Bilinçli Farelerde Spontan Barorefleks Duyarlılığını Belirlemek için Kombine Telemetrik EKG ve Kan Basıncı Transmitterlerinin İmplantasyonu

Özet

Barorefleks, kan basıncı değişikliklerine yanıt olarak otonom sinir sistemi tarafından kalp atış hızı düzenleme mekanizmasıdır. Farelerde elektrokardiyogram ve kan basıncının sürekli ve eşzamanlı ölçümü için telemetri transmitterlerini implante etmek için cerrahi bir teknik tarif ediyoruz. Bu, kardiyovasküler hastalık için önemli bir prognostik belirteç olan spontan barorefleks duyarlılığını belirleyebilir.

Özet

Kan basıncı (BP) ve kalp atış hızı (HR), otonom sinir sistemi (ANS) tarafından kontrol edilir ve refleks mekanizmaları nedeniyle yakından iç içe geçer. Barorefleks, arteriyel BP'deki akut, kısa süreli değişikliklere karşı koymak ve BP'yi nispeten dar bir fizyolojik aralıkta tutmak için anahtar bir homeostatik mekanizmadır. BP, aort arkı ve karotis sinüsünde bulunan baroreseptörler tarafından algılanır. BP değiştiğinde, sinyaller merkezi sinir sistemine iletilir ve daha sonra HR'yi ayarlamak için otonom sinir sisteminin parasempatik ve sempatik dallarına iletilir. BP'deki bir artış İK'da refleks azalmasına, BP'deki düşüş İK'da refleks artışına neden olur.

Barorefleks duyarlılığı (BRS), arteriyel BP'deki değişiklikler ile İK'daki karşılık gelen değişiklikler arasındaki kantitatif ilişkidir. Çeşitli çalışmalarda BRS'nin azaldığı bildirilmiştir, örneğin kalp yetmezliği, miyokard enfarktüsü veya koroner arter hastalığı.

BRS'nin belirlenmesi, telemetrik cihazlar kullanılarak aynı anda kaydedilebilen hem BP hem de İK'dan bilgi gerektirir. Cerrahi prosedür, basınç sensörünün sol karotis artere yerleştirilmesi ve arteriyel basıncı izlemek için ucunun aort arkına yerleştirilmesi ve ardından vericinin ve EKG elektrotlarının deri altına yerleştirilmesi ile başlar. Ayrıca postoperatif yoğun bakım ve analjezik yönetimi de tanımlıyoruz. Ameliyat sonrası iki haftalık bir iyileşme sürecinden sonra, bilinçli ve kısıtlanmamış farelerde uzun süreli EKG ve BP kayıtları gerçekleştirilir. Son olarak, yüksek kaliteli kayıt örneklerini ve sekans yöntemini kullanarak spontan baroreseptör duyarlılığının analizini dahil ediyoruz.

Giriş

Arteriyel baroreseptör refleksi, insanlarda arteriyel kan basıncının (ABP) kısa süreli ve muhtemelen daha uzun vadeli ^1,2 kontrolünü sağlayan ana geri besleme kontrol sistemidir. Bu refleks, BP'de fizyolojik veya çevresel tetikleyicilere yanıt olarak ortaya çıkan bozulmaları tamponlar. Kalp atış hızı, inme hacmi ve total periferik arter direncinde hızlı refleks değişiklikleri sağlar. Refleks, aort arkındaki duyusal sinir uçlarından ve karotis sinüslerinden kaynaklanır. Bu sinir terminalleri arteriyel baroreseptörleri oluşturur. Aort arkındaki sinir terminallerinin somataları nodoz ganglionunda, karotis sinüsteki sinir terminallerininkiler ise petrosal ganglionda bulunur. Refleks, baroreseptör sinir terminallerini geren ve aktive eden kan basıncındaki bir artışla tetiklenir (Şekil 1A). Aktivasyon, afferent aort depresörü ve karotis sinüs sinirleri aracılığıyla merkezi olarak nucleus tractus solitarii ve vagal sinirin dorsal çekirdeği gibi kardiyovasküler beyin sapı çekirdeklerine iletilen aksiyon potansiyeli voleybolları ile sonuçlanır. Afferent sinir aktivitesindeki değişiklikler sırayla otonom efferent aktivitesini modüle eder. Baroreseptör sinirlerin aktivitesinin artması sempatik azalış gösterir ve parasempatik sinir aktivitesini arttırır. Bu nedenle, baroreseptörlerin aktivasyonunun sonuçları, kalp atış hızı, kalp debisi ve vasküler dirençte bir azalmadır ve bu da birlikte kan basıncındaki artışa karşı koyar ve tampon oluşturur³. Buna karşılık, baroreseptör sinirlerin azalmış aktivitesi sempatik arttırır ve kalp atış hızını, kalp debisini ve vasküler direnci artıran ve böylece kan basıncındaki düşüşe karşı koyan parasempatik sinir aktivitesini azaltır.

İnsanlarda ve hayvanlarda yapılan çok sayıda çalışma, baroreseptör refleksinin egzersiz⁴, uyku⁵, ısı stresi⁶ veya hamilelik⁷ gibi fizyolojik koşullar altında ayarlanabileceğini göstermiştir. Ek olarak, barorefleksin hipertansiyon, kalp yetmezliği, miyokard enfarktüsü ve inme gibi kardiyovasküler hastalıklarda kronik olarak bozulduğuna dair kanıtlar vardır. Aslında, barorefleks disfonksiyonu birçok kardiyovasküler hastalıkta prognostik bir belirteç olarak da kullanılmaktadır ^8,9,10. Ayrıca, barorefleks disfonksiyonu ANS bozukluklarında da mevcuttur. Baroreseptör refleksinin sağlık ve hastalık durumları için önemi göz önüne alındığında, bu refleksin in vivo tahmini, bazı ciddi klinik etkileri olan otonom ve kardiyovasküler araştırmaların önemli bir bileşenidir.

Genetik fare çizgileri kardiyovasküler araştırmalarda önemli araçlardır. Bu tür fare çizgilerinin in vivo çalışmaları, kardiyovasküler fizyoloji ve patofizyoloji hakkında değerli bilgiler sağlar ve birçok durumda kardiyovasküler hastalıklar için klinik öncesi model sistemleri olarak hizmet eder. Burada, bilinçli, sınırsız, serbestçe hareket eden farelerde telemetrik in vivo EKG ve BP kaydı için bir protokol sunuyoruz ve sekans yöntemi kullanılarak bu kayıtlardan barorefleks duyarlılığının nasıl belirlenebileceğini açıklıyoruz (Şekil 1B). Uygulanan yönteme sekans yöntemi denir, çünkü sistolik BP (SBP) ve RR aralıklarının atımdan atıma serileri, İK'nın refleks adaptasyonu ile SBP'de spontan artış veya azalma sırasında üç veya daha fazla atımın kısa dizileri için taranır. Bu yöntem barorefleks duyarlılık tayini için altın standarttır çünkü sadece spontan refleks mekanizmaları araştırılmıştır. Teknik, BP değişikliklerini indüklemek için vazoaktif ilaçların enjeksiyonu gibi invaziv prosedürleri içeren eski tekniklerden daha üstündür.

Şekil 1: Dizi yöntemi kullanılarak baroreflex ve baroreflex duyarlılık değerlendirmesinin şematik gösterimi . (A) Kan basıncında akut bir artış sırasında barorefleksin seyri. ABP'de kısa süreli bir artış, aort arkı ve karotis sinüsünde bulunan baroreseptörler tarafından hissedilir. Bu bilgi merkezi sinir sistemine iletilir ve parasempatik aktivitedeki artışa paralel olarak sempatik sinir aktivitesinde bir azalmaya neden olur. Sinoatriyal düğüm bölgesinde bulunan sinir uçlarından asetilkolin salınması, sinoatriyal düğüm kalp pili hücrelerinde ikinci haberci cAMP'nin azalmasına ve dolayısıyla kalp atış hızının azalmasına neden olur. Kan basıncında kısa süreli bir düşüş tam tersi bir etkiye sahiptir. (B) Şematik BP, birbirini izleyen üç vuruşun yukarı sırası (sol üst panel) ve aşağı dizisi (sağ üst panel) sırasında izler. Bir yukarı sırası, HR'deki bir azalmaya eşdeğer olan RR aralıklarındaki (sol alt panel) paralel bir artışla ilişkilidir. Bir aşağı sıra, HR'deki bir artışa eşdeğer olan RR aralıklarında (sağ alt panel) paralel bir azalma ile ilişkilidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Tüm hayvan çalışmalarını, yerel kurumsal yönergelere ve hayvan deneyleriyle ilgili ulusal yasalara uygun olarak gerçekleştirin. Bu deney için, çalışmalar Regierung von Oberbayern tarafından onaylandı ve hayvan deneyleri ile ilgili Alman yasalarına uygundu. WT hayvanları (C57BL / 6J arka plan) ve artmış BRS duyarlılığı gösteren hasta bir sinüs sendromu fare modelinin hayvanları (Hcn4^{tm3 (Y527F; R669E; Bu çalışmada T670A)Biel})¹¹ (karışık C57BL/6N ve 129/SvJ arka plan) kullanılmıştır.

1. Ekipman kurulumu

1. Telemetrik vericiyi steril paketinden çıkarın ve EKG uçlarını farenin boyutuna uygun uzunluğa kadar kısaltın. ~30 g ağırlığındaki 12 haftalık bir erkek siyah altı fare (C57BL/6J) için, makas kullanarak pozitif kurşunu (kırmızı) ~45 mm uzunluğa ve negatif kurşunu (renksiz) ~40 mm uzunluğa kısaltın.
   NOT: Bu değerler oryantasyon olarak verilmiştir ve gerektiğinde uyarlanmalıdır (Şekil 2).
2. Teli açığa çıkarmak için bir neşter kullanarak EKG kablosunun silikon borusunun yaklaşık 6 mm'sini çıkarın. Telin uçlarını aşırı boruyla örtün ve elektrik sinyallerini kaydetmek için EKG telinin ~ 2 mm'lik bir kısmını açıkta bırakın. Silikon boruyu emilemeyen 5-0 ipek sütür malzeme ile sabitleyin (Şekil 2A).
3. Vericinin seri numarasını çalışma protokolüne yazın (Ek Dosya 1).
4. Transmitteri sıcak, steril % 0,9 NaCl çözeltisinde nemlendirin.
5. Fareyi tartın ve ağırlığını kaydedin.
6. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri otoklavlayın. Ameliyat sırasında ve farklı hayvanları çalıştırma arasında, sıcak cam boncuk sterilizatörü kullanarak kuru ısı ile sterilize edin.
   NOT: Cilt yanıklarını önlemek için cerrahi aletler kullanılmadan önce oda sıcaklığına kadar soğumalıdır.
7. Aseptik koşulları sağlamak için çalışma tezgahını dezenfekte edin.

2. Kombine EKG ve kan basıncı ölçümleri için telemetrik transmitterlerin cerrahi implantasyonu

1. Sol ortak karotis arterin diseksiyonu.
   1. Anestezi karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile bir fareyi uyuşturun (100 mg / kg ketamin; 15 mg / kg ksilazin; 1 mg / kg asepromazin). Ameliyata başlamadan önce farenin tamamen anestezi altından olduğundan emin olmak için bir ayak parmağı sıkışma testi yapın.
   2. Cerrahi bölgeyi çenenin altından enine pektoral kaslara doğru tıraş etmek için bir düzeltici kullanın.
   3. Fareyi 37 °C'ye ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir ameliyat plakasına sırtüstü yatırın. Uzuvları cerrahi bantla sabitleyin ve rektal termometre ile vücut ısısını sürekli izleyin (Şekil 2C). Vücut ısısı 37 ° C'nin altına düşerse, ameliyat sırasında hayvanın vücudunu steril pamuklu gazlı bezle örtün.
   4. Anestezi sırasında hayvanın gözlerini korumak için göz merhemi uygulayın.
   5. Daha önce tıraş edilmiş cerrahi bölgeye tüy dökücü krem sürün. 3-4 dakika sonra pamuklu bir ped ve ılık su kullanarak saçları ve tüy dökücü kremi çıkarın. Cildin temiz olduğundan ve artık saç ve tüy dökücü kremden arındırılmış olduğundan emin olun, böylece operasyon sırasında yara kirlenmez.
   6. Cildi birkaç alternatif povidon-iyot veya klorheksidin ovma turu ve ardından alkol ile dezenfekte edin.
   7. Hayvanı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve cerrahi alanın etrafına steril bir örtü yerleştirin.
   8. Çenenin hemen altından başlayarak boyun derisinden 1-1,5 cm'lik bir orta hat kesisi yapın. Kesi mümkün olduğunca düz hale getirmek için çaba gösterin. (Şekil 2D).
      NOT: Aşağıdaki adımlarda, cerrahi alan steril, sıcak (37 °C) % 0.9 NaCl düzenli olarak uygulanarak nemli tutulmalıdır.
   9. Künt diseksiyon makası ile cildi altta yatan bağ dokusundan ayırarak insizyonun her iki tarafında deri altı boşluk bırakın. Cildi forsepslerle çok kuvvetli bir şekilde sıkıştırmamaya dikkat edin, çünkü bu nekroza neden olabilir ve ameliyattan sonra yara iyileşmesinin bozulmasına neden olabilir.
   10. Trakeanın üzerindeki kas sistemini ortaya çıkarmak için pamuk ucu aplikatörleri kullanarak parotis ve submandibuler bezleri ayırın.
   11. Trakeaya lateral olarak yerleşmiş sol karotis arteri tanımlamak için sol tükürük bezini kavisli diseksiyon forsepsleri ile geri çekin (Şekil 2E).
   12. Karotis arteri kavisli forseps kullanarak bitişik dokudan dikkatlice diseke edin. Damar boyunca akan vagal sinire zarar vermemek için çok dikkatli olun. Sol karotis arteri yaklaşık 10 mm uzunluğa maruz bırakmak için künt diseksiyona devam edin ve vasküler fasyadan ve vagus sinirinden tamamen ayırın (Şekil 2F).
   13. Karotis arterin izole edilmiş kısmının altına emilmeyen, 5-0 ipek bir sütür geçirin ve dikiş ile karotis arter arasındaki sürtünmeyi azaltmak için kan damarını kavisli forsepslerle hafifçe kaldırın, çünkü bu vasküler duvara kolayca zarar verebilir.
   14. Sütürü kraniyal olarak, karotis arterin bifurkasyonuna yakın bir yere yerleştirin, bir düğüm oluşturun ve damarı kalıcı olarak bağlamak için bağlayın (Şekil 2G). Kraniyal oklüzyon sütürünün her iki ucunu cerrahi bantla ameliyat masasına sabitleyin.
   15. Karotis arterin altına ikinci bir oklüzyon sütürü geçirin ve kraniyal sütüre ~ 5 mm mesafede kaudal olarak yerleştirin (Şekil 2H). Arterin kanülasyonu sırasında kan akışının geçici olarak tıkanması için gereklidir. Bu nedenle, gevşek bir düğüm bağlayın ve her iki dikiş ucunu cerrahi bantla sabitleyin.
   16. Kraniyal ve kaudal oklüzyon sütürü arasına üçüncü bir dikiş (güvenli sütür) yerleştirin ve gevşek bir düğüm yapın (Şekil 2I). Bu dikiş, arteri kanüle ederken kateteri yerinde tutmak için gereklidir. Dikişin bir ucunu ameliyat masasına bantlayın.
2. Sol ortak karotis arterin kanülasyonu.
   NOT: Kan basıncı kateterinin sensör alanı distal uçtan 4 mm uzakta bulunur ve sıkıştırılamayan bir sıvı ve biyouyumlu bir jel içeren bir tüpten oluşur (Şekil 2B). Bu alan çok hassas olduğundan, hava kabarcıkları içermediğinden emin olun ve işlem sırasında herhangi bir zamanda dokunmayın.
   1. Kateter tanıtıcı olarak kullanmak için 24 G'lik bir iğnenin ucunu ~ 100 ° 'lik bir açıyla bükün.
   2. Kaudal oklüzyon sütürünü yavaşça çekin ve kan akışını geçici olarak durdurmak ve arteri hafifçe kaldırmak için gerginlikle sabitleyin.
   3. Kraniyal oklüzyon sütürüne proksimal artere bükülmüş iğne ile dikkatlice nüfuz ettirilir (Şekil 2J). Kateteri damar kanülasyon forsepsleri ile tutun, küçük delinmeye sokun ve yavaşça damarın içine kaymasına izin verin. Bükülmüş iğneyi aynı anda yavaşça geri çekin (Şekil 2K).
   4. Kateter kaudal oklüzyon sütürüne ulaştığında, kateteri yerinde tutmak için güvenli sütürü hafifçe sıkın (Şekil 2L).
   5. Kaudal oklüzyon sütürünü gevşetin, böylece kateter ucu aort arkına yerleştirilene kadar daha fazla hareket ettirilebilir.
      NOT: Kateterin doğru yerleştirme uzunluğunu belirlediğinizden emin olun, çünkü bu farenin boyutuna bağlıdır. 12 haftalıkken ve ~ 30 g vücut ağırlığında C57BL / 6J arka planı olan erkek fareler için, entegre çentik kraniyal oklüzyon sütürüne ulaşana kadar kateterin takılmasını öneririz. Kateterin belirli fare çizgisi için doğru yerleştirme derinliği ve yerleştirilmesi, hayvanın ötenazisinden sonra doğrulanabilir.
   6. Düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, kateteri üç dikişle de sabitleyin ve uçları mümkün olduğunca kısa kesin. Düğümleri çok sıkı çekmeyin, çünkü bu kırılgan kan basıncı kateterine zarar verebilir.

Şekil 2: Kombine EKG ve kan basıncı transmitterinin implantasyonu - sol karotis arterin kanülasyonu . (A) Telemetri vericisi bir basınç kateteri, iki biyopotansiyel elektrot ve cihaz gövdesinden oluşur. (B) Basınç kateterinin şematik gösterimi. Sensör alanı sıkıştırılamayan bir sıvı ve biyouyumlu bir jelden oluşur. Kateter, kan damarında uygun pozisyonu sağlamak için çentik kraniyal oklüzyon sütürü seviyesine gelene kadar karotis artere yerleştirilmelidir. (C) Cerrahi verici implantasyonu için hazırlanmış anestezili C57BL/6J fare. (D-L) Sol karotis arterin kanülasyonu için cerrahi prosedürü gösteren görüntü dizisi. (D) Servikal deri insizyonu. (E) Trakeaya lateral olarak yerleştirilmiş sol karotis arteri tanımlamak için maruz kalan trakea. (F) Arteri komşu dokudan ve vagus sinirinden izole etmek için künt diseksiyon. (G) Sol karotis arterin kraniyal oklüzyon sütürü ile kalıcı olarak bağlanması. (H) Kan akışını geçici olarak durdurmak için kaudal oklüzyon sütürüne uygulanan gerginlik. (I) Kanülasyon sırasında kateteri yerinde tutmak için güvenli dikiş. (J) Kateterin kan damarına yerleştirilmesi için kavisli uçlu kanül. (K) Karotis artere basınç kateteri yerleştirilir. (L) Kateter ucu aort arkına yerleştirilir ve kateter orta dikiş ile sabitlenir. D - L arasındaki ölçek çubuğu 4 mm'yi gösterir.^16'dan yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Telemetri aygıtı gövdesinin farenin sol kanadındaki deri altı cebine yerleştirilmesi (Şekil 3).
   1. Boyundan hayvanın sol kanadına doğru yönlendirilmiş deri altı bir tünel oluşturun ve küçük, künt diseksiyon makası kullanarak küçük bir kese oluşturun (Şekil 3B).
   2. Tüneli ılık, steril% 0.9 NaCl çözeltisi ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırınga ile sulayın ve çözeltinin ~ 300 μL'sini torbaya verin (Şekil 3C).
   3. Cildi künt forseps ile dikkatlice kaldırın ve verici cihaz gövdesini keseye yerleştirin (Şekil 3D). Bu adım sırasında, kan basıncı kateterini karotis arterden çıkarmamaya çok dikkat edin.
4. EKG derivasyonlarının Einthoven II konfigürasyonuna yerleştirilmesi.
   1. Künt diseksiyon makası ile sağ pektoral kaslara ince bir tünel oluşturun ve negatif (renksiz) kurşunu künt forseps kullanarak tünele yerleştirin. Kurşunun terminal ucunu 6-0 emilebilir sütür materyali kullanarak pektoral kaslara bir dikişle sabitleyin (Şekil 3E).
   2. Pozitif (kırmızı) uçta bir halka oluşturun, ucunu sol kaudal kaburga bölgesine yerleştirin ve 6-0 emilebilir dikiş malzemesi kullanarak bir dikişle pozisyonunu sabitleyin.
      NOT: Doku tahrişini önlemek için her iki ucun da tüm uzunlukları boyunca vücuda karşı düz durması önemlidir (Şekil 3F).
   3. 5-0 emilemeyen dikiş materyali kullanarak cildi tek düğümlerle kapatın (Şekil 3H). Ek olarak, hayvanın dikişi ısırmasını önlemek ve ayrışmayı önlemek için her düğüme az miktarda doku yapıştırıcısı uygulayın.
   4. İyileşme aşamasında yara enfeksiyonunu önlemek için yaraya povidon-iyot hidrojeli% 10 uygulayın.
   5. Önleyici ağrı kesici için, fare hala anestezi altındayken deri altından% 0.9 NaCl içine 5 mg / kg karprofen enjekte edin.
   6. Bir ısıtma platformunu 39 ± 1 °C'ye ayarlayın ve fareyi ayrı bir muhafaza kafesine yerleştirin. Kafesin yarısını ameliyattan sonra 12 saat boyunca platforma yerleştirin ve fareyi sıcak alana aktarın. Hayvan anesteziden uyandığında, sıcak alanda kalma veya kafesin daha serin kısmına geçme seçeneğine sahiptir.

Şekil 3: Kombine EKG ve kan basıncı transmitterinin implantasyonu - EKG elektrotlarının ve cihaz gövdesinin deri altına yerleştirilmesi . (A) Kan basıncı kateterinin yerleştirilmesinden sonra fare. Kateter pozisyonu oklüzyon dikişleri ile sabitlenir. (B) Hayvanın sol kanadında künt makasla deri altı cebi oluşturmak. (C) Poşet, ~ 300 μL ılık steril salin ile sulanır. (D) Cihaz gövdesi deri altı cebine yerleştirilir. (E) Negatif elektrotun terminal ucu (renksiz), emilebilir dikiş materyali ile sağ pektoral kaslara sabitlenir. (F) Pozitif elektrotun (kırmızı) sol interkostal kaslara sabitlenmesi. (G) EKG elektrotlarının pozisyonunu sabitlemek için göğüs kasına kalıcı bir dikiş yerleştirilmesi. (H) Cilt kapatıldıktan sonra fare. EKG elektrot uçlarının deri altı pozisyonları kırmızı dairelerle gösterilir. Gösteri amacıyla, bu görüntüleri çekmek için ölü bir hayvan kullanıldı. Lütfen canlı hayvan kullanırken steril uygulamaları takip edin. ^16'dan yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Ameliyat sonrası bakım
   1. Postoperatif ağrı kesici için, yara iyileşene kadar 3-5 gün boyunca her 12 saatte bir% 0.9 NaCl deri altından 5 mg / kg karprofen enjekte edin.
   2. Hayvanı dehidrasyondan korumak için intraperitoneal olarak 10 μL / g sıcak ringer-laktat çözeltisi enjekte edin.
   3. İlk telemetrik ölçümleri çalıştırmadan önce farenin 2-3 hafta boyunca iyileşmesine izin verin. İyileşme döneminde genel sağlık durumlarını, yara iyileşmesini, vücut ağırlığını ve yiyecek ve su alımını dikkatlice izleyin.
   4. Deneyin sonunda, fareyi karbondioksit (CO₂) inhalasyonu ile ötenazi yapın.
      NOT: Servikal çıkık veya kafa kesme, EKG ve BP verici cihazının parçalarına zarar verebileceğinden ötenazi yöntemi olarak önerilmez.
6. Veri toplama.
   1. Veri kaydı sırasında akustik ve elektronik gürültüyü önlemek için önlemler alın. Ek olarak, veri kaydı sırasında personelin erişimini sınırlandırın ve deneyden önce tüm hayvancılık prosedürlerini tamamlayın.
   2. Hayvanın kafesini telemetri alıcı plakasına yerleştirin ve bir mıknatısı hayvana yaklaştırarak telemetrik vericiyi açın.
   3. Veri toplama yazılımı ile 72 saat (12 saatlik karanlık/ışık döngüsü) boyunca sürekli EKG, kan basıncı ve aktivite kayıtları elde edin (Şekil 4).
7. Kalp atış hızı, kan basıncı ve aktivitenin sirkadiyen ritminin analizi.
   1. Veri toplama yazılımı^12'yi kullanarak düzenli bir İK, BP ve aktivite sirkadiyen ritminin varlığını kontrol edin (Şekil 5).
8. EKG ve BP analiz yazılımları ile sekans yöntemi kullanılarak baroreseptör duyarlılığının belirlenmesini içeren veri analizi.
   1. BP ve İK verilerini veri toplama yazılımından EKG ve BP analiz yazılımına aktarın (Ek Dosya 2). Aşağıdaki komut sırasını kullanın: Açık EKG ve BP analiz yazılımı > Dosya > Dönüştürücüden ham veriler > IOX olmayan ham verileri dönüştürün. Yeni pencerede Dosya > Dataquest ART4 verilerini yükle'ye tıklayın. Yine, yeni bir pencere açılacak, dışa aktarılacak veri dosyasını seçin > Yeni pencere açılır, "konular" listesinden hayvanı seçin ve "dalga formları listesi" nden EKG ve BP'yi seçin ve Tamam'a basın. IOX ikili site dosyası oluştur > Verileri dönüştür'ü tıklatarak verilerin dönüştürüleceği hayvanları seçin.
   2. IOX ikili site dosyasını EKG ve BP analiz yazılımında aşağıdaki komut sırasını kullanarak açın: Dosya > IOX verilerini yükleyin > BP ve EKG izleme'yi seçin > yeşil onay işaretine basın.
      NOT: Aşağıdaki veri işleme parametreleri, vahşi tip farelerden elde edilen veriler için optimize edilmiştir ve prensip olarak klinik öncesi alanda kullanılan tüm fare modellerine uymalıdır. Bununla birlikte, belirli deneysel modellerle, örneğin aşırı yüksek veya düşük HR ve / veya BP değerlerine sahip fareler veya farklı kemirgen türleri ile çalışırken bu parametrelerin uyarlanması gerekli olabilir. Her durumda, incelenen belirli modele uyduklarından emin olmak için veri işleme parametrelerinin dikkatlice gözden geçirilmesi gerekir.
   3. EKG, BP ve BRS analizi ayarları için Ek Dosya 3,4'e bakınız. Farelerde BRS analizi için, BRS parametrelerini yalnızca bir atımın SBP ve RR arasında gecikme gösteren üç (veya daha fazla) atım dizisini algılayacak şekilde ayarlayın ve SBP ve RR değişimi eşiğini 0,5 mmHg ve 2 ms olarak ayarlayın. RR / SBP grafiklerinden regresyon çizgisinin eğiminin korelasyon katsayısının 0.75'ten büyük olduğundan emin olun ve sadece kararlı sinüs ritmi sergileyen bölümleri analiz edin. Aşağıdaki komut sırasını kullanarak EKG, BP ve BRS analizi parametrelerini uygun şekilde ayarlayın: Yeni pencere açılana > > analizi ayarlarını yapma
      1. EKG ayarları ("EKG modu ve sinyal filtreleme" penceresine sağ tıklayın (Ek Dosya 3)). Parametreleri burada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarlayın. Mod: EKG, yalnızca RR, Filtre modu: otomatik, ayarlanan İK'ya göre, Beklenen kalp atış hızı: bpm > 300, Temel kaldırma filtresi genişliği (ms): 100,00, Gürültü giderme filtresi genişliği: 1,00 ms, Çentik filtresi: 50,0 Hz, Ani artış giderme filtresi: kapalı, Bırakma algılama modu: kapalı, Maksimum RR uzunlukları (ms): 900,00, ayarlanan R tepe noktalarından RR: kapalı, RR_only ayarları modu: Xsmall: fare, R tepe genişliği (ms): 10.00, PR genişliği (ms): 20.00, RT genişliği (ms): 50.00, Maksimum vuruşlar arası artefakt (%): 50.00, R'den diğer genliğe oranı: 3.00, R tepe işareti: pozitif ve İşlem ekstra parametresi: kapalı
      2. Kan basıncı ayarları için (BP, Basınç ayarları) "BP analizörü" penceresine sağ tıklayın (Ek Dosya 4). Parametreleri burada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarlayın. Gürültü giderme filtresi genişliği (ms): 10,00, Türev filtre genişliği (ms): 6,00, Çentik filtresi: 50,0 Hz, Başak giderme filtresi: kapalı, Doğrulama eşiği (cal. birimi): 12,00, Reddetme eşiği (cal. birimi): 8,00, Başlangıç yukarı vuruşunda türev (cal U/s): 10,00, Ret limitleri: kapalı, Referans ekg'den gecikme: kullanıcı tanımlı pencere, EKG'den minimum gecikme Rpeak (ms): 10.00, EKG'den maksimum gecikme Rpeak (ms): 250,00, işaretten Conduct_time_1: hesaplanmadı, işaretten Conduct_time_2: hesaplanmadı, BR (solunum hızı): kapalı, BRS (Barorefleks duyarlılığı): açık, Minimum ardışık vuruş sayısı: 3, Gecikme atım sayısı: 1, Basınç değeri: SBP, Darbe aralığını hesaplamak için işaretle: R, Minimum basınç değişimi (caIU): 0,50, Minimum aralık değişimi (ms): 2,00, Minimum korelasyon: 0,75
   4. Etkinlik sinyalini düşük etkinliğe sahip 3 saatlik bir dizi için tarayın. BRS analizini bu zaman penceresinde gerçekleştirin, çünkü hayvanların yüksek aktivitesi BP ve RR korelasyonuna müdahale eder.
   5. Bu 3 saatlik zaman penceresinde bir BP ve RR analizi gerçekleştirin ve 3 saatlik analizi 10 dakikalık adımlara bölün.
   6. Aşağıdaki komut sırasını kullanarak BRS çözümlemesi gerçekleştirin: BRS çözümlemesi penceresini aç > > BRS çözümlemesini görüntüle. Bu, BRS analiz panelini açar. BRS analiz panelinde görüntülenen her sırayı manuel olarak inceleyin ve ektopik atımları, sinüs duraklamalarını, aritmik olayları veya gürültülü verileri hariç tutun. Bu tür dizilerin her bir vuruşunu geçersiz kılarak analizden başarıyla hariç tuttuğunuzdan emin olun.
   7. BRS analizinin sonuçlarını bir elektronik tablo dosyasına (Sonuç Dosyası) aktarın. Elektronik tablo dosyasına verilen parametreleri aşağıdaki komut sırasını kullanarak değiştirin (Ek Dosyalar 5-7):
      1. txt (Ek Dosya 5) > liste/dosya > bölümündeki parametreler > ayarlayın. "Atımlar" bölümünü ve geçersiz vuruşlar bölümü dışında ilgilendiğiniz bilgileri içeren diğer bölümleri seçin.
      2. txt (Ek Dosya 6) > > listedeki/dosyadaki > parametreleri ayarlayın. Dışa aktarılacak adım değerlerini seçin.
      3. >Listedeki/dosyadaki parametreleri ayarlayın > beats -> txt (Ek Dosya 7).
      4. Dosyanın vuruşlar bölümünün her vuruş için en azından aşağıdaki verileri içerdiğinden emin olun. ECG_RR, ECG_HR, BP_SBP, BP_BRS_deltaP, BP_BRS_# (=dizinin ardışık vuruş aralıkları), BP_BRS_slope, BP_BRS_correl, BP_BRS_shiftl (=sonraki vuruşun RR'si)
      5. Ardından Dosya > Sonuç dosyasını kaydet'i tıklatın.
   8. Excel'in filtre işlevini kullanarak dışa aktarılan verileri yukarı ve aşağı diziler için sıralayın (Ek Dosya 8). Yukarı ve aşağı diziler için dizi sayısını, ortalama BRS eğimini, standart sapmayı ve BRS eğiminin standart hatasını ayrı ayrı hesaplayın. Ayrıca 1000 atım başına toplam dizi miktarını hesaplayın.
      NOT: Yukarı ve aşağı dizilerin otomatik olarak sıralanması ve analizi için bir elektronik tablo şablonu (TemplateBRS) Ek'te (Ek Dosya 8) sağlanmıştır ve analizi kolaylaştırır. Filtre işlevini ayarlayarak, dizileri farklı vuruş numaralarına göre sıralayabilirsiniz (örneğin, üç veya dört vuruşlu diziler). Daha fazla ayrıntı için Ek dosyalar 9-13'e bakın.
      1. Sonuç dosyasını ve TemplateBRS Excel dosyasını (Ek Dosya 8) açın. Aşağıdaki sütunların verilerini Sonuç Dosyasından kopyalayın: (Basınç)_BRS_deltaP, (Basınç)_BRS_# ve (Basınç)_BRS_slope (Ek Dosya 9). Verileri TemplateBRS dosyasındaki "Yukarı diziler" ve "Aşağı diziler" elektronik tablolarının ilgili sütunlarına yapıştırın (Ek Dosya 10). Ayrıca, sütunun verilerini (Basınç) _BRS_SBP Sonuç Dosyasından (Ek Dosya 11) kopyalayın ve TemplateBRS dosyasındaki (Ek Dosya 12) "Tüm diziler" elektronik tablosuna yapıştırın.
         NOT: (Basınç)_BRS_# sütunundaki sayı yalnızca dizinin son vuruşunda listelenir ve dizi uzunluğunu gösterir. Yukarı ve aşağı diziler, (Basınç)_deltaP değerinin işareti ile ayırt edilebilir. Üç vuruşlu bir dizinin ikinci ve üçüncü vuruşu için negatif değerler bir aşağı sırayı gösterir. Pozitif değerler sırasıyla bir yukarı sırayı gösterir.
      2. Kopyalanan verileri varsayılan filtre ayarlarıyla filtreleyin. (Basınç)_BRS_# sütununun filtre simgesine tıklayın ve "Tamam" a basın (Ek Dosya 13). Bu adımı "Yukarı diziler" ve "Aşağı diziler" e-tablolarına uygulayın.
         NOT: Elektronik tablo, üç vuruşlu diziler için filtre uygular. Diğer sıra uzunlukları istenirse, açılır menüde bu sütunun ayarının değiştirilmesi gerekir. Dizi sayısı, ortalama BRS eğimi, standart sapma ve BRS eğiminin standart hatası hesaplamaları "Yukarı diziler" ve "Aşağı diziler" tablolarının yeşil kutularında görüntülenir. 1000 vuruş başına toplam dizi sayısına ilişkin hesaplamalar, "Tüm diziler" e-tablosunun yeşil kutusunda görünür.

Sonuçlar

EKG ve BP ham verileri için olumlu sonuçlar
Bu protokolü kullanarak yüksek kaliteli EKG ve BP verileri elde edilebilir (Şekil 4 ve Ek Dosya 14), sadece hassas BRS analizi için değil, aynı zamanda EKG aralıkları (Şekil 4B, üst panel), kan basıncı parametreleri (Şekil 4B, alt panel), kalp atış hızı ve kan basıncı değişkenliği gibi çok çeşitli EKG veya BP kaynaklı parametrelerin analizine de olanak tanır. aritmi tespiti vb.^12,13,14,15.

Şekil 4: Telemetrik EKG ve BP kayıtları. (A) Temsilci, yüksek kaliteli EKG izleme (üst panel) ve buna karşılık gelen yüksek kaliteli ham BP kayıtları (alt panel). (B) EKG izlerinin büyütülmesi (üst panel). P dalgası, QRS kompleksi, T dalgası ve RR aralığı belirtilir. İlgili BP verilerinin büyütülmesi (alt panel). Diyastolik BP (DBP) ve sistolik BP (SBP) endikedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sirkadiyen ritim için olumlu sonuçlar
Ameliyattan yeterince iyileşmiş sağlıklı bir fare, aktivite (karanlık) fazı sırasında aktivite, HR ve BP'de fizyolojik bir artış gösterir (Şekil 5). Birçok farklı faktör bu düzenli sirkadiyen ritmi bozabilir. Bunlar psikolojik stres, akustik veya elektrik gürültüsü ve ağrıyı içerir. Örneğin, ameliyattan hemen sonra akut bir ağrı durumu, aktivitede eşzamanlı bir azalma ile kalp atış hızında bir artışa neden olur. Bu nedenle, sirkadiyen ritim hayvan sağlığı ve refahı için önemli bir göstergedir ve BRS analizinden önce rutin olarak kontrol edilmelidir.

Şekil 5: Sirkadiyen ritim varyasyonlarını belirlemek için uzun süreli telemetri ölçümlerinin analizi. Kalp atış hızı (A), aktivite (B), sistolik kan basıncı (C) ve diyastolik kan basıncının (D) sirkadiyen ritmi, 12 saatlik ışık ve karanlık döngüleri sırasında 9 erkek vahşi tip C57BL / 6J fareden ortalama olarak alınmıştır. Gri alanlar aktivite (karanlık) fazını ve beyaz alanlar hayvanların dinlenme (ışık) fazını gösterir. Tüm parametreler, hayvanın aktivitesi (karanlık) fazı sırasında fizyolojik olarak yükselir. Veriler ortalama +/- SEM olarak temsil edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

BRS analizi için olumlu sonuçlar
Protokol bölüm 2.8'de açıklandığı gibi analizi gerçekleştirdikten sonra, yazılım sırasıyla yukarı ve aşağı dizileri algılar. SBP ve RR aralıklarındaki değişiklikler, SBP'de kendiliğinden yükseliş veya düşüş ile üç veya daha fazla atımın kısa dizileri sırasında atımdan atıma esasına göre incelendiğinden kullanılan yönteme dizi yöntemi denir (Şekil 6). SBP'de üç kalp atışı üzerinde sürekli bir yükselme, parasempatik aktivitede refleks artışına neden olur ve sonuç olarak daha uzun RR aralıklarına eşdeğer olan İK'yı yavaşlatır. Refleks İK uyarlamasının gecikmesi tek vuruştur. Böyle bir dizi Şekil 6A'da gösterilmiştir ve yukarı dizi olarak tanımlanmıştır. Buna karşılık, HR'de paralel artış (RR aralığında azalma) ile üç atım boyunca SBP'de sürekli bir azalma, bir aşağı dizi olarak tanımlanır (Şekil 6B). RR ve SBP arasındaki korelasyonu değerlendirmek için, her iki parametre birbirine karşı çizilir ve her dizi için doğrusal regresyon çizgisinin eğimi (ms/mmHg) hesaplanır (Şekil 6A,B, alt paneller). Yukarı ve aşağı dizilere göre sıralamadan sonra, sırasıyla yukarı ve aşağı diziler için 1000 atım başına ortalama dizi sayısı (Şekil 6C) ve spontan BRS'nin ortalama kazancı hesaplanabilir (Şekil 6D, E). Spontan BRS'nin kazancı, RR / SBP ilişkisinden hesaplanan doğrusal regresyon çizgisinin eğimi ile yansıtılır. Normal BRS değerlerinden sapmanın çeşitli nedenleri olabilir. Bunlar, ANS girişindeki değişiklikleri veya sinoatriyal düğümün otonom sinir sistemi girişine yanıtındaki değişiklikleri içerir. Şekil 6'da hasta sinüs sendromu (SSS) için fare modelinde artmış BRS, sinoatriyal düğümün vagal girişe abartılı yanıtı ile^{gösterilmiştir 11}.

Şekil 6: Dizi yöntemi kullanılarak BRS'nin tahmini. (A) Vahşi tip bir C57BL/6J farenin, HR'deki azalmaya eşdeğer olan RR aralığındaki (orta panel) paralel bir artışla ilişkili üç ardışık atımdan (üst panel) oluşan bir yukarı dizi sırasında temsili BP izi. RR aralıkları SBP'ye (alt panel) karşı çizildi. Üst ve orta panelde (WT, siyah daireler) gösterilen yukarı sekans için regresyon çizgisinin (kırmızı çizgi) eğimi 4.10 ms/mmHg idi. Hasta sinüs sendromu fare modelinin temsili bir RR / SBP ilişkisi, yüksek BRS'yi (SSS, gri daireler) gösteren 6.49 ms / mmHg'lik artmış bir eğim vermiştir. (B) SBP'de (üst panel) bir düşüş ve ardından RR aralığında (orta panel) bir azalma ile 4,51 ms/mmHg'lik bir BRS eğimi ile sonuçlanan vahşi tip bir farenin temsili aşağı sırası (alt panel; WT, siyah daireler). Hasta sinüs sendromu fare modelinin (SSS, gri daireler) 7.10 ms/mmHg eğimli temsili bir RR/SBP ilişkisi. Kırmızı ok uçlarının yönü, dizilerin yönünü gösterir (yukarı veya aşağı sıra). (C) WT ve SSS fareleri için 1000 atım başına toplam dizi miktarı. (D) WT ve SSS fareleri için yukarı diziler için RR/SBP ilişkisinin ortalama eğimi. (E) WT ve SSS fareleri için aşağı diziler için RR/SBP ilişkisinin ortalama eğimi. (C-E) içindeki istatistikler, hasta sinüs sendromu fare modelinin altı erkek WT hayvanının ve sekiz erkek hayvanın sonuçlarından gerçekleştirildi. Kutu grafikleri medyan çizgisini, perc 25/75'i ve min/max değerini gösterir; Açık semboller ortalama değeri temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ham veri kalitesi için olumsuz sonuç
Özellikle aktivitenin yüksek olduğu aşamalarda sinyal kalitesi düşebilir (Şekil 7 ve Ek Dosyalar 15,16). Bu, BP kateterinin veya EKG derivasyonlarının veya her ikisinin de hayvanın hareketi nedeniyle geçici olarak yer değiştirmesinden veya yanlış konumlandırılmasından kaynaklanabilir. Ayrıca, iskelet kası aktivitesi EKG derivasyonlarından saptanabilir ve gürültüye neden olabilir (Şekil 7B, üst panel). Yukarıda açıklanan yazılım ayarlarıyla, bu düşük kaliteli atımlar algılanmaz ve bu nedenle analizin dışında tutulur. Bununla birlikte, analiz edilen ham verilerin manuel olarak incelenmesi zorunludur.

Şekil 7: Düşük kaliteli ham sinyal örnekleri . (A) EKG sinyali (üst panel) iyi kalitede algılanır, ancak BP sinyali (alt panel) kalitesi düşüktür. (B) EKG (üst panel) ve BP (alt panel) sinyalinin nitelikleri yeterli değildir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

BRS analizi için olumsuz sonuçlar
Protokol bölüm 2.8.3'te listelenen BRS analiz ayarları, yukarı ve aşağı dizilerin hızlı ve doğru bir şekilde algılanması için genel olarak gereklidir. Regresyon çizgisi için minimum korelasyon katsayısı 0,75 olarak ayarlanır. Minimum korelasyon katsayısı için çok düşük değerler ayarlamak, barorefleks aktivitesini yansıtmayan, aksine aritmik atımlardan kaynaklanan dizilerin yanlış algılanmasına neden olur (Şekil 8). BRS analizi için sadece stabil sinüs ritmine sahip bölümler analiz edilmelidir. Ektopik atımlar veya diğer aritmik olaylar, örneğin sinüs duraklamaları, EKG ve BP analiz yazılımının HRV seçeneği ile bulunabilir ve geçersiz kılınmalıdır.

Şekil 8: Baroreflex aktivitesini yansıtmayan diziler . (A) Hafif sinüs disritmisi olan bir farenin EKG izi. (B) SBP'de kendiliğinden bir artışı gösteren BP kaydı. (C) İlgili RR aralıkları, BP'nin artması üzerine İK'nın azaldığını gösterir. (D) SBP'nin grafiği ve karşılık gelen RR aralıkları. Regresyon çizgisinin düşük korelasyon katsayısı, HR azalmasının barorefleks aktivitesinden değil, sinüs disritmisinden kaynaklandığını göstermektedir. (E) Sinüs duraklamasını gösteren ham EKG izi. (F) İlgili ham BP sinyali. Sinüs duraklaması diyastolik kan basıncında bir düşüşe neden olur. Sonraki atımın sistolik kan basıncı neredeyse hiç etkilenmez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Cerrahi protokol. Cerrahi prosedürün ve ameliyat sonrası bakımın dokümantasyonu için şablon. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Dataquest A.R.T verilerini ecgAUTO yazılımında analiz için IOX verilerine dönüştürme. Denekler listesinden (solda) hayvanları ve dalga formları listesinde Basınç ve EKG'yi (sağda) seçin. Verileri dönüştürmek için Tamam'a basın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: BRS analizi için EKG ayarları. Parametreleri listelendiği gibi ayarlayın, Tamam'a basın ve yapılandırmayı uygulayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: BRS analizi için BP ayarları. Parametreleri listelendiği gibi ayarlayın, Tamam'a basın ve yapılandırmayı uygulayın. Ayarları kolayca yükleyebilmek için yapılandırmayı bir yapılandırma dosyası olarak kaydedin. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5: "Bölümler" için liste/dosya penceresindeki parametreler. > txt başlığı (seçili) bölümleri altında dışa aktarılacak bölümleri seçin ve Uygula!'ya basın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek dosya 6: "Adımlar" için listedeki/dosyaya penceredeki parametreler. txt üstbilgisi (seçili) > adımların altında dışa aktarılacak adım verilerini seçin ve Uygula!'ya basın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 7: "Vuruşlar" için listedeki/dosya penceresindeki parametreler. Beats > txt üstbilgisinin (seçili) altında dışa aktarılacak değerleri seçin ve Uygula!'ya basın. BRS analizi için işaretlenmiş parametreler gereklidir. Sayılarla gösterilen seçim sırasına dikkat edin. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 8: TemplateBRS elektronik tablo dosyası. Yukarı ve aşağı dizilerin otomatik olarak sıralanması ve analizi için elektronik tablo şablonu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 9: Sonuç Dosyası I'den ilgili verileri kopyalama. Sonuç Dosyasından (Basınç)_BRS_deltaP, (Basınç)_BRS_# ve (Basınç)_BRS_slope sütunlarını kopyalayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 10: Veri sıralama ve çözümleme için elektronik tablo şablon dosyası (TemplateBRS) I. Kopyalanan verileri TemplateBRS elektronik tablo dosyasındaki "Yukarı diziler" ve "Aşağı diziler" elektronik tablosunun ilgili sütunlarına yapıştırın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 11: Sonuç Dosyası II'den ilgili verilerin kopyalanması. Sonuç Dosyasından (Basınç) _BRS_SBP sütununu kopyalayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 12: Veri sıralama ve çözümleme için bir elektronik tablo şablon dosyası (TemplateBRS) II. Toplam dizi sayısını hesaplamak için kopyalanan SBP verilerini TemplateBRS elektronik tablo dosyasındaki "Tüm diziler" elektronik tablosuna yapıştırın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 13: Dizileri filtreleme ve analiz etme. TemplateBRS elektronik tablo dosyasının "Yukarı sıralar" elektronik tablosunda, (Basınç)_BRS_# sütun filtresinin açılır menüsünü açın ve hiçbir parametreyi değiştirmeden Tamam'a basın. Bu, verileri otomatik olarak sıralar ve 3 vuruşlu diziler için hesaplamaları günceller. "Aşağı diziler" e-tablosu için bunu tekrarlayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 14: EKG ve BP analiz yazılımı ile tespit edilen yüksek kaliteli bir kaydın ekran görüntüsü. Üst iz (EKG) her R-pikinin tespitini gösterir ve alt iz (BP) her diyastolik basıncın (DP) ve sistolik basıncın (SP) pikinin tespitini gösterir. Başarıyla algılanan zirvelerin altındaki alanlar kırmızı renkle işaretlenir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 15: BP parametrelerinin yalnızca kısmen algılandığı düşük kaliteli bir BP kaydının ekran görüntüsü. Üst iz (EKG) her bir R-pikinin tespitini gösterirken, alt iz (BP) tespit edilen BP pikleri arasındaki boşlukları gösterir. Tespit edilen diyastolik basınç (DP) ve sistolik basınç (SP) pikleri kırmızı alanlarla işaretlenir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 16: EKG ve BP parametrelerinin tespit edilemediği düşük kaliteli EKG ve BP kaydının ekran görüntüsü. Üst iz (EKG), EKG parametrelerinin tespit edilemediği bir bölgeyi (mor arka plan) gösterir. BP tespiti (düşük iz) de düşük sinyal kalitesi nedeniyle başarısız oldu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Yöntemin alternatif yöntemler açısından önemi
Bu çalışmada, sekans yöntemini kullanarak spontan BRS'yi ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımda EKG ve BP telemetrisi ile ölçülen spontan BP ve refleks HR değişiklikleri kullanılır. Bu yöntemin avantajı, her iki parametrenin de bilinçli, serbestçe hareket eden, kısıtlanmamış hayvanlarda, ölçümlerin yapıldığı odaya girerek veya hatta ilaç enjeksiyonu için gerekli fiziksel etkileşimle hayvanları rahatsız etmeden kaydedilebilmesidir. Bu nokta çok önemlidir, çünkü bu tür rahatsızlıkların İK ve BP kayıtlarına ciddi şekilde müdahale ettiği açıkça gösterilmiştir. Örneğin, ilaçların enjeksiyonu, farelerin sabitlenmesini gerektirir, bu da HR'yi 650-700 bpm'ye kadar artıran maksimum stres tepkisine neden olur. Bu stres tepkilerini atlatmak için, BRS daha önce anestezi uygulanan farelerde belirlenmiştir. Bununla birlikte, veteriner hekimlikte kullanılan ketamin/ksilazin veya izofluran gibi standart anestezikler bradikardiye neden olmakta ve otonom refleks yanıtlarını etkileyerek bu yaklaşımların geçerliliğini ve sonuçların yorumlanmasını sınırlamaktadır. Bu sınırlamaların kısmen üstesinden gelmek için, implante edilebilir ilaç dağıtım cihazları, yani ilaçları periton boşluğuna bırakabilen ozmotik pompalar kullanılmıştır. Bununla birlikte, ozmotik pompalarla, bu tür cihazların uygulanmasını sınırlayan tanımlanmış bir ilaç dozunun bolusunu uygulamak mümkün değildir. Alternatif olarak, karmaşık infüzyon kateterleri¹⁷ İlaçları uygulamak için farelere implante edilebilir. Bununla birlikte, bu kateterlerin kullanımı zordur ve spontan BRS ölçümlerine kıyasla daha az bilimsel sonuç üretirken, telemetrik cihazların implantasyonu için gerekli olanlarla karşılaştırılabilir cerrahi beceriler gerektirir. İlaç enjeksiyonu kullanılarak BRS'nin ölçülmesiyle ilgili teknik sorunların yanı sıra, kendi başına ilaç etkisiyle ilgili bazı sınırlamalar vardır. BRS'yi belirlemek için geleneksel yaklaşımlar, vazoaktif ilaçların bolus enjeksiyonlarını içerir. Bununla birlikte, vazokonstriktörlerin (örneğin, fenilefrin) veya vazodilatörlerin (örneğin, sodyum nitroprussid) bolus enjeksiyonu, BP'deki değişikliklere refleks HR adaptasyonu için aşırı ve fizyolojik olmayan bir uyaran olarak kabul edilmiştir¹⁸. Baroreseptör refleksinin spontan aktivitesi spektral yöntemler kullanılarak da ölçülebilir. Bu yöntemlerden biri, belirli bir frekans bandında İK'daki değişiklikler ile kan basıncındaki değişiklikler arasındaki oranı hesaplayarak frekans alanındaki BRS'yi değerlendirir^18,19. Diğer spektral yöntemler, BP ve HR'nin transfer fonksiyonunun belirlenmesini veya BP ile HR arasındaki tutarlılığın ölçülmesini içerir^20,21. Bu yöntemler aynı zamanda spontan BP ve HR parametrelerinin telemetrik olarak edinilmesini gerektirir ve spontan BRS'nin belirlenmesi için uygun olsalar da, yoğun hesaplama araçları gerektirir ve uygulanması zordur. Ayrıca, tüm spektral yöntemler, durağan olmayan sinyallerin spektral yöntemlerin uygulanmasını engellediği sınırlamasından muzdariptir. Özellikle, solunum ritimlerinin neden olduğu spektral zirveler, hastadan nefes almayı bırakmasını isteyerek insan hastalarda azaltılabilirken, bu farelerde açıkça mümkün değildir. Bu nedenle, sinyal-gürültü oranı farelerde genellikle oldukça düşüktür. Yukarıda tartışılan yöntemlerin sınırlamaları göz önüne alındığında, farelerde BRS'yi belirlemek için dizi yöntemini tercih ediyoruz. Bu yöntemin önemli bir avantajı, gerçek yaşam koşulları altında spontan BRS hakkında veri sağlayan noninvaziv bir teknik olmasıdır²². Bir diğer önemli nokta, dizi yöntemi kullanılarak analiz edilen sekansların süresinin 3-5 atım içeren oldukça kısa olmasıdır. İK'nın vagal sinir tarafından refleks regülasyonu, bu sekansların zaman dilimi içinde çok hızlı ve iyidir. Bu nedenle, sekans yöntemi, vagal sinirin BRS'ye katkısını değerlendirmek için çok uygundur. Buna karşılık, sempatik sinir sistemi tarafından düzenleme çok daha yavaştır. Aslında, bu kısa sekanslar sırasında sempatik sinir sisteminin aktivitesinin neredeyse sabit olduğu varsayılabilir. Bu nedenle, yöntem vagus sinir aktivitesi tarafından yönlendirilen İK'nın refleks değişikliklerini seçici olarak tespit etmek için özelleştirilmiştir.

BRS verilerinin yorumlanması
BRS disfonksiyonunun veya BRS verilerinin kendi başına yorumlanması için, baroreseptör refleksinde yer alan bireysel fonksiyonel seviyelerin dikkate alınması önemlidir. Nöronal düzeyde, refleksin afferent, santral veya efferent bileşenleri etkilenebilir²³. Kardiyovasküler düzeyde, sinoatriyal düğümün ANS girişine azalmış veya abartılı yanıtı^11,24 olabilir. Her seviyedeki bir değişiklik, BRS'de değişikliklere yol açabilir. BRS'de gözlenen değişikliklerden nöronal ve/veya kardiyak mekanizmaların sorumlu olup olmadığını incelemek için, kardiyak veya nörona özgü gen delesyonu, knock down veya gen düzenleme yaklaşımları kullanılabilir.

Protokoldeki kritik adımlar
Bu protokoldeki en sofistike ve kritik adım, sol karotis arterin hazırlanması ve kanülasyonudur (Adım 2.3). Kaudal oklüzyon sütürünün gerginliği, kanülasyondan önce kan akışını tamamen durduracak kadar yüksek olmalıdır. Aksi takdirde, kanülasyon sırasında küçük bir kan sızıntısı bile görünürlüğü ciddi şekilde kısıtlayabilir veya hatta farenin ölümüne kanamasına neden olabilir. Kanülasyon ilk denemede başarılı olmalıdır. Bununla birlikte, ilk denemenin başarısız olması üzerine, kanülasyonu dikkatlice yeniden denemek hala mümkündür.

Boyundan sol kanada orta hat insizyonu ve deri altı tüneli (Adım 2.3), vericiyi kuvvet kullanmadan kolayca sokacak kadar büyük olmalı, ancak vericiyi yerinde tutmak için mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Aksi takdirde, dikiş materyali veya doku yapıştırıcısı ile yerine kilitlenmesi gerekecektir. Fareler çok hassas bir cilde sahip olduklarından, verici için tünel çok küçükse cildin nekrozu oluşabilir.

EKG elektrotları deri altı tüneline sığmayacak kadar uzunsa (Adım 2.4), elektrodu uygun bir uzunluğa kısaltarak yeni bir uç oluşturmak gerekir. Elektrot, kurşunun tüm uzunluğu boyunca vücuda karşı düz durmalıdır. Çok uzun elektrotlar hayvanları rahatsız edecek ve vericiyi çıkarmak için yarayı açmaya çalışacaklar, bu da doku tahrişi ve yara ayrılması riskine neden olacaktır. Çok kısa olan uçlar elbette uzatılamaz ve bu durumda elektrotlar Einthoven II konfigürasyonuna karşılık gelecek şekilde konumlandırılamayabilir. Bu nedenle, aynı cinsiyete, ağırlığa ve genetik geçmişe sahip ölü bir farede EKG derivasyonlarının optimal uzunluğunu belirlemenizi öneririz.

Farelere, normal bir sirkadiyen ritme sahip değillerse ve bu, incelenen fare çizgisinin fenotipi değilse, verici implantasyonundan sonra daha uzun bir iyileşme süresi verilmelidir (adım 2.7). Rahatsız sirkadiyen ritimlerin bir başka nedeni, hayvan tesisinin veya ölçüm sırasında odaya giren personelin yetersiz akustik izolasyonu olabilir.

EKG, BP ve BRS veri analizi basittir (Adım 2.8). En kritik adım, ektopik atımları, sinüs duraklamalarını, aritmik atakları veya düşük kaliteli sinyallere sahip bölümleri veri analizinden çıkarmaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL	CP-Pharma, Germany	1229	anesthesia
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe	Wolfram Droh GmbH, Germany	9166017V
Bepanthen eye and nose ointment	Bayer AG, Germany
Blunt dissecting scissors	Fine Science Tools GmbH, Germany	14078-10
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL	CP-Pharma, Germany	115	preemptive and post-operative pain relief
Cutasept F skin desinfectant	BODE Chemie GmbH, Germany	9803650
Cotton Tipped Applicator sterile	Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany	09-119-9100
Forceps - Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools GmbH, Germany	11253-25
Forceps - straight	Fine Science Tools GmbH, Germany	11008-13
Gauze swabs with cut edges, 7.5x7.5 cm, cotton	Paul Hartmann AG. Germany	401723
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters	Data Sciences International, United States
Homothermic blanket system with flexible probe	Harvard Apparatus, United States
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools GmbH, Germany	18000-45
Ketamine 10%	Ecuphar GmbH, Germany	799-760	anesthesia
Magnet	Data Sciences International, United States		transmitter turn on/off
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter	Fine Science Tools GmbH, Germany	12502-12
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710005525	24 G needle
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710004020	27 G needle
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided)	Resorba Medical, Germany	PA10273	lead fixation
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided)	Resorba Medical, Germany	4023	skin closure
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope	Zeiss, Germany
Pilca depilatory mousse	Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany	6943151
PVP-Iodine hydrogel 10%	Ratiopharm, Germany
Ringer's lactate solution	B. Braun Melsungen AG, Germany	401-951
Sensitive plasters, Leukosilk	BSN medical GmbH, Germany	102100	surgical tape
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml	B. Braun Melsungen AG, Germany
Surgibond tissue adhesive	SMI, Belgium	ZG2
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided)	Resorba Medical, Germany	G2105	lead preparation, ligation sutures
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1	Procter & Gamble
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools GmbH, Germany	18403-11
Xylazine (Xylariem) 2%	Ecuphar GmbH, Germany	797469	anesthesia
Data acquisition and analysis	Source
DSI Data Exchange Matrix	Data Sciences International, United States
DSI Dataquest ART 4.33	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI Ponemah	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI PhysioTel HDX-11 for mice	Data Sciences International, United States
DSI PhysioTel receivers RPC1	Data Sciences International, United States
ecgAUTO v3.3.5.11	EMKA Technologies		ECG and BP analysis software
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, United States