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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe el proceso paso a paso para construir estimuladores eléctricos y magnéticos utilizados para estimular los tejidos biológicos. El protocolo incluye una directriz para simular campos computacionalmente eléctricos y magnéticos y la fabricación de dispositivos estimuladores.

Resumen

Los campos eléctricos (EF) y los campos magnéticos (MFs) han sido ampliamente utilizados por la ingeniería de tejidos para mejorar la dinámica celular como la proliferación, migración, diferenciación, morfología y síntesis molecular. Sin embargo, variables tales tiempos de fuerza y estimulación de estímulos deben considerarse al estimular las células, tejidos o andamios. Dado que los EF y los MFs varían según la respuesta celular, no está claro cómo construir dispositivos que generen estímulos biofísicos adecuados para estimular muestras biológicas. De hecho, hay una falta de evidencia con respecto al cálculo y distribución cuando se aplican estímulos biofísicos. Este protocolo se centra en el diseño y fabricación de dispositivos para generar EF y MFs e implementación de una metodología computacional para predecir la distribución de estímulos biofísicos dentro y fuera de muestras biológicas. El dispositivo EF estaba compuesto por dos electrodos paralelos de acero inoxidable situados en la parte superior e inferior de los cultivos biológicos. Los electrodos se conectaron a un oscilador para generar voltajes (50, 100, 150 y 200 Vp-p) a 60 kHz. El dispositivo MF se componía de una bobina, que estaba energizada con un transformador para generar una corriente (1 A) y voltaje (6 V) a 60 Hz. Se construyó un soporte de metacrilato de polimetilo para localizar los cultivos biológicos en medio de la bobina. La simulación computacional elucidaba la distribución homogénea de efs y MFs dentro y fuera de los tejidos biológicos. Este modelo computacional es una herramienta prometedora que puede modificar parámetros como voltajes, frecuencias, morfologías tisulares, tipos de placas de pozo, electrodos y tamaño de bobina para estimar los EFs y MFs para lograr una respuesta celular.

Introducción

Se ha demostrado que los EF y los MFs modifican la dinámica celular, estimulando la proliferación y aumentando la síntesis de las moléculas principales asociadas con la matriz extracelular de los tejidos1. Estos estímulos biofísicos se pueden aplicar de diferentes maneras mediante el uso de ajustes y dispositivos específicos. En cuanto a los dispositivos para generar EF, los estimuladores directos de acoplamiento utilizan electrodos que están en contacto con muestras biológicas in vitro o implantadas directamente en tejidos de pacientes y animales in vivo2; sin embargo, todavía hay limitaciones y deficiencias que incluyen biocompatibilidad insuficiente por los electrodos en contacto, cambios en los niveles de pH y oxígeno molecular1. Por el contrario, los dispositivos de acoplamiento indirecto generan EF entre dos electrodos, que se colocan en paralelo a las muestras biológicas3,permitiendo una técnica alternativa no invasiva para estimular muestras biológicas y evitar el contacto directo entre tejidos y electrodos. Este tipo de dispositivo se puede extrapolar a futuras aplicaciones clínicas para realizar procedimientos con una mínima invasión al paciente. En relación con los dispositivos que generan MFs, los estimuladores de acoplamiento inductivos crean una corriente eléctrica que varía el tiempo, que fluye a través de una bobina que se encuentra alrededor de los cultivos celulares4,5. Por último, hay dispositivos combinados, que utilizan EFs y MFs estáticos para generar campos electromagnéticos transitorios1. Dado que existen diferentes configuraciones para estimular muestras biológicas, es necesario considerar variables como la tensión y la frecuencia cuando se aplican estímulos biofísicos. El voltaje es una variable importante, ya que influye en el comportamiento de los tejidos biológicos; por ejemplo, se ha demostrado que la migración celular, la orientación y la expresión génica dependen de la amplitud de la tensión aplicada3,6,7,8,9,10. La frecuencia juega un papel importante en la estimulación biofísica, ya que se ha demostrado que estos ocurren naturalmente in vivo. Se ha demostrado que las frecuencias altas y bajas tienen efectos beneficiosos en las células; especialmente, en los canales de calcio cerrados por voltaje de membrana celular o reticulum endoplasmático, que desencadenan diferentes vías de señalización en el nivel intracelular1,7,11.

Según lo anterior, un dispositivo para generar EF consiste en un generador de voltaje conectado a dos capacitores paralelos12. Este dispositivo fue implementado por Armstrong et al. para estimular tanto la tasa proliferativa como la síntesis molecular de los condrocitos13. Una adaptación de este dispositivo fue realizada por Brighton et al. que modificaron las placas de cultivo celular perforando sus tapas superiores e inferiores. Los agujeros se llenaron con toboganes de cubierta, donde las gafas inferiores se utilizaban para cultivo de tejidos biológicos. Se colocaron electrodos en cada diapositiva de cubierta para generar efs14. Este dispositivo se utilizó para estimular eléctricamente condrocitos, osteoblastos y explantas de cartílago, mostrando un aumento en la proliferación celular14,15,16 y síntesis molecular3,17. El dispositivo diseñado por Hartig et al. consistía en un generador de ondas y un amplificador de voltaje, que estaban conectados a capacitores paralelos. Los electrodos estaban hechos de acero inoxidable de alta calidad ubicados en una caja aislante. El dispositivo se utilizó para estimular los osteoblastos, mostrando un aumento significativo en la proliferación y secreción de proteínas18. El dispositivo utilizado por Kim et al. consistía en un chip estimulador de corriente bifásico, que fue construido utilizando un proceso de fabricación de semiconductores complementarios de óxido metálico de alta tensión. Una placa de cultivo fue diseñada para cultivo de células sobre una superficie conductora con estimulación eléctrica. Los electrodos estaban recubiertos de oro sobre placas de silicio19. Este dispositivo se utilizó para estimular los osteoblastos, mostrando un aumento en la proliferación y la síntesis del factor de crecimiento endotelial vascular19,y estimulando la producción de actividad alcalina fosfatasa, deposición de calcio y proteínas morfogénicas óseas20. Del mismo modo, este dispositivo se utilizó para estimular la tasa proliferativa y la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular de las células madre mesenquimales de médula ósea humana21. El dispositivo diseñado por Nakasuji et al. estaba compuesto por un generador de voltaje conectado a placas de platino. Los electrodos fueron construidos para medir el potencial eléctrico en 24 puntos diferentes. Este dispositivo se utilizó para estimular los condrocitos, mostrando que los EF no alteraron la morfología celular y aumentaron la proliferación y la síntesis molecular22. El dispositivo utilizado por Au et al. consistía en una cámara de vidrio equipada con dos barras de carbono conectadas a un estimulador cardíaco con alambres de platino. Este estimulador se utilizó para estimular los cardiomiocitos y fibroblastos, mejorando la elongación celular y la alineación de fibroblastos23.

Diferentes dispositivos MF se han fabricado sobre la base de bobinas Helmholtz para estimular varios tipos de muestras biológicas. Por ejemplo, las bobinas Helmholtz se han utilizado para estimular la proliferación y síntesis molecular de condrocitos24,25,mejorar la síntesis proteoglycan de explantas de cartílago articular26,mejorar la regulación genética relacionada con la formación ósea de células similares a osteoblastos27,y aumentar la proliferación y expresión molecular de las células endoteliales28. Las bobinas Helmholtz generan MFs a lo largo de dos bobinas ubicadas una delante de la otra. Las bobinas deben colocarse con una distancia igual al radio de las bobinas para garantizar un MF homogéneo. La desventaja de usar bobinas Helmholtz radica en las dimensiones de la bobina, ya que necesitan ser lo suficientemente grandes como para generar la intensidad MF requerida. Además, la distancia entre bobinas debe ser adecuada para garantizar una distribución homogénea de los MFs alrededor de los tejidos biológicos. Para evitar problemas causados por las bobinas Helmholtz, diferentes estudios se han centrado en la fabricación de bobinas solenoides. Las bobinas solenoides se basan en un tubo, que se enrolla con alambre de cobre para generar MFs. Las entradas de alambre de cobre se pueden conectar directamente a la toma de corriente o a una fuente de alimentación para energizar la bobina y crear MFs en el centro del solenoide. Cuantos más giros tenga la bobina, mayor será el MF generado. La magnitud MF también depende de la tensión y corriente aplicadas para energizar la bobina29. Las bobinas solenoides se han utilizado para estimular magnéticamente diferentes tipos de células como HeLa, HEK293 y MCF730 o células madre mesenquimales31.

Los dispositivos utilizados por diferentes autores no han considerado ni el tamaño adecuado de los electrodos ni la longitud correcta de la bobina para distribuir homogéneamente tanto los EFs como los MFs. Además, los dispositivos generan voltajes fijos y frecuencias, limitando su uso para estimular tejidos biológicos específicos. Por esta razón, en este protocolo se realiza una guía de simulación computacional para simular tanto sistemas capacitivos como bobinas para garantizar una distribución homogénea de efs y MFs sobre muestras biológicas, evitando el efecto borde. Además, se muestra que el diseño de circuitos electrónicos genera voltajes y frecuencia entre los electrodos y la bobina, creando EFs y MFs que superarán las limitaciones causadas por la impedancia de las placas y el aire del cultivo celular. Estas modificaciones permitirán la creación de biorreactores no invasivos y adaptativos para estimular cualquier tejido biológico.

Protocolo

1. Simulación de EF y MFs

NOTA: La simulación de efs y MFs se realizó en MULTIFÍSica COMSOL.

  1. Seleccione una configuración 2D axisymmétrica para representar tanto dominios eléctricos como magnéticos.
  2. En la configuración física, seleccione la interfaz corriente eléctrica para calcular los EFs en electrodos paralelos o la interfaz campo magnético para calcular los MFs alrededor de las bobinas.
  3. En la configuración del estudio, seleccione Dominio de frecuencia para calcular la respuesta de un modelo lineal o linealizado sometido a excitación armónica para una o varias frecuencias.
  4. Una vez dentro de la interfaz para empezar a construir el modelo, siga los pasos siguientes según el modelo del interés.
    1. Construcción de un modelo para efs
      1. Crear geometrías. En el Generador demodelos, seleccione Geometría. A continuación, localice la sección Unidades y elija mm. En la barra de herramientas Geometría, seleccione Rectángulo y escriba las dimensiones de cada componente en el cuadro Tamaño y forma de la configuración de la ventana Rectángulo . La geometría se compone por aire, dos electrodos paralelos, una placa de cultivo, medios de cultivo y una muestra biológica, que en este caso está representada por un andamio de ácido hialurónico - hidrogel gelatina (ver dimensiones de cada elemento en la Tabla 1). Una vez creadas todas las geometrías, haga clic en Crear todos los objetos.
      2. Crear selecciones. En la barra de herramientas Definiciones, haga clic en Explícito para crear una selección para el dominio de metal. Seleccione las geometrías que representan los electrodos. Después, haga clic con el botón derecho en Explicit 1 para cambiarle el nombre. Escriba Metal en el nuevo campo de texto de etiqueta.
        1. Por otro lado, en la barra de herramientas Definiciones, haga clic en Complementar. Busque la sección Entidades de entrada en la ventana Configuración de complemento. A continuación, en Selecciones para invertir, haga clic en Agregar y seleccione Metal en la lista Selecciones para invertir en el cuadro de diálogo Agregar. A partir de entonces, haga clic con el botón derecho en Complementar 1 para cambiarle el nombre. Escriba Model domain en el nuevo campo de texto de etiqueta.
      3. Crear límites. Haga clic en Explícito en la barra de herramientas Definiciones. Después, busque la sección Entidades de entrada en la ventana Configuración de Explicit y en la lista Nivel de entidad geométrica, elija Boundary. Aquí, seleccione todos los límites para el electrodo inferior. Haga clic con el botón derecho en Explícito 2 para cambiarle el nombre. Escriba Límites de tierra en el nuevo campo de texto de etiqueta. Repita estos pasos, pero seleccionando todos los límites para el electrodo superior. A partir de entonces, haga clic con el botón derecho en Explícito 3 para cambiarle el nombre. Escriba Límites de terminal en el nuevo campo de texto de etiqueta.
      4. Añadir corrientes eléctricas. En la ventana Generador de modelos, en Componente 1, haga clic en Corrientes eléctricas (ec). A continuación, busque la sección Selección de dominio en la ventana Configuración de corrientes eléctricas. En la lista Selección, elija Dominio de modelo. En la barra de herramientas Física, haga clic en Límites y elija Tierra. Después, busque la sección Selección de límites en la ventana Configuración de suelo y elija Límites de suelo en la lista Selección.
        1. A partir de entonces, haga clic en Límites y elija Terminal en la barra de herramientas Física. Por último, busque la sección Selección de límites en la ventana Configuración del terminal y elija Límites del terminal en la lista Selección; aquí, localice la sección Terminal y elija Voltage en la lista Terminal y escriba 100 V.
      5. Añadir materiales. Haga clic en Agregar material en la barra de herramientas inicio para abrir la ventana Agregar material. Busque aire y acero inoxidable y agréguelos a la ventana Model Builder. A continuación, haga clic en Material en blanco en la barra de herramientas Inicio y agregue tres nuevos materiales en blanco para medios de cultivo, andamios (hidrogel) y poliestireno (bienplacable de cultivo).
      6. Seleccione un material en blanco para asignar las propiedades dieléctricas. Busque la lista Propiedades de material en la ventana Configuración de material y seleccione Permisividad relativa y conductividad eléctrica en la lista de opciones Propiedades básicas. Las propiedades dieléctricas para medios de cultivo, hidrogel y bienplacería de cultivo están en la Tabla 2. Repita este procedimiento para todos los materiales en blanco.
      7. Asigne cada material a las geometrías previamente construidas. Seleccione el material de aire en la ventana Generador de modelos; a continuación, seleccione los dominios que corresponden al aire desde la ventana Gráfico. Repita este paso para todos los materiales creados. Asegúrese de que cada dominio corresponde al material correcto. Para asegurarse de que todos los materiales están correctamente asignados, haga clic en cada material desde la ventana Generador de modelos y observe si los dominios se resaltan en azul dentro de la ventana Gráfico.
      8. Construir malla. Haga clic con el botón derecho en Malla 1 en la ventana Generador de modelos y seleccione Triangular libre. Repita este paso seleccionando Tamaño. En la ventana Configuración de malla, seleccione Malla controlada por el usuario en la lista Tipo de secuencia. A continuación, expanda las opciones de malla en la ventana Generador de modelos y haga clic en Tamaño.
      9. Localice parámetros de tamaño de elemento en la ventana Ajuste de tamaño y escriba 1 mm para el tamaño máximo del elemento, 0,002 mm para el tamaño mínimo del elemento, 1,1 para la velocidad máxima de crecimiento del elemento, 0,2 para el factor de curvatura y 1 para la resolución de regiones estrechas. A continuación, expanda las opciones de malla en la ventana Generador de modelos y haga clic en Triangular libre 1. Aquí, seleccione todos los dominios que desea mallar. Por último, haga clic en Compilar todo en la ventana Configuración de malla.
      10. Crear estudio. Haga clic en Estudio 1 en la ventana Generador de modelos. A continuación, busque la sección Configuración del estudio en la ventana Configuración del estudio y desactive la casilla Generar trazados predeterminados. Expanda el nodo Estudio 1 en la ventana Generador de modelos y haga clic en Paso 1: Dominio de frecuencia. Por último, busque la sección Configuración de estudio en la ventana Configuración del dominio de frecuencia y escriba 60 kHz en el campo de texto Frecuencias.
      11. Calcular estudio. Haga clic en Mostrar solucionador predeterminado en la barra de herramientas Estudio. A continuación, expanda el nodo Estudiar 1 Configuraciones del solucionador en la ventana Generador de modelos. Expanda el nodo Solución 1 (sol1) en la ventana Generador de modelos; a continuación, haga clic en Solucionador estacionario 1 en la ventana Configuración del solucionador estacionario y localice la sección General y escriba 1e-6 en el campo de texto Tolerancia relativa. Por último, haga clic en Calcular en la barra de herramientas Estudio.
      12. Resultados de la trama. Seleccione la sección Resultados en la barra de herramientas Inicio y agregue Grupo de trazado 2D. A continuación, haga clic con el botón derecho en Grupo de trazado 2D 1 en la ventana Generador de modelos y elija Superficie. A continuación, busque la sección Datos en la ventana Configuración de superficie y seleccione Precursor. Después, busque la sección Expresión en la ventana Configuración de superficie; aquí, haga clic en el símbolo más (+) para abrir una nueva ventana y localizar la ruta de seguimiento de la lista de selección (Modelo - Componente 1 - Corrientes eléctricas - Eléctrica). Aquí, seleccione ec.normE - Ef Norm. Por último, haga clic en Gráfico en la ventana Configuración de superficie para trazar los resultados.
    2. Construcción de un modelo para MFs
      1. Crear geometrías. En el Generador de modelos, seleccione Geometría; a continuación, localice la sección Unidades y elija mm. En la barra de herramientas Geometría, seleccione Rectángulo y escriba las dimensiones de cada componente en el cuadro Tamaño y forma de la Configuración de la ventana Rectángulo . La geometría se compone por aire y cooper (consulte las dimensiones de cada elemento de la Tabla 1). Una vez creadas todas las geometrías, haga clic en Crear todos los objetos.
      2. Añadir materiales. Haga clic en Agregar material en la barra de herramientas inicio para abrir la ventana Agregar material. Busque aire y cobre y agréguelos a la ventana Generador de modelos. Las propiedades dieléctricas del cobre se encuentran en la Tabla 2.
      3. Crear límites. Haga clic en Campo magnético en la ventana Generador de modelos. Aquí, busque la lista Ecuación en la ventana Configuración de campos magnéticos y elija Ecuación de dominio de frecuencia en la lista Formulario de ecuación. En la lista Frecuencia elija De solucionador. Después, localice Ampere's Law on the Magnetic Field lista en la ventana Model Builder. En el tipo 293.15[K] en temperatura, 1[atm] en presión absoluta de la lista del modelo de entradas. A continuación, elija Sólido en la lista Tipo de material en la ventana Configuración de la ley del amperio. Asegúrese de que la conductividad eléctrica, la permisividad relativa y la permeabilidad relativa correspondan al material De de la lista.
      4. Busque Axial Symmetry en la lista Campo magnético en la ventana Generador de modelos. Asegúrese de que la línea de simetría axial esté resaltada tanto en la lista Selección de límites como en la ventana Gráfico. A continuación, busque Aislamiento magnético en la lista Campo magnético en la ventana Generador de modelos. Asegúrese de que los límites de la geometría se resaltan tanto en la lista Selección de contorno como en la ventana Gráfico.
      5. Busque Valores iniciales en la lista Campo magnético en la ventana Generador de modelos. Seleccione geometrías creadas anteriormente e incluírlas en la Selección de dominio desde la ventana Configuración de valores iniciales.
      6. Introducir entidades de bobina. Busque Varias bobinas en la lista Campo magnético en la ventana Generador de modelos. Aquí, selecciona la geometría que representa la bobina e incluyéndolas en la Selección de dominio desde la ventana Configuración de varias bobinas.
      7. Busque la lista Varias bobinas en la ventana Configuración de bobina múltiple; aquí, localizar Coil excitation lista y seleccione Actual; a partir de entonces, escriba 1[A] en la lista actual de Bobinas, 450 en el Número de giros y 6e7[S/m] en la conductividad de la bobina.
      8. Localice el área transversal del cable de bobina y elija diámetro de cable norteamericano (Marrón y Afilado) de la lista y escriba 18 en la opción AWG. Asegúrese de que la permisividad relativa y la permeabilidad relativa corresponden al material De en la lista.
      9. Construir malla. En la ventana Configuración de malla, seleccione Malla controlada por la física en la lista Tipo de secuencia. Después, busque Parámetros de tamaño de elemento en la ventana Configuración de malla y seleccione Extremadamente fino. Por último, seleccione todos los dominios que se mallen y haga clic en Compilar todo en la ventana Configuración de malla.
      10. Crear estudio. Haga clic en Estudio 1 en la ventana Generador de modelos. A continuación, busque la sección Configuración del estudio en la ventana Configuración del estudio y desactive la casilla Generar trazados predeterminados. Expanda el nodo Estudio 1 en la ventana Generador de modelos y haga clic en Paso 2: Dominio de frecuencia. Por último, busque la sección Configuración de estudio en la ventana Configuración de dominio de frecuencia y escriba 60 Hz en el campo de texto Frecuencias.
      11. Calcular estudio. Haga clic en Mostrar solucionador predeterminado en la barra de herramientas Estudio. A continuación, expanda el nodo Estudiar 1 Configuraciones del solucionador en la ventana Generador de modelos. Expanda el nodo Solución 1 (sol1) en la ventana Generador de modelos; a continuación, haga clic en Solucionador estacionario 1 en la ventana Configuración del solucionador estacionario y localice la sección General y escriba 1e-6 en el campo Texto de tolerancia relativa. Por último, haga clic en Calcular en la barra de herramientas Estudio.
      12. Resultados de la trama. Seleccione la sección Resultados en la barra de herramientas Inicio y agregue Grupo de trazado 2D. A continuación, haga clic con el botón derecho en Grupo de trazado 2D 1 en la ventana Generador de modelos y elija Superficie. A continuación, busque la sección Datos en la ventana Configuración de superficie y seleccione Precursor.
      13. Busque la sección Expresión en la ventana Configuración de superficie. Aquí, haga clic en el símbolo más (+) para abrir una nueva ventana y localizar la ruta de seguimiento de la lista de selección (Modelo - Componente 1 - Campo magnético - Magnético). Aquí, seleccione mf.normB - Norma de densidad de flujo magnético. Por último, haga clic en Gráfico en la ventana Configuración de superficie para trazar los resultados.

2. Diseño y fabricación de los dispositivos de estimulación eléctrica y magnética

  1. El dispositivo de estimulador eléctrico
    NOTA: Está compuesto por un circuito basado en el oscilador de puente Wien y dos electrodos paralelos de acero inoxidable. El circuito es un oscilador RC de cambio de fase, que utiliza una retroalimentación positiva y negativa. El oscilador de puente Wien está compuesto por una red de retraso de plomo, que divide el voltaje de entrada mediante la combinación de dos brazos del puente: una resistencia R5 con un condensador C2 en serie, y una resistencia R6 con un condensador C3 en paralelo (Figura 1A). Estos componentes modulan la frecuencia del oscilador. Para construir el dispositivo estimulador eléctrico, siga los siguientes pasos:
    1. Calcule la frecuencia utilizando la ecuación de frecuencia resonante (1).
      figure-protocol-18322
      Donde R = R5 = R6 son resistencias y C = C2 = C3 son capacitores. Tanto R como C se colocan en los dos brazos del puente (Figura 1A). Utilice R5 = R6 = 2,6 kΩ y C2 = C3 = 1 nF para obtener una frecuencia de 60 kHz. Las resistencias y condensadores pueden calcularse si se requiere una frecuencia diferente.
    2. Diseñe el circuito de tal manera que la ganancia de voltaje del amplificador compense automáticamente los cambios de amplitud de la señal de salida. En la Figura 1A es posible observar el esquema del circuito, mientras que en la sección Tabla de materiales se enumeran los componentes electrónicos para construir el circuito.
    3. Calcule la combinación de resistencias para generar las cuatro tensiones de salida. Como se muestra en la Figura 1A, utilice una combinación de resistencias R11, R12, R13 y R14 (resistencia equivalente de 154 Ω) para generar una tensión de 50 Vp-p; resistencias R17, R18 y R19 en serie (resistencia equivalente de 47,3 Ω) para obtener una tensión de 100 Vp-p; resistencias R9 y R10 en serie (resistencia equivalente de 25,3 Ω) para generar una tensión de 150 Vp-p; y una combinación de resistencias R15 y R16 (resistencia equivalente de 16,8 Ω) para obtener una tensión de 200 Vp-p.
    4. Utilice un transistor (TIP 31C) y un transformador de núcleo de ferrita para implementar una etapa de amplificación de señal. Un núcleo de ferrita toroidal se utilizó para enrollar un cable de cobre AWG 24, completando una relación 1:200. Utilice dos capacitores (C4 y C5) de 100 nF en paralelo antes del transformador para rectificar la señal (Figura 1A).
    5. Prepare el PCB utilizando un servicio de fabricación de PCB de terceros. El diagrama esquemático del circuito se proporciona en la figura 1. Coloque todos los componentes en el PCB con pinzas antiestáticas. Utilice soldadura de estaño y soldador para soldar todos los componentes.
    6. Fabricar una caja de plástico con conectores de entrada para proteger el circuito. Implemente tres conectores de entrada para energizar el circuito (12 V, -12 V y tierra). Utilice dos conectores de entrada para conectar los electrodos. Incluya tres interruptores para cambiar la combinación de resistencias para obtener los cuatro voltajes de salida. Montar el circuito electrónico en la caja de plástico (Figura 1B).
    7. Fabricar dos electrodos paralelos de acero inoxidable (200 x 400 x 2 mm) y conectores de entrada de soldadura a cada borde. Los electrodos se encuentran sobre teflón o soportes acrílicos para eliminar cualquier contacto con la superficie metálica de la incubadora(Figura 1C).
    8. Utilice un autoclave a 394,15 K (121 °C) durante 30 minutos para esterilizar los electrodos y utilizar ultravioleta durante la noche para esterilizar los cables que están en contacto con la incubadora.
    9. Pruebe el dispositivo de estimulación eléctrica. Ajuste la fuente de alimentación en serie para generar una tensión de salida de +12 V y -12 V entre el suelo y terminales positivos y negativos. Verifique la tensión de salida de la fuente de alimentación con un multímetro. Conecte cada salida de la fuente de alimentación en la entrada correcta del estimulador eléctrico (+12 V, -12 V y tierra). Conecte cada electrodo en el conector de entrada correcto del estimulador eléctrico. La polaridad no es importante, ya que estamos trabajando en la corriente de CA. Coloque una placa de cultivo entre los electrodos y verifique la señal de salida con un osciloscopio. Ajuste los interruptores del estimulador eléctrico para generar los cuatro voltajes de salida (50, 100, 150 y 200 Vp-p).
    10. Recomendaciones de seguridad. Para evitar cualquier problema al transferir o retirar los electrodos de la incubadora asegúrese de que los cables no estén enredados. Desconecte los cables del oscilador antes de extraer los electrodos de la incubadora. Nunca coloque los electrodos sin los soportes acrílicos o teflones.
  2. El dispositivo estimulador magnético
    1. Calcule el número de giros para garantizar un MF homogéneo dentro de la bobina utilizando la ecuación (2), que describe el MF dentro de una bobina solenoide.
      figure-protocol-23302
      donde μ0 es la permeabilidad magnética del vacío (4π×10-7),N es el número de giros del cable de cobre, yo es la corriente, y h, que debe ser mayor que su diámetro, es la longitud de la bobina solenoide.
    2. Determinar el número de giros eligiendo una longitud (h) de 250 mm, corriente de 1 A y una Bint = 2mT.
    3. Fabricar la bobina. Construir un tubo de cloruro de polivinilo (PVC) con una longitud de 250 mm y un diámetro de 84 mm para enrollar un cable de cobre AWG 18 completando 450 vueltas (Figura 2A). Las dimensiones fueron elegidas en función del espacio disponible dentro de la incubadora.
    4. Fabricar un soporte de placa de pozo de cultivo celular. Construir un soporte de metacrilato de polimetilo (PMMA) para garantizar que las placas de 35 mm siempre se encontraban en el centro de la bobina donde los MFs son homogéneos(Figura 2A).
    5. Fabricar un transformador para aumentar la corriente del circuito. Construya un transformador con una salida de 1 A - 6 V AC para alcanzar un MF máximo de 2 mT. El voltaje de entrada del transformador era de 110 V CA a 60 Hz. Estos parámetros corresponden a la tensión de salida y la frecuencia de una salida de Sudamérica.
    6. Conecte el circuito. El transformador está conectado directamente a la toma de corriente. Utilice una resistencia variable (rheostat) para variar la corriente y generar MFs de 1 a 2 mT. Conecte un fusible para proteger el circuito (Figura 2B).
    7. Utilice ultravioleta durante la noche para esterilizar los cables que están en contacto con la incubadora. Envuelva la bobina con película elástica transparente y use etanol para esterilizar la bobina.
    8. Pruebe el dispositivo MF. Utilice un teslameter para medir la magnitud de MF dentro de la bobina. La sonda teslameter se encontraba en el centro de la bobina, permitiendo la medición de MFs y corrientes simultáneamente.
    9. Varíe la magnitud de MF. Utilice un rheostat para modificar la resistencia del circuito (Figura 2B). Se utilizó un valor de resistencia de 0,7 Ω para generar MFs de 1 mT.
    10. Recomendaciones de seguridad. Para evitar cualquier problema al transferir o extraer el solenoide de la incubadora asegúrese de que los cables no estén enredados. Desconecte los cables del transformador antes de extraer el solenoide de la incubadora. Nunca coloque el solenoide sin el soporte de PMMA. Sujete firmemente el soporte de PMMA de la base y el solenoide al transferir o retirar de la incubadora.

Resultados

Simulación computacional
Las distribuciones de efs y MFs se muestran en la figura 3. Por un lado, era posible observar la distribución homogénea de los EF en el sistema capacitivo(Figura 3A). El EF fue trazado para observar en detalle la magnitud del campo dentro de la muestra biológica (Figura 3B). Esta simulación fue útil para parametrizar el tamaño de los electrodos y fabricarlos para evitar el efecto b...

Discusión

Los tratamientos utilizados para curar diferentes patologías que afectan a los tejidos humanos son terapias farmacológicas32 o intervenciones quirúrgicas33,que buscan aliviar el dolor localmente o reemplazar los tejidos afectados por explantas o trasplantes. Recientemente, la terapia celular autóloga se ha propuesto como una terapia alternativa para tratar los tejidos lesionados, donde las células están aisladas del paciente y expandidas, a través de técnicas in vit...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero brindado por "Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnología, y la Innovación -Fondo Francisco José de Caldas- Minciencias" y la Universidad Nacional de Colombia a través de la subvención Nº 80740-290-2020 y el apoyo recibido por Valteam Tech - Investigación e Innovación para proporcionar el equipo y soporte técnico en la edición del video.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Electrical stimulator
Operational amplifierMotorolaLF-353N----
Quantity: 1
Resistors--------22 kΩ
Quantity: 1
Resistors--------10 kΩ
Quantity: 3
Resistors--------2.6 kΩ
Quantity: 2
Resistors--------2.2 kΩ
Quantity: 1
Resistors--------1 kΩ
Quantity: 1
Resistors--------220 Ω
Quantity: 2
Resistors--------22 Ω
Quantity: 5
Resistors--------10 Ω
Quantity: 1
Resistors--------6.8 Ω
Quantity: 1
Resistors--------3.3 Ω
Quantity: 2
Polyester capacitors--------1 nF
Quantity: 2
Polyester capacitors--------100 nF
Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFETToshiba2SK161----
Quantity: 1
Power transistor BJT NPNMospecTIP 31C----
Quantity: 1
Zener diodeMicrosemi1N4148----
Quantity: 1
SwitchToogle SwitchSPDT - T13----
Quantity: 3
Toroidal ferrite coreCaracol----T*22*14*8
Quantity: 1
Cooper wireGreenshine----AWG – 24
Quantity: 1
Relimate header with female housingADAFRUIT----8 pin connectors
Quantity: 1
Relimate header with female housingADAFRUIT----2 pin connectors
Quantity: 1
Female plug terminal connectorJIALUN----4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A
Quantity: 1
Aluminum Heat SinkAWIND----For TIP 31C transistor
Quantity: 1
LedCHANZON----5 mm red
Quantity: 1
Integrated circuit socket connectorTe Electronics Co., Ltd.----Double row 8-pin DIP
Quantity: 1
3 pin connectors setSTAR----JST PH 2.0
Quantity: 3
2 pin screw connectorsSTAR----For PCB
Quantity: 1
3 pin screw connectorsSTAR----For PCB
Quantity: 1
Banana connector test leadJIALUN----P1041 - 4 mm - 15 A
Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge leadJIALUN----4 mm male-male/female-female adapters - 15 A
Quantity: 1
Case--------ABS
Quantity: 1
Electrodes--------Stainless – steel
Quantity: 2
Electrode support--------Teflon
Quantity: 2
Printed circuit boardQuantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wireGreenshine----AWG – 18
Quantity: 1
AC power plugs--------120 V AC – 60 Hz
Quantity: 1
Banana female connector test leadJIALUN----1Set Dual Injection - 4 mm – 15 A
Quantity: 2
Banana male connector test leadJIALUN----1Set Dual Injection - 4 mm 15 A
Quantity: 1
Cell culture well plate support--------PMMA
Quantity: 1
FuseBussmann2A----
Quantity: 1
Transformer--------1A – 6 V AC
Quantity: 1
Tube--------PVC
Quantity: 1
Variable rheostatMCPBXS15010 Ω
Quantity: 1
General equipment
Digital dual source PeakTechDG 1022Z2 x 0 - 30 V / 0 - 5 A CC / 5 V / 3 A fijo
Quantity: 1
Digital OscilloscopeRigolDS1104Z Plus100 MHz, bandwidth, 4 channels
Quantity: 1
Digital multimeterFlukeF179Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz
Quantity: 1

Referencias

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