflexas autonômicas, limitando a validade dessas abordagens e a interpretação dos resultados. Para superar parcialmente essas limitações, foram utilizados dispositivos de liberação de fármacos implantáveis, ou seja, bombas osmóticas, capazes de liberar fármacos para a cavidade peritoneal. No entanto, com bombas osmóticas não é possível aplicar um bolus de uma dose definida de fármaco limitando a aplicação de tais dispositivos. Alternativamente, cateteres de infusão complexos¹⁷ pode ser implantado em camundongos para administração de medicamentos. No entanto, esses cateteres são de difícil manuseio e requerem habilidades cirúrgicas comparáveis àquelas necessárias para o implante de dispositivos telemétricos, ao mesmo tempo em que produzem menos resultados científicos quando comparados às medidas da SB espontânea. Além das questões técnicas associadas à mensuração da SBR por injeção de fármacos, existem algumas limitações relacionadas à ação da droga per se. As abordagens tradicionais para a determinação da SBR incluem injeções em bolus de drogas vasoativas. No entanto, a injeção em bolus de vasoconstritores (por exemplo, fenilefrina) ou vasodilatadores (por exemplo, nitroprussiato de sódio) tem sido considerada um estímulo excessivo e não fisiológico para a adaptação da FC reflexa às alterações da PA¹⁸. A atividade espontânea do reflexo barorreceptor também pode ser quantificada usando métodos espectrais. Um desses métodos avalia a SBR no domínio da frequência por meio do cálculo da razão entre as alterações da FC e as alterações da pressão arterial em uma banda de frequência específica^18,19. Outros métodos espectrais envolvem a determinação da função de transferência da PA e FC ou a quantificação da coerência entre PA e FC^20,21. Esses métodos também requerem aquisição telemétrica de parâmetros espontâneos de PA e FC e, embora sejam apropriados para a determinação da SBR espontânea, requerem ferramentas computacionais intensivas e são difíceis de aplicar. Além disso, todos os métodos espectrais sofrem a limitação de que sinais não estacionários impedem a aplicação de métodos espectrais. Em particular, os picos espectrais induzidos por ritmos respiratórios podem ser reduzidos em pacientes humanos pedindo ao paciente para parar de respirar, enquanto isso obviamente não é possível em camundongos. Portanto, a relação sinal-ruído é frequentemente bastante baixa em camundongos. Dadas as limitações dos métodos discutidos acima, favorecemos o método de sequência para determinação da SBR em camundongos. Uma vantagem considerável desse método é o fato de ser uma técnica não invasiva que fornece dados sobre a SBR espontânea em condições reais²². Outro ponto importante é que a duração das sequências analisadas pelo método de sequências é bastante curta, envolvendo 3-5 batimentos. A regulação reflexa da FC pelo nervo vago é muito rápida e bem dentro do tempo dessas sequências. Portanto, o método de sequência é bem adequado para avaliar a contribuição do nervo vago para a SBR. Em contraste, a regulação pelo sistema nervoso simpático é muito mais lenta. De fato, durante essas sequências curtas, a atividade do sistema nervoso simpático pode ser assumida como quase constante. Portanto, o método é personalizado para detectar seletivamente alterações reflexas da FC impulsionadas pela atividade do nervo vago.

Interpretação dos dados da SBR
Para a interpretação da disfunção da SBR ou dos dados da SB per se, é importante considerar os níveis funcionais individuais que estão envolvidos no reflexo barorreceptor. No nível neuronal, componentes aferentes, centrais ou eferentes do reflexo podem estar afetados²³. No nível cardiovascular, pode estar presente responsividade reduzida ou exagerada do nó sinoatrial à entrada do SNA^11,24. Uma mudança em cada nível poderia levar a mudanças no BRS. A fim de dissecar se mecanismos neuronais e/ou cardíacos são responsáveis pelas alterações observadas na SBR, abordagens de deleção gênica cardíaca ou específica de neurônio, knock down ou edição gênica podem ser usadas.

Etapas críticas do protocolo
A etapa mais sofisticada e crítica desse protocolo é o preparo e a canulação da artéria carótida esquerda (Passo 2.3). A tensão da sutura de oclusão caudal deve ser suficientemente alta para interromper completamente o fluxo sanguíneo antes da canulação. Caso contrário, mesmo um pequeno vazamento de sangue durante a canulação pode restringir severamente a visibilidade ou até mesmo fazer com que o camundongo sangre até a morte. A canulação deve ser bem sucedida na primeira tentativa. No entanto, após o fracasso da primeira tentativa, ainda é possível repetir cuidadosamente a canulação.

A incisão mediana e o túnel subcutâneo do pescoço para o flanco esquerdo (Passo 2.3) devem ser grandes o suficiente para introduzir facilmente o transmissor sem força, mas também devem ser tão pequenos quanto possível para manter o transmissor no lugar. Caso contrário, será necessário travá-lo na posição com material de sutura ou adesivo tecidual. Como os ratos têm uma pele muito delicada, a necrose da pele pode ocorrer se o túnel para o transmissor for muito pequeno.

Se os eletrodos de ECG forem muito longos para caber no túnel subcutâneo (Passo 2.4), é necessário formar uma nova ponta, encurtando o eletrodo para um comprimento adequado. O eléctrodo deve estar encostado ao corpo durante todo o comprimento do cabo. Eletrodos muito longos perturbarão os animais e eles tentarão abrir a ferida para remover o transmissor, resultando em risco de irritação do tecido e deiscência da ferida. Os eletrodos muito curtos não podem, naturalmente, ser estendidos e pode ser que, neste caso, os eletrodos não possam ser posicionados de tal forma que correspondam à configuração de Einthoven II. Portanto, recomendamos determinar o comprimento ideal dos eletrodos de ECG em um camundongo morto do mesmo sexo, peso e origem genética.

Os ratinhos devem receber um tempo de recuperação mais longo após a implantação do transmissor se não tiverem um ritmo circadiano normal e este não for o fenótipo da linhagem de ratinhos em estudo (passo 2.7). Outra razão para os ritmos circadianos perturbados pode ser o isolamento acústico inadequado do biotério ou a entrada de pessoal na sala durante a medição.

A análise dos dados de ECG, PA e SBR é direta (Passo 2.8). O passo mais crítico é excluir da análise dos dados batimentos ectópicos, pausas sinusais, episódios arrítmicos ou cortes com sinais de baixa qualidade.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL	CP-Pharma, Germany	1229	anesthesia
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe	Wolfram Droh GmbH, Germany	9166017V
Bepanthen eye and nose ointment	Bayer AG, Germany
Blunt dissecting scissors	Fine Science Tools GmbH, Germany	14078-10
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL	CP-Pharma, Germany	115	preemptive and post-operative pain relief
Cutasept F skin desinfectant	BODE Chemie GmbH, Germany	9803650
Cotton Tipped Applicator sterile	Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany	09-119-9100
Forceps - Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools GmbH, Germany	11253-25
Forceps - straight	Fine Science Tools GmbH, Germany	11008-13
Gauze swabs with cut edges, 7.5x7.5 cm, cotton	Paul Hartmann AG. Germany	401723
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters	Data Sciences International, United States
Homothermic blanket system with flexible probe	Harvard Apparatus, United States
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools GmbH, Germany	18000-45
Ketamine 10%	Ecuphar GmbH, Germany	799-760	anesthesia
Magnet	Data Sciences International, United States		transmitter turn on/off
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter	Fine Science Tools GmbH, Germany	12502-12
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710005525	24 G needle
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710004020	27 G needle
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided)	Resorba Medical, Germany	PA10273	lead fixation
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided)	Resorba Medical, Germany	4023	skin closure
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope	Zeiss, Germany
Pilca depilatory mousse	Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany	6943151
PVP-Iodine hydrogel 10%	Ratiopharm, Germany
Ringer's lactate solution	B. Braun Melsungen AG, Germany	401-951
Sensitive plasters, Leukosilk	BSN medical GmbH, Germany	102100	surgical tape
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml	B. Braun Melsungen AG, Germany
Surgibond tissue adhesive	SMI, Belgium	ZG2
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided)	Resorba Medical, Germany	G2105	lead preparation, ligation sutures
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1	Procter & Gamble
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools GmbH, Germany	18403-11
Xylazine (Xylariem) 2%	Ecuphar GmbH, Germany	797469	anesthesia
Data acquisition and analysis	Source
DSI Data Exchange Matrix	Data Sciences International, United States
DSI Dataquest ART 4.33	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI Ponemah	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI PhysioTel HDX-11 for mice	Data Sciences International, United States
DSI PhysioTel receivers RPC1	Data Sciences International, United States
ecgAUTO v3.3.5.11	EMKA Technologies		ECG and BP analysis software
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, United States