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要約

圧反射は、血圧の変化に応答する自律神経系による心拍数調節機構です。マウスの心電図と血圧を連続的かつ同時に測定するためのテレメトリ送信機を埋め込む外科的手法について説明します。これは、心血管疾患の重要な予後マーカーである自発的圧反射感受性を決定することができる。

要約

血圧(BP)と心拍数(HR)は、どちらも自律神経系(ANS)によって制御されており、反射メカニズムによって密接に絡み合っています。圧反射は、動脈血圧の急性で短期的な変化に対抗し、血圧を比較的狭い生理学的範囲に維持するための重要な恒常性メカニズムです。BPは、大動脈弓および頸動脈洞に位置する圧受容器によって感知される。血圧が変化すると、信号は中枢神経系に伝達され、自律神経系の副交感神経および交感神経枝に伝達されてHRを調整します。血圧の上昇はHRの反射減少を引き起こし、BPの低下はHRの反射増加を引き起こします。

圧反射感度(BRS)は、動脈血圧の変化とそれに対応するHRの変化との間の定量的関係です。 心血管疾患はしばしば圧反射機能障害と関連しています。様々な研究において、BRSの減少は、例えば、心不全、心筋梗塞、または冠状動脈疾患において報告されている。

BRSの決定には、BPとHRの両方からの情報が必要であり、テレメトリデバイスを使用して同時に記録できます。外科的処置は、圧力センサーを左頸動脈に挿入し、動脈圧を監視するために大動脈弓にその先端を配置することから始まり、続いて送信機とECG電極の皮下配置が説明されています。また、術後集中治療と鎮痛管理についても説明します。手術後の回復の2週間後、長期ECGおよびBP記録が意識のあるマウスおよび拘束されていないマウスで実行されます。最後に、高品質の録音の例と、シーケンス法を使用した自発的圧受容器感受性の分析を紹介します。

概要

動脈圧受容器反射は、動脈血圧(ABP)の短期的(そしておそらくより長期的な1,2)制御を提供するヒトの主要なフィードバック制御システムです。この反射は、生理学的または環境的トリガーに応答して発生するBPの摂動を緩衝します。心拍数、脳卒中量、および末梢動脈抵抗の迅速な反射変化を提供します。反射は、大動脈弓と頸動脈洞の感覚神経終末に由来します。これらの神経終末は動脈圧受容器を構成する。大動脈弓の神経終末の体細胞は結節神経節に位置し、頸動脈洞の神経終末の体細胞は錐体神経節に位置する。反射は血圧の上昇によって引き起こされ、圧受容器神経終末を伸ばして活性化します(図1A)。活性化は、求心性大動脈圧および頸動脈洞神経を介して、迷走神経の核路および背側核などの心血管脳幹核に中枢的に伝達される活動電位ボレーをもたらす。求心性神経活動の変化は、自律神経遠心性活動を調節します。圧受容器神経の活動の増加は交感神経を低下させ、副交感神経の活動を増加させる。したがって、圧受容器の活性化の結果は、心拍数、心拍出量、および血管抵抗の低下であり、これらは一緒になって血圧の上昇を打ち消し、緩衝します3。対照的に、圧受容器神経の活動が低下すると、交感神経が増加し、副交感神経の活動が低下し、心拍数、心拍出量、血管抵抗が増加し、血圧の低下が相殺されます。

人間と動物での多くの研究は、圧受容器反射が運動4、睡眠5、熱ストレス6、または妊娠7などの生理学的条件下で調整できることを示しました。さらに、圧反射は、高血圧、心不全、心筋梗塞、脳卒中などの心血管疾患で慢性的に障害されているという証拠があります。実際、圧反射機能障害は、いくつかの心血管疾患における予後マーカーとしても利用されている8、9、10。さらに、圧反射の機能不全は、ANSの障害にも存在する。健康および疾患状態に対する圧受容器反射の重要性を考えると、この反射のin vivo推定は、特定の深刻な臨床的意味を持つ自律神経および心血管研究の重要な要素です。

遺伝子マウス系統は、心臓血管研究に不可欠なツールです。このようなマウス系統のin vivo研究は、心血管生理学および病態生理学に関する貴重な洞察を提供し、多くの場合、心血管疾患の前臨床モデルシステムとして機能します。ここでは、意識のある、拘束されていない、自由に動くマウスにおけるテレメトリーin vivoECGおよびBP記録のプロトコルを提供し、シーケンス法を使用してこれらの記録から圧反射感度を決定する方法について説明します(図1B)。適用された方法は、HRの反射適応を伴うSBPの自発的な増加または減少の間に3つ以上の拍動の短いシーケンスについて、収縮期血圧(SBP)およびRR間隔の拍間一連のスクリーニングが行われるため、シーケンス法と呼ばれます。この方法は、自発反射メカニズムのみが調査されるため、圧反射感度決定のゴールドスタンダードです。この技術は、血圧変化を誘発するための血管作用薬の注射などの侵襲的処置を伴う古い技術よりも優れています。

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図1:シーケンス法を用いた圧反射および圧反射感度評価の概略図。 (A)血圧の急激な上昇時の圧反射の経過。ABPの短期的な上昇は、大動脈弓および頸動脈洞に位置する圧受容器によって感知される。この情報は中枢神経系に伝達され、副交感神経活動の増加と並行して交感神経活動の低下を誘発します。洞房結節領域に位置する神経終末からのアセチルコリンの放出は、洞房結節ペースメーカー細胞におけるセカンドメッセンジャーcAMPの減少を誘発し、したがって心拍数の低下を誘発する。血圧の短期間の低下は逆の効果があります。(B)3つの連続したビートのアップシーケンス(左上のパネル)とダウンシーケンス(右上のパネル)の間の概略的なBPトレース。アップシーケンスは、RR間隔の並行増加(左下のパネル)に関連しており、これはHRの減少に相当します。ダウンシーケンスは、RR間隔の平行減少(右下パネル)に関連しており、これはHRの増加に相当します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

すべての動物実験は、地域の施設のガイドラインおよび動物実験に関する国内法に準拠して実施してください。この実験のために、研究はRegierung von Oberbayernによって承認され、動物実験に関するドイツの法律に準拠していました。WT動物(C57BL/6Jバックグラウンド)およびBRS感受性の増加を示す洞不全マウスモデルの動物(Hcn4tm3(Y527F;R669E;T670A)Biel)11 (C57BL/6Nと129/SvJバックグラウンドの混合)を本研究に用いた。

1.機器のセットアップ

  1. 遠隔測定トランスミッターを滅菌パッケージから取り出し、ECGリードをマウスのサイズに適した長さに短くします。体重が~30 gの12週齢のオスのブラックシックスマウス(C57BL/6J)の場合、ハサミを使用して正の鉛(赤)を~45 mmの長さに、負の鉛(無色)を~40 mmの長さに短くします。
    注意: これらの値は方向として与えられ、必要に応じて調整する必要があります(図2)。
  2. メスを使用してECGリードのシリコンチューブの約6mmを取り外し、ワイヤーを露出させます。電気信号を記録するために、ECGワイヤの~2mmの部分を覆い隠さないように、ワイヤの先端を過剰なチューブで覆います。非吸収性の5-0シルク縫合材料でシリコンチューブを固定します(図2A)。
  3. 送信機のシリアル番号を操作プロトコル(補足ファイル1)に書き留めます。
  4. 温かい滅菌済み0.9%NaCl溶液でトランスミッタを水和します。
  5. マウスの重量を量り、その重量を記録します。
  6. 手術前にすべての手術器具をオートクレーブします。手術中および異なる動物の操作の間に、熱いガラスビーズ滅菌器を使用して乾熱でそれらを滅菌します。
    注意: 手術器具は、皮膚の火傷を防ぐために、使用前に室温まで冷却する必要があります。
  7. 無菌状態を確保するために作業台を消毒します。

2.ECGと血圧を組み合わせた測定のためのテレメトリトランスミッタの外科的埋め込み

  1. 左総頸動脈の解剖。
    1. 麻酔ミックス(100 mg / kgケタミン、15 mg / kgキシラジン、1 mg / kgアセプロマジン)の腹腔内注射によってマウスを麻酔します。.つま先のピンチテストを実行して、手術を開始する前にマウスが完全に麻酔されていることを確認します。
    2. トリマーを使用して、あごの下から横胸筋に向かって手術領域を剃ります。
    3. 37°Cに設定された温度制御された手術プレート上でマウスを仰臥位に置きます。 手足をサージカルテープで固定し、直腸体温計で体温を継続的に監視します(図2C)。体温が37°Cを下回った場合は、手術中に動物の体を滅菌綿ガーゼで覆います。
    4. 麻酔中に動物の目を保護するために目の軟膏を塗ります。
    5. 以前に剃った手術部位に脱毛クリームを塗ります。3〜4分後に綿パッドと温水を使用して髪と脱毛クリームを取り除きます。手術中に傷口が汚染されないように、皮膚が清潔で髪の毛や脱毛クリームが残っていないことを確認してください。
    6. ポビドンヨードまたはクロルヘキシジンスクラブとそれに続くアルコールの交互のラウンドで皮膚を消毒します。
    7. 動物を解剖顕微鏡の下に置き、手術領域の周りに滅菌ドレープを置きます。
    8. あごのすぐ下から始めて、首の皮膚から1〜1.5 cmの正中線を切開します。切開をできるだけまっすぐにするように努力してください。(図2D)。
      注:次の手順では、滅菌済みの温かい(37°C)0.9%NaClを定期的に塗布して、手術領域を湿らせておく必要があります。
    9. 鈍い解剖ハサミで皮膚を下にある結合組織から分離することにより、切開の両側に皮下スペースを作成します。鉗子で皮膚を強くつまみすぎないように注意してください、これは壊死を引き起こし、手術後の創傷治癒障害につながる可能性があるためです。
    10. 綿の先端アプリケーターを使用して耳下腺と顎下腺を分離し、気管の上にある筋肉組織を露出させます。
    11. 湾曲した解剖鉗子で左唾液腺を引っ込めて、気管の横方向に位置する左頸動脈を特定します(図2E)。
    12. 湾曲した鉗子を使用して、隣接する組織から頸動脈を慎重に解剖します。血管に沿って走っている迷走神経を傷つけないように十分に注意してください。鈍的解離を続け、左頸動脈を約10mmの長さに露出させ、血管筋膜および迷走神経から完全に分離します(図2F)。
    13. 血管壁を簡単に損傷する可能性があるため、縫合糸と頸動脈の間の摩擦を減らすために湾曲した鉗子で血管をわずかに持ち上げながら、頸動脈の孤立した部分の下に非吸収性の5-0シルク縫合糸を通過させます。
    14. 縫合糸を頭蓋骨に、頸動脈の分岐部のすぐ近くに置き、結び目を形成し、それを結び、血管を永久に結紮します(図2G)。頭蓋閉塞縫合の両端をサージカルテープで手術台に固定します。
    15. 頸動脈の下に2番目の咬合縫合糸を通過させ、頭蓋縫合糸から~5 mmの距離で尾側に置きます(図2H)。動脈のカニューレ挿入中の血流の一時的な閉塞に必要です。したがって、緩い結び目を結び、両縫合糸の端をサージカルテープで固定します。
    16. 頭蓋と尾の咬合縫合糸の間に3番目の縫合糸(固定縫合糸)を配置し、緩い結び目を作ります(図2I)。この縫合糸は、動脈をカニューレ挿入している間、カテーテルを所定の位置に保つために必要です。縫合糸の一方の端を手術台にテープで固定します。
  2. 左総頸動脈のカニュレーション。
    注意: 血圧カテーテルのセンサー領域は遠位端から4 mmの場所にあり、非圧縮性流体と生体適合性ゲルを含むチューブで構成されています(図2B)。この部分は非常に敏感なので、気泡がないことを確認し、手順中はいつでも触れないでください。
    1. 24Gの針の先端を~100°の角度に曲げて、カテーテル導入器として使用します。
    2. 尾側咬合縫合糸をそっと引っ張り、緊張させて一時的に血流を止め、動脈をわずかに持ち上げます。
    3. 曲がった針で頭蓋閉塞縫合糸の近位の動脈を注意深く貫通します(図2J)。血管カニューレ鉗子でカテーテルをつかみ、小さな穿刺に導入し、ゆっくりと血管内にスライドさせます。曲がった針を同時にゆっくりと引き戻します(図2K)。
    4. カテーテルが尾側閉塞縫合糸に到達したら、固定縫合糸をわずかに締めて、カテーテルを所定の位置に保ちます(図2L)。
    5. 尾側閉塞縫合糸を緩めて、カテーテルの先端が大動脈弓に配置されるまでカテーテルをさらに動かせるようにします。
      注意: カテーテルの正しい挿入長さはマウスのサイズに依存するため、必ず決定してください。12週齢でC57BL/6Jのバックグラウンドを持ち、体重が~30 gのオスマウスの場合、統合されたノッチが頭蓋閉塞縫合糸に達するまでカテーテルを挿入することをお勧めします。特定のマウスラインに対するカテーテルの正しい挿入深さおよび配置は、動物の安楽死後に確認することができる。
    6. 適切に配置されたら、3つの縫合糸すべてでカテーテルを固定し、両端をできるだけ短く切ります。壊れやすい血圧カテーテルを損傷する可能性があるため、結び目をきつく引っ張りすぎないでください。

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図2:ECGと血圧トランスミッタを組み合わせた移植-左頸動脈のカニューレ挿入 。 (A)テレメトリ送信機は、圧力カテーテル、2つの生体電位電極、およびデバイス本体で構成されています。(B)圧力カテーテルの概略図。センサー領域は、非圧縮性流体と生体適合性ゲルで構成されています。血管内の適切な位置を確保するために、ノッチが頭蓋閉塞縫合糸のレベルになるまで、カテーテルを頸動脈に挿入する必要があります。(C)手術用伝達物質移植用に調製した麻酔付きC57BL/6Jマウス。(D-L)左頸動脈のカニューレ挿入のための外科的処置を示す画像配列。(D)頸部皮膚切開。(E)気管に対して横方向に位置する左頸動脈を特定するための露出気管。(F)動脈を隣接組織および迷走神経から隔離するための鈍的解剖。(G)頭蓋閉塞縫合による左頸動脈の永久結紮。(H)一時的に血流を止めるために尾側閉塞縫合糸に張力をかける。(I)カニューレ挿入中にカテーテルを所定の位置に保つために縫合糸を固定します。(J)血管にカテーテルを挿入するための湾曲した先端を有するカニューレ。(K)頸動脈に圧力カテーテルを挿入する。(L)カテーテルの先端は大動脈弓に配置され、カテーテルは中央の縫合糸で固定されています。D-Lのスケールバーは4mmを示し、16から転載。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. マウスの左脇腹の皮下ポケットへのテレメトリ デバイス本体の配置 (図 3)。
    1. 動物の左脇腹に向けられた首から皮下トンネルを形成し、小さくて鈍い解剖ハサミを使用して小さなポーチを形成します(図3B)。
    2. 温かい滅菌0.9%NaCl溶液で満たされた1 mLシリンジでトンネルを洗浄し、~300 μLの溶液をパウチに入れます(図3C)。
    3. 鈍い鉗子で皮膚を慎重に持ち上げ、送信機デバイス本体をポーチに入れます(図3D)。このステップでは、血圧カテーテルを頸動脈から引き抜かないように十分に注意してください。
  2. アイントホーフェンII構成でのECGリードの配置。
    1. 鈍い解剖ハサミで右胸筋に細いトンネルを形成し、鈍い鉗子を使用して負の(無色の)リードをトンネルに入れます。6-0吸収性縫合材料を使用して胸筋にステッチでリードの末端を固定します(図3E)。
    2. 正(赤)リードにループを形成し、その先端を左尾肋骨領域に配置し、6-0吸収性縫合材料を使用して縫合糸でその位置を固定します。
      注意: 組織の刺激を避けるために、両方のリード線が全長にわたって体に対して平らに置かれていることが重要です(図3F)。
    3. 5-0非吸収性縫合材料を使用して、シングルノットで皮膚を閉じます(図3H)。さらに、動物が縫合糸を噛まないようにし、裂開を防ぐために、すべての結び目に少量の組織接着剤を塗布します。
    4. 回復段階の創傷感染を防ぐために、ポビドンヨードヒドロゲルを創傷に10%塗布する。
    5. 先制的な痛みを和らげるために、マウスがまだ麻酔下にある間に、0.9%NaClに5 mg / kgのカルプロフェンを皮下注射します。.
    6. 加熱プラットフォームを39 ± 1°Cに設定し、マウスを別のハウジングケージに入れます。ケージの半分を手術後12時間プラットフォームに配置し、マウスを暖かい場所に移します。動物が麻酔から目覚めたとき、それは暖かい場所にとどまるか、ケージのより涼しい部分に移動するかの選択肢があります。

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図3:ECGと血圧トランスミッタを組み合わせた移植-ECG電極とデバイス本体の皮下配置。 (a)血圧カテーテル挿入後のマウス。カテーテル位置は、閉塞縫合糸によって確保される。(B)鈍いハサミで動物の左脇腹に皮下ポケットを形成する。(C)パウチに~300μLの温かい滅菌生理食塩水で洗浄します。(D)デバイス本体を皮下ポケットに入れる。(e)負極(無色)の末端を吸収性縫合材で右胸筋に固定する。(F)正極(赤)を左肋間筋に固定する。(G)ECG電極の位置を確保するために胸筋に永久縫合糸を配置する。(H)皮膚閉鎖後のマウス。ECG電極チップの皮下位置は赤い円で示されています。デモンストレーションの目的で、死んだ動物を使用してこれらの画像を撮影しました。生きている動物を使用している間は、無菌の慣行に従ってください。16から転載。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 術後ケア
    1. 術後の痛みを和らげるために、傷が治癒するまで12時間ごとに3〜5日間、0.9%NaClに5 mg / kgのカルプロフェンを皮下注射します。.
    2. 動物を脱水から保護するために、10 μL / gの温かいリンゲル乳酸溶液を腹腔内に注入します。.
    3. 最初のテレメトリ測定を実行する前に、マウスを2〜3週間回復させます。回復期間中の一般的な健康状態、創傷治癒、体重、および食物と水の摂取量を注意深く監視します。
    4. 実験の終わりに、二酸化炭素(CO2)吸入によってマウスを安楽死させる。
      注:頸部脱臼または断頭は、ECGおよびBP送信機デバイスの一部を損傷する可能性があるため、安楽死法としては推奨されません。
  2. データ取得。
    1. データ記録中の音響ノイズや電子ノイズを避けるための対策を講じてください。さらに、データ記録中の人員のアクセスを制限し、実験前にすべての飼育手順を完了してください。
    2. 動物のケージをテレメトリーレシーバープレートに置き、磁石を動物に近づけてテレメトリトランスミッターをオンにします。
    3. データ収集ソフトウェアを使用して、72時間(12時間の暗/明サイクル)にわたって継続的なECG、血圧、および活動記録を取得します(図4)。
  3. 心拍数、血圧、活動の概日リズムの分析。
    1. データ収集ソフトウェア12 を用いて、HR、BPおよび活動の規則的な概日リズムの存在を確認する(図5)。
  4. ECGおよびBP分析ソフトウェアを使用したシーケンス法を使用した圧受容器感度の決定を含むデータ分析。
    1. BPおよびHRデータをデータ収集ソフトウェアからECGおよびBP分析ソフトウェアにエクスポートします(補足ファイル2)。次の一連のコマンドを使用します。 ECGおよびBP分析ソフトウェアを開く >ファイル > コンバーターからの生データ > 非IOX生データを変換します。新しいウィンドウで、[ファイル]をクリックして >データクエストART4データをロードします。再び、新しいウィンドウが開き、 エクスポートするデータファイルを選択し>新しいウィンドウが開き、「被験者」リストから動物を選択し、「波形リスト」からECGとBPを選択して OKを押します。[ データの変換] > [IOX バイナリ サイト ファイルの作成] をクリックして、データの変換元の動物を選択します。
    2. 以下の一連のコマンドを使用して、ECGおよびBP分析ソフトウェアでIOXバイナリサイトファイルを開きます。 ファイル> IOXデータをロード>BPおよびECGトレースを選択し>緑色のチェックマークを押します。
      注:以下のデータ処理パラメータは、野生型マウスから取得したデータ用に最適化されており、原則として前臨床分野で使用されるすべてのマウスモデルに適合する必要があります。ただし、特定の実験モデル、たとえば、HR値および/またはBP値が非常に高いまたは低いマウス、または異なるげっ歯類種で作業する場合は、これらのパラメーターの適応が必要になる場合があります。いずれにせよ、データ処理パラメータは、調査中の特定のモデルに適合することを保証するために慎重に検討する必要があります。
    3. ECG、BP、およびBRS分析の設定については、補足ファイル3,4を参照してください。マウスでのBRS分析では、SBPと1拍のRRの間の遅延を示す3つ(またはそれ以上)の拍動のシーケンスのみを検出するようにBRSパラメーターを調整し、SBPおよびRRの変化のしきい値を0.5 mmHgおよび2 msに設定します。RR/SBPプロットからの回帰直線の傾きの相関係数が0.75より大きいことを確認し、安定した洞調律を示すセクションのみを解析します。ECG、BP、およびBRS分析のパラメータを適宜設定するには、以下の一連のコマンドを使用します。 新しいウィンドウが開く>>分析設定を調整する
      1. 心電図設定(「心電図モードと信号フィルタリング」ウィンドウ(補足ファイル3)を右クリックします)。ここで詳しく説明するようにパラメータを設定します。モード: ECG, RRのみ, フィルターモード: 自動, 設定HRによる, 予想心拍数: bpm > 300, ベースライン除去フィルター幅 (ms): 100.00, ノイズ除去フィルター幅: 1.00 ms, ノッチフィルター: 50.0 Hz, スパイク除去フィルター: オフ, ドロップアウト検出モード: オフ, 最大 RR 長 (ms): 900.00, 調整済み R ピークからの RR: オフ, RR_only設定モード: Xsmall: マウス、Rピーク幅(ミリ秒):10.00、PR幅(ミリ秒):20.00、RT幅(ミリ秒):50.00、最大インタービートアーティファクト(%):50.00、Rと他の振幅比:3.00、Rピーク符号:正、および追加パラメータの計算:オフ
      2. 血圧設定(血圧、圧力設定)については、「BPアナライザー」ウィンドウ(補足ファイル4)を右クリックします。ここで詳しく説明するようにパラメータを設定します。ノイズ除去フィルタ幅(ms): 10.00, 微分フィルタ幅(ms): 6.00, ノッチフィルター: 50.0 Hz, スパイク除去フィルター: オフ, 検証しきい値(口径単位): 12.00, 除去しきい値: 8.00, 開始時微分アップストローク(cal U/s): 10.00, 除去限界: オフ, 基準心電図からの遅延: ユーザー定義ウィンドウ, ECG Rピークからの最小遅延 (ms): 10.00, ecg Rpeak からの最大遅延 (ms): 250.00, マークからのConduct_time_1: 計算されていません, マークからConduct_time_2: 計算されていません, BR (呼吸数): オフ, BRS (気圧反射感度): オン, 最小連続拍数: 3, レイテンシ拍数: 1, 圧力値: SBP, パルス間隔を計算するマーク: R, 最小圧力変動 (caIU): 0.50, 最小間隔変動 (ms): 2.00, 最小相関: 0.75
    4. 低活性の3時間シーケンスの活性信号をスクリーニングします。動物の高い活性がBPおよびRR相関を妨げるので、この時間枠でBRS分析を実行する。
    5. この3時間の時間枠でBPおよびRR分析を実行し、3時間の分析を10分ステップに分割します。
    6. 次のコマンドのシーケンスを使用して、BRS 分析を実行します。 BRS 分析 ウィンドウを開き> BRS 分析>ビューを開きます。BRS 分析パネルが開きます。BRS分析パネルに表示されるすべてのシーケンスを手動で検査し、異所性拍動、洞休止、不整脈イベント、またはノイズの多いデータを除外します。このようなシーケンスのすべてのビートを無効にして、分析から正常に除外してください。
    7. BRS 解析の結果をスプレッドシート ファイル(結果ファイル)にエクスポートします。スプレッドシート ファイルにエクスポートされるパラメーターを変更するには、次のコマンド (補足ファイル 5-7) を使用します。
      1. txt (補足ファイル 5) >リスト/ファイル>セクションの>パラメーターを調整します。「ビート」セクションと、無効化されたビートセクション以外の関心のある情報を含むその他のセクションを選択します。
      2. リスト/ファイルへの>ステップで>パラメーターをtxt>調整 します(補足ファイル6)。エクスポートするステップ値を選択します。
      3. リスト/ファイル内の>パラメータを調整>-> txt (補足ファイル7)を打ち負かします。
      4. ファイルの beats セクションに、すべてのビートについて少なくとも次のデータが含まれていることを確認します。ECG_RR、ECG_HR、BP_SBP、BP_BRS_deltaP、BP_BRS_#(=シーケンスの連続した拍音間隔)、BP_BRS_slope、BP_BRS_correl、BP_BRS_shiftl(=後続の拍のRR)
      5. 次に 、[ファイル] > [結果ファイルの保存] をクリックします。
    8. エクスポートしたデータをExcelのフィルター機能(補足ファイル8)で上下のシーケンスにソートします。シーケンスの数、平均BRSスロープ、標準偏差、BRSスロープの標準誤差をアップシーケンスとダウンシーケンスで別々に計算します。また、1000ビートあたりのシーケンスの合計量を計算します。
      注:アップシーケンスとダウンシーケンスの自動ソートと分析のためのスプレッドシートテンプレート(TemplateBRS)は、補足(補足ファイル8)で提供されており、分析を容易にします。フィルター機能を調整することで、異なるビート番号(3ビートまたは4ビートシーケンスなど)でシーケンスを並べ替えることができます。詳細については、補足ファイル 9-13 を参照してください。
      1. 結果ファイルとテンプレート BRS エクセル ファイル (補足ファイル 8) を開きます。結果ファイルから次の列のデータをコピーします: (圧力)_BRS_deltaP、(圧力)_BRS_# および (圧力)_BRS_slope (補足ファイル 9)。TemplateBRS ファイル (補足ファイル 10) の "アップ シーケンス" スプレッドシートと "ダウン シーケンス" スプレッドシートのそれぞれの列にデータを貼り付けます。さらに、結果ファイル (補足ファイル 11) から列 (圧力) _BRS_SBP のデータをコピーし、TemplateBRS ファイル (補足ファイル 12) の "すべてのシーケンス" スプレッドシートに貼り付けます。
        注: (圧力)_BRS_# 列の数字は、シーケンスの最後のビートにのみリストされ、シーケンスの長さを示します。アップシーケンスとダウンシーケンスは、(圧力)_deltaP値の符号で区別できます。3 拍シーケンスの 2 拍目と 3 拍目の負の値は、ダウンシーケンスを示します。正の値は、それぞれアップシーケンスを示します。
      2. コピーしたデータを既定のフィルター設定でフィルター処理します。(圧力)_BRS_#列のフィルターアイコンをクリックし、「OK」(補足ファイル13)を押します。この手順を「アップシーケンス」および「ダウンシーケンス」スプレッドシートに適用します。
        注:スプレッドシートは3ビートシーケンスをフィルタリングします。他のシーケンス長が要求される場合は、ドロップダウンメニューでこの列の設定を変更する必要があります。シーケンス数、平均BRS勾配、標準偏差、BRS勾配の標準誤差の計算は、「アップシーケンス」および「ダウンシーケンス」スプレッドシートの緑色のボックスに表示されます。1000ビートあたりのシーケンスの総数の計算は、「すべてのシーケンス」スプレッドシートの緑色のボックスに表示されます。

結果

ECGおよびBP生データの肯定的な結果
このプロトコルを使用すると、高品質のECGおよびBPデータを取得でき(図4および補足ファイル14)、正確なBRS分析だけでなく、ECG間隔(図4B、上パネル)、血圧パラメータ(図4B、下パネル)、心拍数および血圧変動など、幅広いECGまたはBP由来のパラメータの分析も可能です。 不整脈の検出など12,13,14,15。

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図4:テレメトリーECGおよびBP記録。 (A)代表的な高品質のECGトレース(上パネル)および対応する高品質の生のBP記録(下パネル)。(B)心電図トレースの拡大率(上パネル)。P波、QRS複合体、T波およびRR間隔が示される。対応するBPデータの倍率(下パネル)。拡張期血圧(DBP)および収縮期血圧(SBP)が示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

概日リズムの肯定的な結果
手術から十分に回復した健康なマウスは、活動(暗)期に活性、HRおよびBPの生理学的増加を示す(図5)。多くの異なる要因がこの規則的な概日リズムを乱す可能性があります。これらには、心理的ストレス、音響または電気ノイズ、痛みが含まれます。たとえば、手術直後の急性疼痛状態は、心拍数の増加と活動の低下を同時にもたらします。したがって、概日リズムは動物の健康と幸福の重要な指標であり、BRS分析の前に定期的にチェックする必要があります。

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図5:概日リズムの変動を決定するための長期テレメトリ測定の分析。 心拍数(A)、活動(B)、収縮期血圧(C)、拡張期血圧(D)の概日リズムは、9匹のオスの野生型C57BL / 6Jマウスから12時間の明暗サイクルで平均されました。灰色の領域は活動(暗い)段階を表し、白い領域は動物の休止(明るい)段階を表します。すべてのパラメータは、動物の活動(暗)期に生理学的に上昇します。データは平均+/- SEMで表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

BRS分析の肯定的な結果
プロトコルセクション2.8で説明されているように分析を実行した後、ソフトウェアはアップシーケンスとダウンシーケンスをそれぞれ検出します。SBPの自発的な上昇または下降を伴う3拍以上の短いシーケンス中に、SBPおよびRR間隔の変化が拍間ベースで検査されるため、使用される方法はシーケンス法と呼ばれます(図6)。3心拍にわたるSBPの継続的な上昇は、副交感神経活動の反射増加を引き起こし、その結果、より長いRR間隔に相当するHRを遅くします。反射HR適応の待ち時間は1ビートです。このようなシーケンスは図6Aに示され、アップシーケンスとして定義されています。対照的に、HRの並行上昇(RR間隔の減少)を伴う3拍にわたるSBPの連続的な減少は、ダウンシーケンスとして定義される(図6B)。RRとSBPの相関を評価するために、両方のパラメータを互いにプロットし、線形回帰直線の傾き(ms/mmHg)をシーケンスごとに計算します(図6A、B、下のパネル)。アップシーケンスとダウンシーケンスでソートした後、アップシーケンスとダウンシーケンスについて、それぞれ1000ビートあたりの平均シーケンス数(図6C)と自発BRSの平均ゲインを計算できます(図6D、E)。自発BRSのゲインは、RR/SBP関係から計算された線形回帰直線の傾きに反映されます。通常のBRS値からの偏差には、さまざまな原因が考えられます。これらには、ANS入力の変化または自律神経系入力に対する洞房結節の応答性の変化が含まれます。図6には迷走神経入力に対する洞房結節の誇張された応答性を伴う洞調症候群(SSS)に対するマウスモデルにおけるBRSの増加が示されている11。

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図6:シーケンス法を用いたBRSの推定。 (A)野生型C57BL/6Jマウスの、HRの減少に相当するRR間隔の並行増加(中央パネル)に関連する3つの連続した拍動のアップシーケンス(上のパネル)中の代表的なBPトレース。RR間隔をSBPに対してプロットした(下のパネル)。上部と中央のパネル(WT、黒丸)に描かれたアップシーケンスの回帰直線(赤線)の傾きは4.10 ms/mmHgでした。洞不全症候群マウスモデルの代表的なRR/SBP関係は、BRSの上昇を示す6.49 ms/mmHgの増加をもたらした(SSS、灰色の円)。(B)SBPの低下(上パネル)とそれに続くRR間隔の減少(中央パネル)を伴う野生型マウスの代表的なダウンシーケンスで、BRSスロープは4.51 ms/mmHg(下パネル;WT、黒丸)。7.10 ms/mmHgの傾きを持つ病気洞症候群モデルマウス(SSS、灰色の円)の代表的なRR/SBP関係。赤い矢印の方向は、シーケンスの方向(上または下のシーケンス)を示します。(C)WTおよびSSSマウスの1000拍当たりの配列の総量。(D)WTマウスとSSSマウスのアップシーケンスのRR/SBP関係の平均傾き。(E)WTマウスとSSSマウスのダウンシーケンスのRR/SBP関係の平均傾き。(C−E)における統計は、病気洞症候群モデルマウスの雄6匹のWT動物および8匹の雄動物の結果から行った。箱ひげ図には、正中線、perc 25/75、および最小値/最大値が表示されます。開いている記号は平均値を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

生データ品質に対する否定的な結果
特に、活動量が多い段階では信号品質が低下する可能性があります(図7 および 補足ファイル15,16)。これは、動物の動きによるBPカテーテルまたはECGリードのいずれか、あるいは両方の一時的な変位または誤った位置によって引き起こされる可能性があります。また、骨格筋の活動がECGリードから検出され、ノイズを誘発する可能性があります(図7B、上のパネル)。上記のソフトウェア設定では、これらの低品質のビートは検出されないため、分析から除外されます。それにもかかわらず、分析された生データの手動検査は必須です。

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図7:低品質の生信号の例。 (A)心電図信号(上パネル)は良好に検出されるが、BP信号(下パネル)の品質は低い。(B)心電図(上パネル)とBP(下パネル)信号の質が十分ではありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

BRS分析の否定的な結果
プロトコルセクション2.8.3にリストされているBRS分析設定は、一般に、アップシーケンスとダウンシーケンスを迅速かつ正確に検出するために不可欠です。回帰直線の最小相関係数は 0.75 に設定されます。最小相関係数の設定値が低すぎると、圧反射活動を反映しず、不整脈拍動に起因する配列が誤って検出されます(図8)。BRS分析では、洞調律が安定したエピソードのみを分析する必要があります。異所性拍動またはその他の不整脈イベント、例えば洞休止は、ECGおよびBP分析ソフトウェアのHRVオプションで見つけることができ、無効にする必要があります。

figure-results-5290
図8:圧反射活動を反映しない配列 。 (A)軽度の洞性不整脈を有するマウスのECGトレース。(B)SBPの自発的な増加を示すBP記録。(C)対応するRR間隔は、BPの増加に伴うHRの減少を示す。 (D)SBPおよび対応するRR間隔のプロット。回帰直線の相関係数が低いことは、HR低下が圧反射の活動ではなく洞性不整脈によって引き起こされたことを示しています。(E)副鼻腔の一時停止を描いた生のECGトレース。(F)対応する生のBP信号。副鼻腔の休止は拡張期血圧の低下を引き起こします。その後の拍動の収縮期血圧はほとんど影響を受けません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:手術プロトコル。 外科的処置と術後ケアの文書化のためのテンプレート。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:データクエストA.R.TデータをECGAUTOソフトウェアで分析するためのIOXデータに変換します。 被験者リスト(左)で動物を選択し、波形リスト(右)で圧力とECGを選択します。OKを押してデータを変換します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:BRS分析のためのECG設定。 リストされているようにパラメータを設定し、[OK]を押して設定を適用します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 4: BRS 分析の BP 設定。 リストされているようにパラメータを設定し、[OK]を押して設定を適用します。設定を簡単にロードできるように、設定を設定ファイルとして保存します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル5:「セクション」のリスト/ファイルウィンドウのパラメータ。 セクション > txt ヘッダー (選択済み) の下でエクスポートするセクションを選択し、[適用] を押します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル6:「ステップ」のリスト/ファイルウィンドウのパラメータ。 txtヘッダー(選択済み)>ステップでエクスポートするステップデータを選択し、[適用]を押します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル7:「ビート」のリスト/ファイルウィンドウのパラメータ。ビート>txtヘッダー(選択済み)の下にエクスポートする値を選択し、Apply!を押します。BRS分析では、チェックされたパラメータが必要です。数字で示されている選択の順序に注意してください。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 8: テンプレート BRS スプレッドシート ファイル。 アップシーケンスとダウンシーケンスの自動ソートと分析のためのスプレッドシートテンプレート。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 9: 結果ファイル I からの関連データのコピー 結果ファイルから列(圧力)_BRS_deltaP、(圧力)_BRS_#、および(圧力)_BRS_slopeをコピーします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 10: データの並べ替えと分析のためのスプレッドシート テンプレート ファイル (TemplateBRS) I. コピーしたデータを、TemplateBRS スプレッドシート ファイルの "アップ シーケンス" スプレッドシートとダウン シーケンス" スプレッドシートのそれぞれの列に貼り付けます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 11: 結果ファイルからの関連データのコピー II. 結果ファイルから列(圧力)_BRS_SBPをコピーします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 12: データのソートと分析のためのスプレッドシートテンプレートファイル (TemplateBRS) II. コピーしたSBPデータをTemplateBRSスプレッドシートファイルの「すべてのシーケンス」スプレッドシートに貼り付けて、シーケンスの総数を計算します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル13:シーケンスのフィルタリングと分析。 TemplateBRS スプレッドシート ファイルの "アップ シーケンス" スプレッドシートで、(圧力)_BRS_# 列フィルターのドロップダウン メニューを開き、パラメーターを変更せずに [OK ] を押します。これにより、データが自動的にソートされ、3ビートのシーケンスの計算が更新されます。「ダウンシーケンス」スプレッドシートに対してこれを繰り返します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル14:ECGおよびBP分析ソフトウェアで検出された高品質の記録のスクリーンショット。 上のトレース(ECG)は各Rピークの検出を示し、下のトレース(BP)は各拡張期血圧(DP)および収縮期血圧(SP)ピークの検出を示します。正常に検出されたピークの下の領域は赤でマークされます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル15:BPパラメータが部分的にしか検出されない低品質のBP記録のスクリーンショット。 上のトレース(ECG)は各Rピークの検出を示し、下のトレース(BP)は検出されたBPピーク間のギャップを示します。拡張期血圧(DP)と収縮期血圧(SP)の検出されたピークは、赤い領域でマークされています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル16:ECGおよびBPパラメータを検出できなかった低品質のECGおよびBP記録のスクリーンショット。 上のトレース(ECG)は、ECGパラメータを検出できなかった領域(紫色の背景)を示しています。BP検出(低トレース)も信号品質が低いため失敗しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

代替方法に関するこの方法の意義
本研究では、シーケンス法を用いて自発的なBRSを定量するための詳細なプロトコルを提示する。このアプローチは、ECGおよびBPテレメトリによって測定された自発的な血圧および反射HRの変化を利用します。この方法の利点は、測定が行われる部屋に足を踏み入れることによって、または薬物の注射に必要な物理的相互作用によってさえ、動物を邪魔することなく、意識のある、自由に動く、拘束されていない動物に両方のパラメータを記録できることです。このような障害がHRおよびBPの記録に深刻な干渉を与えることが明確に示されているため、この点は非常に重要です。例えば、薬物の注射はマウスの固定を必要とし、それはHRを650〜700bpmまで増加させる最大ストレス応答を引き起こす。これらのストレス応答を回避するために、BRSは麻酔をかけたマウスにおいて以前に決定されている。しかし、ケタミン/キシラジンやイソフルランなどの獣医学で使用される標準的な麻酔薬は徐脈を誘発し、自律神経反射反応に影響を与えるため、これらのアプローチの妥当性と結果の解釈が制限されています。これらの制限を部分的に克服するために、埋め込み型薬物送達装置、すなわち、腹腔内に薬物を放出することができる浸透圧ポンプが使用された。しかしながら、浸透圧ポンプでは、そのような装置の適用を制限する規定用量の薬物のボーラスを適用することは不可能である。あるいは、複雑な輸液カテーテル17 薬物を投与するためにマウスに移植することができる。ただし、これらのカテーテルは取り扱いが難しく、テレメトリデバイスの埋め込みに必要なものに匹敵する外科的スキルが必要ですが、自発的なBRSの測定と比較して科学的結果は低くなります。薬物の注射を使用したBRSの測定に関連する技術的な問題に加えて、薬物作用自体に関連するいくつかの制限があります。BRSを決定するための伝統的なアプローチには、血管作用薬のボーラス注射が含まれます。しかし、血管収縮薬(例えば、フェニレフリン)または血管拡張薬(例えば、ニトロプルシドナトリウム)のボーラス注射は、BPの変化に対する反射HR適応のための過剰かつ非生理学的刺激と考えられてきた。18.圧受容器反射の自発的活動は、スペクトル法を用いて定量化することもできる。これらの方法の1つは、特定の周波数帯域における心拍数の変化と血圧の変化の比率を計算することにより、周波数領域でBRSを評価します。18,19.他のスペクトル法には、BPとHRの伝達関数の決定、またはBPとHRの間のコヒーレンスの定量化が含まれます。20,21.これらの方法は、自発的なBPおよびHRパラメータのテレメトリ取得も必要とし、自発的なBRSの決定には適していますが、集中的な計算ツールが必要であり、適用が困難です。さらに、すべてのスペクトル法は、非定常信号がスペクトル法の適用を妨げるという制限に悩まされています。特に、呼吸リズムによって誘発されるスペクトルピークは、患者に呼吸を止めるように頼むことによってヒト患者で減少させることができるが、これはマウスでは明らかに不可能である。したがって、マウスでは信号対雑音比が非常に低いことがよくあります。上記の方法の限界を考えると、マウスのBRSを決定するためのシーケンス法を支持します。この方法の大きな利点は、実生活条件下での自発的なBRSに関するデータを提供する非侵襲的手法であるという事実です。22.もう1つの重要な点は、シーケンス法を使用して分析されたシーケンスの持続時間が非常に短く、3〜5拍が含まれることです。迷走神経によるHRの反射調節は非常に速く、これらのシーケンスの時間枠内で十分に可能です。したがって、シーケンス法は、BRSに対する迷走神経の寄与を評価するのに非常に適しています。対照的に交感神経系による調節ははるかに遅い。実際、これらの短いシーケンスの間、交感神経系の活動はほぼ一定であると仮定することができます。したがって、この方法は、迷走神経活動によって駆動されるHRの反射変化を選択的に検出するようにカスタマイズされる。

BRSデータの解釈
BRS機能障害またはBRSデータ自体の解釈のためには、圧受容器反射に関与する個々の機能レベルを考慮することが重要です。ニューロンレベルでは、反射の求心性、中枢性または遠心性の成分が影響を受ける可能性があります23。心血管レベルでは、ANS入力に対する洞房結節の応答性の低下または誇張が存在する可能性があります11,24。各レベルでの変更は、BRS の変更につながる可能性があります。ニューロンおよび/または心臓のメカニズムがBRSの観察された変化の原因であるかどうかを分析するために、心臓またはニューロン特異的な遺伝子欠失、ノックダウンまたは遺伝子編集アプローチを使用できます。

プロトコルの重要なステップ
このプロトコルで最も洗練された重要なステップは、左頸動脈の準備とカニューレ挿入です(ステップ2.3)。尾側閉塞縫合糸の張力は、カニューレ挿入前に血流を完全に停止させるのに十分高くなければならない。そうしないと、カニューレ挿入中のわずかな血液漏れでも、視界が大幅に制限されたり、マウスが出血して死亡したりする可能性があります。カニュレーションは最初の試みで成功するはずです。ただし、最初の試行が失敗した場合でも、カニューレ挿入を慎重に再試行することは可能です。

正中線切開と首から左脇腹までの皮下トンネル(ステップ2.3)は、力を入れずに送信機を簡単に導入するのに十分な大きさである必要がありますが、送信機を所定の位置に保つためにできるだけ小さくする必要があります。それ以外の場合は、縫合材料または組織接着剤で所定の位置にロックする必要があります。マウスは非常にデリケートな皮膚を持っているので、送信機のトンネルが小さすぎると皮膚の壊死が起こる可能性があります。

ECG電極が長すぎて皮下トンネルに収まらない場合(ステップ2.4)、電極を適切な長さに短くして新しいチップを形成する必要があります。電極は、リードの全長にわたって本体に対して平らになければなりません。電極が長すぎると動物が邪魔になり、傷口を開いて伝達物質を外そうとし、組織の炎症や創傷裂開のリスクがあります。もちろん、短すぎるリード線は延長できず、この場合、アイントホーフェンIIの構成に対応するように電極を配置できない場合があります。したがって、同じ性別、体重、および遺伝的背景の死んだマウスのECGリードの最適な長さを決定することをお勧めします。

マウスが正常な概日リズムを持たず、これが研究中のマウス系統の表現型ではない場合、伝達物質移植後の回復時間を長くする必要があります(ステップ2.7)。概日リズムの乱れの別の理由は、動物施設または測定中に部屋に入る人員の不十分な音響隔離である可能性があります。

ECG、BP、BRSのデータ分析は簡単です(ステップ2.8)。最も重要なステップは、異所性拍動、洞休止、不整脈エピソード、または低品質の信号を含むセクションをデータ分析から除外することです。

開示事項

何一つ

謝辞

この研究は、ドイツ研究財団[FE 1929/1-1およびWA 2597/3-1]の支援を受けました。優れた技術支援を提供してくれたサンドラ・ディルシュルと獣医のアドバイスをしてくれたジュリア・リリングに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mLCP-Pharma, Germany1229anesthesia
B.Braun Injekt-F 1 mL syringeWolfram Droh GmbH, Germany9166017V
Bepanthen eye and nose ointmentBayer AG, Germany
Blunt dissecting scissorsFine Science Tools GmbH, Germany14078-10
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mLCP-Pharma, Germany115preemptive and post-operative pain relief
Cutasept F skin desinfectantBODE Chemie GmbH, Germany9803650
Cotton Tipped Applicator sterilePaul Boettger GmbH & Co. KG, Germany09-119-9100
Forceps - Micro-Blunted TipsFine Science Tools GmbH, Germany11253-25
Forceps - straightFine Science Tools GmbH, Germany11008-13
Gauze swabs with cut edges, 7.5x7.5 cm, cottonPaul Hartmann AG. Germany401723
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters Data Sciences International, United States
Homothermic blanket system with flexible probeHarvard Apparatus, United States
Hot bead sterilizerFine Science Tools GmbH, Germany18000-45
Ketamine 10%Ecuphar GmbH, Germany799-760anesthesia
MagnetData Sciences International, United Statestransmitter turn on/off
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutterFine Science Tools GmbH, Germany12502-12
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mmHenke-Sass Wolf GmbH, Germany471000552524 G needle
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mmHenke-Sass Wolf GmbH, Germany471000402027 G needle
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided)Resorba Medical, GermanyPA10273lead fixation
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided)Resorba Medical, Germany4023skin closure
OPMI 1FR pro, Dissecting microscopeZeiss, Germany
Pilca depilatory mousseWerner Schmidt Pharma GmbH, Germany6943151
PVP-Iodine hydrogel 10%Ratiopharm, Germany
Ringer's lactate solutionB. Braun Melsungen AG, Germany401-951                                                              
Sensitive plasters, LeukosilkBSN medical GmbH, Germany102100surgical tape
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 mlB. Braun Melsungen AG, Germany
Surgibond tissue adhesiveSMI, BelgiumZG2
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided)Resorba Medical, GermanyG2105lead preparation, ligation sutures
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1Procter & Gamble
Vessel Cannulation ForcepsFine Science Tools GmbH, Germany18403-11
Xylazine (Xylariem) 2%Ecuphar GmbH, Germany797469anesthesia
Data acquisition and analysisSource
DSI Data Exchange MatrixData Sciences International, United States
DSI Dataquest ART 4.33Data Sciences International, United Statesdata aquisition software
DSI PonemahData Sciences International, United Statesdata aquisition software
DSI PhysioTel HDX-11 for miceData Sciences International, United States
DSI PhysioTel receivers RPC1Data Sciences International, United States
ecgAUTO v3.3.5.11EMKA TechnologiesECG and BP analysis software
Microsoft ExcelMicrosoft Corporation, United States

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