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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive il processo passo-passo per costruire stimolatori elettrici e magnetici utilizzati per stimolare i tessuti biologici. Il protocollo include una linea guida per simulare computazalmente campi elettrici e magnetici e la produzione di dispositivi di stimolazione.

Abstract

I campi elettrici (EFs) e i campi magnetici (IF) sono stati ampiamente utilizzati dall'ingegneria tissutale per migliorare la dinamica cellulare come la proliferazione, la migrazione, la differenziazione, la morfologia e la sintesi molecolare. Tuttavia, variabili come la forza degli stimoli e i tempi di stimolazione devono essere considerati quando si stimolano cellule, tessuti o impalcature. Dato che EFs e IF variano a seconda della risposta cellulare, non è chiaro come costruire dispositivi che generino adeguati stimoli biofisici per stimolare campioni biologici. In effetti, mancano prove relative al calcolo e alla distribuzione quando vengono applicati stimoli biofisici. Questo protocollo è focalizzato sulla progettazione e produzione di dispositivi per generare EFs e IF e sull'implementazione di una metodologia computazionale per prevedere la distribuzione di stimoli biofisici all'interno e all'esterno dei campioni biologici. Il dispositivo EF era composto da due elettrodi paralleli in acciaio inossidabile situati nella parte superiore e inferiore delle colture biologiche. Gli elettrodi erano collegati ad un oscillatore per generare tensioni (50, 100, 150 e 200 Vp-p) a 60 kHz. Il dispositivo MF era composto da una bobina, che era eccitata con un trasformatore per generare una corrente (1 A) e una tensione (6 V) a 60 Hz. Fu costruito un supporto di metacrilato polimetile per localizzare le colture biologiche al centro della bobina. La simulazione computazionale ha chiarito la distribuzione omogenea di EF e IF all'interno e all'esterno dei tessuti biologici. Questo modello computazionale è uno strumento promettente in grado di modificare parametri come tensioni, frequenze, morfologie tissutali, tipi di piastre di pozzo, elettrodi e dimensioni della bobina per stimare gli EF e gli IF per ottenere una risposta cellulare.

Introduzione

EFs e IF hanno dimostrato di modificare la dinamica cellulare, stimolando la proliferazione e aumentando la sintesi delle principali molecole associate alla matrice extracellulare dei tessuti1. Questi stimoli biofisici possono essere applicati in diversi modi utilizzando impostazioni e dispositivi specifici. Per quanto riguarda i dispositivi per generare EF, gli stimolatori di accoppiamento diretto utilizzano elettrodi che sono a contatto con campioni biologici in vitro o impiantati direttamente nei tessuti di pazienti e animali in vivo2; tuttavia, vi sono ancora limitazioni e carenze che includono l'insufficiente biocompatibilità da parte degli elettrodi a contatto, cambiamenti nei livelli di pH e ossigeno molecolare1. Al contrario, i dispositivi di accoppiamento indiretto generano EF tra due elettrodi, che sono collocati in parallelo aicampioni biologici 3, consentendo una tecnica alternativa non invasiva per stimolare campioni biologici ed evitare il contatto diretto tra tessuti ed elettrodi. Questo tipo di dispositivo può essere estrapolato a future applicazioni cliniche per eseguire procedure con un'invasione minima al paziente. In relazione ai dispositivi che generano MFs, gli stimolatori di accoppiamento induttivi creano una corrente elettrica variabile nel tempo, che scorre attraverso una bobina che si trova intorno allecolture cellulari 4,5. Infine, esistono dispositivi combinati, che utilizzano EFs e IF statici per generare campi elettromagnetici transitori1. Dato che ci sono diverse configurazioni per stimolare campioni biologici, è necessario considerare variabili come tensione e frequenza quando vengono applicati stimoli biofisici. La tensione è una variabile importante, poiché influenza il comportamento dei tessuti biologici; ad esempio, è stato dimostrato che la migrazione cellulare, l'orientamento e l'espressione genica dipendono dall'ampiezza della tensioneapplicata 3,6,7,8,9,10. La frequenza gioca un ruolo importante nella stimolazione biofisica, poiché è stato dimostrato che queste si verificano naturalmente in vivo. È stato dimostrato che le alte e basse frequenze hanno effetti benefici sulle cellule; in particolare, nei canali di calcio gated di tensione della membrana cellulare o reticolo endoplasmatico, che innescano diverse vie di segnalazione alivello intracellulare 1,7,11.

Secondo quanto sopra, un dispositivo per la generazione di EF è costituito da un generatore di tensione collegato a due condensatori paralleli12. Questo dispositivo è stato implementato da Armstrong et al. Un adattamento di questo dispositivo è stato eseguito da Brighton et al. I fori venivano riempiti da vetri di copertura, dove gli occhiali inferiori venivano utilizzati per coltura di tessuti biologici. Gli elettrodi sono stati posizionati su ogni vetrino di copertura per generareEFs 14. Questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare elettricamente condrociti, osteoblasti ed espianto cartilagine, mostrando un aumento della proliferazionecellulare 14,15,16 e sintesimolecolare 3,17. Il dispositivo progettato da Hartig et al. Gli elettrodi erano realizzati in acciaio inossidabile di alta qualità situato in una custodia isolante. Il dispositivo è stato utilizzato per stimolare gli osteoblasti, mostrando un significativo aumento della proliferazione e della secrezioneproteica 18. Il dispositivo utilizzato da Kim et al. Una piastra di coltura è stata progettata per coltura di cellule su una superficie conduttiva con stimolazione elettrica. Gli elettrodi erano rivestiti in oro su piastre disilicio 19. Questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare gli osteoblasti, mostrando un aumento della proliferazione e della sintesi del fattore di crescita endoteliale vascolare19e stimolando la produzione di attività fosfatasi alcalina, deposizione di calcio e proteine morfogeniche ossee20. Allo stesso modo, questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare il tasso proliferativo e l'espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseoumano 21. Il dispositivo progettato da Nakasuji et al. Gli elettrodi sono stati costruiti per misurare il potenziale elettrico in 24 punti diversi. Questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare i condrociti, dimostrando che le EF non alterano la morfologia cellulare e aumentano la proliferazione e la sintesi molecolare22. Il dispositivo utilizzato da Au et al. Questo stimolatore è stato utilizzato per stimolare cardiomiociti e fibroblasti, migliorando l'allungamento cellulare e l'allineamento deifibroblasti 23.

Diversi dispositivi MF sono stati fabbricati sulla base di bobine Helmholtz per stimolare diversi tipi di campioni biologici. Ad esempio, le bobine di Helmholtz sono state utilizzate per stimolare la proliferazione e la sintesi molecolare dei condrociti24,25, migliorare la sintesi proteoglicana degli espianto cartilaginei articolari26,migliorare l'upregolazione genica correlata alla formazione ossea delle cellule osteoblase27e aumentare la proliferazione e l'espressione molecolare delle cellule endoteliali28. Le bobine Helmholtz generano MF attraverso due bobine situate una di fronte all'altra. Le bobine devono essere posizionate con una distanza pari al raggio delle bobine per garantire un MF omogeneo. Lo svantaggio dell'uso delle bobine Helmholtz risiede nelle dimensioni della bobina, perché devono essere abbastanza grandi da generare l'intensità MF richiesta. Inoltre, la distanza tra le bobine deve essere sufficiente a garantire una distribuzione omogenea delle IF attorno ai tessuti biologici. Per evitare problemi causati dalle bobine Helmholtz, diversi studi sono stati focalizzati sulla produzione di bobine solenoidi. Le bobine solenoidi sono basate su un tubo, che viene avvolto con filo di rame per generare MFs. Gli ingressi del filo di rame possono essere collegati direttamente alla presa o a un alimentatore per energizzare la bobina e creare MFs al centro del solenoide. Più giri ha la bobina, maggiore è l'MF generato. La magnitudine MF dipende anche dalla tensione e dalla corrente applicate per energizzare la bobina29. Bobine solenoidi sono state utilizzate per stimolare magneticamente diversi tipi di cellule come HeLa, HEK293 e MCF730 o cellule staminali mesenchimali31.

I dispositivi utilizzati da autori diversi non hanno considerato né la dimensione adeguata degli elettrodi né la lunghezza corretta della bobina per distribuire in modo omogeneo sia i FE che i IF. Inoltre, i dispositivi generano tensioni e frequenze fisse, limitandone l'uso per stimolare specifici tessuti biologici. Per questo motivo, in questo protocollo viene eseguita una linea guida di simulazione computazionale per simulare sia sistemi capacitivi che bobine per garantire una distribuzione omogenea di EFs e MF su campioni biologici, evitando l'effetto bordo. Inoltre, viene dimostrato che la progettazione di circuiti elettronici genera tensioni e frequenza tra gli elettrodi e la bobina, creando EFs e IF che supereranno i limiti causati dall'impedenza delle piastre e dell'aria della coltura cellulare. Queste modifiche consentiranno la creazione di bioreattori non invasivi e adattivi per stimolare qualsiasi tessuto biologico.

Protocollo

1. Simulazione di FEI e IF

NOTA: la simulazione di EFs e IF è stata eseguita in multifisica COMSOL.

  1. Selezionare una configurazione 2D assimmetrica per rappresentare entrambi i domini elettrico e magnetico.
  2. Nella configurazione fisica, selezionate l'interfaccia Corrente elettrica per calcolare ef in elettrodi paralleli o l'interfaccia campo magnetico per calcolare le MF attorno alle bobine.
  3. Nella configurazione di studio, selezionate Dominio frequenza (Frequency Domain) per calcolare la risposta di un modello lineare o linearizzato sottoposto ad eccitazione armonica per una o più frequenze.
  4. Una volta all'interno dell'interfaccia per iniziare a costruire il modello, seguire i passaggi successivi in base al modello di interesse.
    1. Creazione di un modello per i FE
      1. Create geometrie. In Generatore di modelliselezionare Geometria. Individuare quindi la sezione Unità e scegliere mm. Sulla barra degli strumenti Geometria selezionare Rettangolo e digitare le dimensioni di ogni componente nella casella Dimensioni e forma delle impostazioni della finestra rettangolo . La geometria è composta dall'aria, due elettrodi paralleli, una piastra di pozzo di coltura, mezzi di coltura e un campione biologico, che in questo caso è rappresentato da un'impalcatura di acido ialuronico - idrogel di gelatina (vedi dimensioni di ciascun elemento nella tabella 1). Una volta create tutte le geometrie, fare clic su Compila tutti gli oggetti.
      2. Creare selezioni. Sulla barra degli strumenti Definizionifare clic su Esplicito per creare una selezione per il dominio metallico. Selezionate le geometrie che rappresentano gli elettrodi. Dopo, fare clic con il pulsante destro del mouse su Explicit 1 per rinominarlo. Digitare Metallo nel nuovo campo di testo dell'etichetta.
        1. Sulla barra degli strumenti Definizioni fare clicsu Complemento. Individuare la sezione Entità di input nella finestra Impostazioni complemento. Quindi, in Selezioni da invertire, fate clic su Aggiungi (Add) e selezionate Metallo (Metal) nell'elenco Selezioni da invertire (Selections to invert) dalla finestra di dialogo Aggiungi (Add). Successivamente, fare clic con il pulsante destro del mouse nel complemento 1 per rinominarlo. Digitare dominio modello nel nuovo campo di testo dell'etichetta.
      3. Creare limiti. Fare clic su Esplicito sulla barra degli strumenti Definizioni. Dopo, individuate la sezione Entità di input nella finestra Impostazioni per esplicito (Settings) e dall'elenco Livello entità geometrica (Geometric entity level), selezionate Limite (Boundary). Qui, selezionare tutti i limiti per l'elettrodo inferiore. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Explicit 2 per rinominarlo. Digitare i limiti di terra nel nuovo campo di testo dell'etichetta. Ripetere questi passaggi ma selezionando tutti i limiti per l'elettrodo superiore. Successivamente, fare clic con il pulsante destro del mouse su Explicit 3 per rinominarlo. Digitare Limiti terminale nel nuovo campo di testo dell'etichetta.
      4. Aggiungere correnti elettriche. Nella finestra Generatore di modelli, in Componente 1, fate clic su Correnti elettriche (ec). Individuare quindi la sezione Selezione dominio nella finestra Impostazioni correnti elettriche. Nell'elenco Selezione scegliere Dominio modello. Sulla barra degli strumenti Fisicafare clic su Limiti e scegliere Terra. Dopo, individuate la sezione Selezione limite (Boundary Selection) nella finestra Impostazioni terreno (Ground Settings) e scegliete Limiti terra (Ground boundaries) dall'elenco Selezione (Selection).
        1. Successivamente, fare clic su Limiti e scegliere Terminale sulla barra degli strumenti fisica. Infine, individuate la sezione Selezione limite (Boundary Selection) nella finestra Impostazioni terminale (Terminal Settings) e scegliete Limiti terminale (Terminal boundaries) dall'elenco Selezione (Selection). qui, individuare la sezione Terminale e scegliere Tensione dall'elenco Terminale e digitare 100 V.
      5. Aggiungere materiali. Fate clic su Aggiungi materiale (Add Material) sulla barra degli strumenti Home per aprire la finestra Aggiungi materiale (Add Material). Cerca aria e acciaio inossidabile e aggiungili alla finestra Model Builder. Quindi, fate clic su Materiale vuoto (Blank Material) sulla barra degli strumenti Home e aggiungete tre nuovi materiali vuoti per i supporti di coltura, l'impalcatura (idrogel) e il polistirolo (piastra del pozzo di coltura).
      6. Selezionate un materiale vuoto per assegnare le proprietà dielettriche. Individuate l'elenco Proprietà materiale (Material Properties) nella finestra Impostazioni materiale (Material settings) e selezionate la permittività relativa e la conducibilità elettrica dall'elenco delle opzioni Proprietà di base (Basic Properties). Le proprietà dielettriche per i mezzi di coltura, l'idrogel e la piastra di coltura sono nella tabella 2. Ripetere questa procedura per tutti i materiali vuoti.
      7. Assegnate ogni materiale alle geometrie precedentemente costruite. Selezionate il materiale dell'aria dalla finestra Generatore di modelli (Model Builder). quindi, selezionare i domini che corrispondono all'aria dalla finestra Grafica. Ripetete questo passaggio per tutti i materiali creati. Assicurarsi che ogni dominio corrisponda al materiale corretto. Per assicurarsi che tutti i materiali siano assegnati correttamente, fare clic su ogni materiale dalla finestra Generatore di modelli e osservare se i domini sono evidenziati in blu all'interno della finestra Grafica.
      8. Costruisci mesh. Fate clic con il pulsante destro del mouse su Mesh 1 nella finestra Generatore modelli (Model Builder) e selezionate Triangolare libero (Free Triangular). Ripetere questo passaggio selezionando Dimensione. Nella finestra Impostazione mesh selezionare Mesh controllato dall'utente dall'elenco Tipo sequenza (Sequence Type). Espandere quindi le opzioni Mesh nella finestra Generatore di modelli e fare clic su Dimensioni.
      9. Individuare i parametri dimensione elemento nella finestra Impostazione dimensioni e digitare 1 mm per la dimensione massima dell'elemento, 0,002 mm per la dimensione minima dell'elemento, 1,1 per il tasso massimo di crescita dell'articolo, 0,2 per il fattore di curvatura e 1 per la risoluzione delle regioni strette. Espandere quindi le opzioni Mesh nella finestra Generatore di modelli e fare clic su Triangolare libero 1. Qui, selezionare tutti i domini da mesh. Infine, fare clic su Costruisci tutto nella finestra Impostazione mesh.
      10. Crea studio. Fate clic su Studio 1 (Study 1) nella finestra Generatore modelli (Model Builder). Individuare quindi la sezione Impostazioni studio nella finestra Impostazioni studio e deselezionare la casella di controllo Genera plottamenti predefiniti. Espandere il nodo Studio 1 nella finestra Generatore di modelli e fare clic su Passaggio 1: Dominio frequenza. Individuare infine la sezione Impostazioni studio nella finestra Impostazioni dominio frequenza e digitare 60 kHz nel campo di testo Frequenze.
      11. Calcola lo studio. Fate clic su Mostra risolutore predefinito (Show Default Solver) sulla barra degli strumenti Studio (Study). Espandere quindi il nodo Configurazioni risolutore Studio 1 nella finestra Generatore di modelli. Espandere il nodo Soluzione 1 (sol1) nella finestra Generatore di modelli; Successivamente, fate clic su Risolutore stazionario 1 nella finestra Impostazioni risolutore stazionario (Stationary Solver Settings) e individuate la sezione Generale e immettete 1e-6 nel campo di testo Tolleranza relativa (Relative Tolerance). Infine, fare clic su Calcola sulla barra degli strumenti studio.
      12. Risultati della trama. Selezionare la sezione Risultati sulla barra degli strumenti Home e aggiungere 2D Plot Group. Quindi, fate clic con il pulsante destro del mouse su 2D Plot Group 1 nella finestra Generatore modelli (Model Builder) e scegliete Superficie (Surface). Individuare quindi la sezione Dati nella finestra Impostazioni superficie e selezionare Precursor. Dopo, individuate la sezione Espressione (Expression) nella finestra Impostazioni superficie (Surface Settings). qui, fare clic nel simbolo più (+) per aprire una nuova finestra e individuare il percorso seguente dall'elenco di selezione (Modello - Componente 1 - Correnti elettriche - Elettrico). Qui, selezionare ec.normE - EF Norm. Infine, fate clic su Grafica (Graphic) nella finestra Impostazioni superficie (Surface Settings) per tracciare i risultati.
    2. Creazione di un modello per i file MF
      1. Create geometrie. In Generatore di modelliselezionare Geometria; quindi, individuare la sezione Unità e scegliere mm. Sulla barra degli strumenti Geometria selezionare Rettangolo e digitare le dimensioni di ogni componente nella casella Dimensioni e forma delle impostazioni della finestra rettangolo . La geometria è composta dall'aria e dal bottaio (vedi dimensioni di ciascun elemento nella tabella 1). Una volta create tutte le geometrie, fare clic su Compila tutti gli oggetti.
      2. Aggiungere materiali. Fate clic su Aggiungi materiale (Add Material) sulla barra degli strumenti Home per aprire la finestra Aggiungi materiale (Add Material). Cerca aria e rame e aggiungili alla finestra Generatore di modelli. Le proprietà dielettriche del rame sono nella tabella 2.
      3. Creare limiti. Fate clic su Campo magnetico (Magnetics Field) nella finestra Generatore modelli (Model Builder). Individuare l'elenco Equazione nella finestra Impostazioni campi magnetici e scegliere Equazione dominio di frequenza dall'elenco Modulo equazione. Nell'elenco Frequenza scegliere Dal risolutore. Dopo, individuate la legge di Ampere nell'elenco Campo magnetico (Magnetic Field) nella finestra Generatore modelli (Model Builder). Nel tipo 293.15[K] in Temperature, 1[atm] in Absolute Pressure from the Inputs Model. Quindi, scegliete Solido (Solid) dall'elenco Tipo materiale (Material type) nella finestra Impostazioni legge di Ampere (Ampere's Law Settings). Assicurarsi che la conducibilità elettrica, la permittività relativa e la permeabilità relativa corrispondano al materiale From nell'elenco.
      4. Individua simmetria assiale nell'elenco Campo magnetico (Magnetic Field) nella finestra Generatore di modelli (Model Builder). Assicurarsi che la linea di simmetria assiale sia evidenziata sia nell'elenco Selezione limite che nella finestra Grafica. Individuare quindi Isolamento magnetico nell'elenco Campo magnetico nella finestra Generatore di modelli. Assicuratevi che i limiti della geometria siano evidenziati sia nell'elenco Selezione limite che nella finestra Grafica.
      5. Individuare Valori iniziali nell'elenco Campo magnetico nella finestra Generatore di modelli. Selezionate le geometrie create in precedenza e includetele nella selezione del dominio dalla finestra Impostazioni valori iniziali( Initial Values Settings).
      6. Introdurre le feature di bobina. Individuare Più bobine nell'elenco Campo magnetico (Magnetic Field) nella finestra Generatore di modelli (Model Builder). Qui, seleziona la geometria che rappresenta la bobina e le include nella selezione del dominio dalla finestra Impostazioni bobina multipla.
      7. Individuate l'elenco Bobina multipla (Multiple Coil) nella finestra Impostazione bobina multipla (Multiple Coil Setting). qui, individuare l'elenco eccitazione bobina e selezionare Corrente; successivamente, tipo 1[A] nell'elenco di corrente della bobina, 450 nel numero di giri e 6e7[S/m] nella conduttività della bobina.
      8. Individuate l'area di sezione trasversale del filo coil e scegliete il diametro del cavo nordamericano (Brown & Sharpe) dall'elenco e digitate 18 nell'opzione AWG. Assicurarsi che la permittività relativa e la permeabilità relativa corrispondano al materiale From nell'elenco.
      9. Costruisci mesh. Nella finestra Impostazione mesh (Mesh Setting), selezionate Mesh controllato dalla fisica (Mesh Controlled by the physics) dall'elenco Tipo sequenza (Sequence Type). Dopo, individuate i parametri dimensione elemento (Element Size Parameters) nella finestra Impostazione mesh (Mesh Setting) e selezionate Estremamente fine (Extremely fine). Infine, selezionare tutti i domini da mesh e fare clic su Crea tutto nella finestra Impostazione mesh.
      10. Crea studio. Fate clic su Studio 1 (Study 1) nella finestra Generatore modelli (Model Builder). Individuare quindi la sezione Impostazioni studio nella finestra Impostazioni studio e deselezionare la casella di controllo Genera plottamenti predefiniti. Espandere il nodo Studio 1 nella finestra Generatore di modelli e fare clic su Passaggio 2: Dominio frequenza. Individuare infine la sezione Impostazioni studio nella finestra Impostazioni dominio frequenza e digitare 60 Hz nel campo di testo Frequenze.
      11. Calcola lo studio. Fate clic su Mostra risolutore predefinito (Show Default Solver) sulla barra degli strumenti Studio (Study). Espandere quindi il nodo Configurazioni risolutore Studio 1 nella finestra Generatore di modelli. Espandere il nodo Soluzione 1 (sol1) nella finestra Generatore di modelli; successivamente, fate clic su Risolutore stazionario 1 nella finestra Impostazioni risolutore stazionario (Stationary Solver Settings) e individuate la sezione Generale e immettete 1e-6 nel campo Testo tolleranza relativa (Relative tolerance text). Infine, fare clic su Calcola sulla barra degli strumenti studio.
      12. Risultati della trama. Selezionare la sezione Risultati sulla barra degli strumenti Home e aggiungere 2D Plot Group. Quindi, fate clic con il pulsante destro del mouse su 2D Plot Group 1 nella finestra Generatore modelli (Model Builder) e scegliete Superficie (Surface). Individuare quindi la sezione Dati nella finestra Impostazioni superficie e selezionare Precursor.
      13. Individuare la sezione Espressione nella finestra Impostazioni superficie. Qui, fare clic nel simbolo più (+) per aprire una nuova finestra e individuare il percorso seguente dall'elenco di selezione (Modello - Componente 1 - Campo Magnetico - Magnetico). Qui, selezionare mf.normB - Norma densità del flusso magnetico. Infine, fate clic su Grafica (Graphic) nella finestra Impostazioni superficie (Surface Settings) per tracciare i risultati.

2. Progettazione e produzione dei dispositivi di stimolazione elettrica e magnetica

  1. Il dispositivo di stimolatore elettrico
    NOTA: È composto da un circuito basato sull'oscillatore Wien Bridge e due elettrodi paralleli in acciaio inossidabile. Il circuito è un oscillatore RC dello spostamento di fase, che utilizza un feedback positivo e negativo. L'oscillatore Wien Bridge è composto da una rete lead-lag, che divide la tensione di ingresso per la combinazione di due bracci del ponte: un resistore R5 con un condensatore C2 in serie, e un resistore R6 con un condensatore C3 in parallelo (Figura 1A). Questi componenti modulano la frequenza dell'oscillatore. Per costruire il dispositivo stimolatore elettrico seguire i passaggi successivi:
    1. Calcolare la frequenza utilizzando l'equazione di frequenza risonante (1).
      figure-protocol-19307
      Dove R = R5 = R6 sono resistori e C = C2 = C3 sono condensatori. Sia R che C sono collocati nei due bracci del ponte(figura 1A). Utilizzare R5 = R6 = 2,6 kΩ e C2 = C3 = 1 nF per ottenere una frequenza di 60 kHz. Resistenze e condensatori possono essere calcolati se è richiesta una frequenza diversa.
    2. Progettare il circuito in modo tale che il guadagno di tensione dell'amplificatore compensi automaticamente i cambiamenti di ampiezza del segnale di uscita. Nella figura 1A è possibile osservare lo schema del circuito, mentre nella sezione Table of Materials sono elencati i componenti elettronici per costruire il circuito.
    3. Calcola la combinazione di resistori per generare le quattro tensioni di uscita. Come mostrato nella figura 1A, utilizzare una combinazione di resistori R11, R12, R13 e R14 (resistenza equivalente di 154 Ω) per generare una tensione di 50 Vp-p; resistori R17, R18 e R19 in serie (resistenza equivalente di 47,3 Ω) per ottenere una tensione di 100 Vp-p; resistori R9 e R10 in serie (resistenza equivalente di 25,3 Ω) per generare una tensione di 150 Vp-p; e una combinazione di resistori R15 e R16 (resistenza equivalente di 16,8 Ω) per ottenere una tensione di 200 Vp-p.
    4. Utilizzare un transistor (TIP 31C) e un trasformatore a nucleo in ferrite per implementare uno stadio di amplificazione del segnale. Un nucleo di ferrite toroidale è stato utilizzato per avvolgere un filo di rame AWG 24, completando una relazione 1:200. Utilizzare due condensatori (C4 e C 5) di 100 nF in parallelo prima del trasformatore per rettificare il segnale (Figura 1A).
    5. Preparare il PCB utilizzando un servizio di produzione pcb di terze parti. Il diagramma schematico del circuito è fornito nella figura 1. Posizionare tutti i componenti sul PCB con pinzette antistatiche. Utilizzare saldatura di stagno e ferro da saldare per saldare tutti i componenti.
    6. Produrre una custodia in plastica con connettori di ingresso per proteggere il circuito. Implementare tre connettori di ingresso per energizzare il circuito (12 V, -12 V e terra). Utilizzare due connettori di ingresso per collegare gli elettrodi. Includere tre interruttori per modificare la combinazione di resistori per ottenere le quattro tensioni di uscita. Assemblare il circuito elettronico nella custodia di plastica( Figura 1B).
    7. Produrre due elettrodi paralleli in acciaio inossidabile (200 x 400 x 2 mm) e connettori di ingresso di saldatura su ciascun bordo. Gli elettrodi si trovano su supporti in teflon o acrilico per eliminare qualsiasi contatto con la superficie metallica dell'incubatore(Figura 1C).
    8. Utilizzare un'autoclave a 394,15 K (121 °C) per 30 minuti per sterilizzare gli elettrodi e utilizzare l'ultravioletto durante la notte per sterilizzare i fili a contatto con l'incubatore.
    9. Testare il dispositivo di stimolazione elettrica. Regolare l'alimentatore in serie per generare una tensione di uscita di +12 V e -12 V tra il suolo e terminali positivi e negativi. Verificare la tensione di uscita dell'alimentatore con un multimetro. Collegare ogni uscita dell'alimentatore nell'ingresso corretto dello stimolatore elettrico (+12 V, -12 V e terra). Collegare ogni elettrodo nel connettore di ingresso corretto dello stimolatore elettrico. La polarità non è importante, poiché stiamo lavorando sulla corrente CA. Posizionare una piastra di coltura tra gli elettrodi e verificare il segnale di uscita con un oscilloscopio. Regolare gli interruttori dello stimolatore elettrico per generare le quattro tensioni di uscita (50, 100, 150 e 200 Vp-p).
    10. Raccomandazioni in materia di sicurezza. Per evitare problemi durante il trasferimento o la rimozione degli elettrodi dall'incubatore, assicurarsi che i cavi non siano aggrovigliati. Scollegare i cavi dall'oscillatore prima di rimuovere gli elettrodi dall'incubatore. Non posizionare mai gli elettrodi senza i supporti acrilici o in teflon.
  2. Il dispositivo di stimolatore magnetico
    1. Stimare il numero di giri per garantire un MF omogeneo all'interno della bobina utilizzando l'equazione (2), che descrive il MF all'interno di una bobina solenoide.
      figure-protocol-24315
      dove μ0 è la permeabilità magnetica del vuoto (4π×10-7), N è il numero di giri del filo di rame, I è la corrente, e h, che dovrebbe essere maggiore del suo diametro, è la lunghezza della bobina solenoide.
    2. Determinare il numero di giri scegliendo una lunghezza (h) di 250 mm, corrente di 1 A e un Bint = 2mT.
    3. Fabbricazione a partire da prodotti della bobina. Costruire un tubo di cloruro di polivinile (PVC) con una lunghezza di 250 mm e un diametro di 84 mm per avvolgere un filo di rame AWG 18 completando 450 giri(Figura 2A). Le dimensioni sono state scelte in base allo spazio disponibile all'interno dell'incubatore.
    4. Produrre un supporto per le piastre di coltura cellulare. Costruire un supporto di metacrilato di polimetile (PMMA) per garantire che le piastre di pozzo di 35 mm siano sempre situate al centro della bobina in cui le IF sono omogenee(Figura 2A).
    5. Produrre un trasformatore per aumentare la corrente del circuito. Costruisci un trasformatore con un'uscita di 1 A - 6 V AC per raggiungere un MF massimo di 2 mT. La tensione di ingresso del trasformatore era di 110 V AC a 60 Hz. Questi parametri corrispondono alla tensione di uscita e alla frequenza di una presa sudamericana.
    6. Collegare il circuito. Il trasformatore è collegato direttamente alla presa. Utilizzare un resistore variabile (rheostat) per variare la corrente e generare MF da 1 a 2 mT. Collegare un fusibile per proteggere il circuito (Figura 2B).
    7. Utilizzare l'ultravioletto durante la notte per sterilizzare i fili che sono a contatto con l'incubatore. Avvolgere la bobina con pellicola elastica trasparente e utilizzare l'etanolo per sterilizzare la bobina.
    8. Testare il dispositivo MF. Usa un teslametro per misurare la magnitudine MF all'interno della bobina. La sonda teslametro si trovava al centro della bobina, permettendo la misurazione simultanea di MFs e correnti.
    9. Variare la magnitudine MF. Utilizzare un reostato per modificare la resistenza del circuito (Figura 2B). Un valore di resistenza di 0,7 Ω è stato utilizzato per generare MF di 1 mT.
    10. Raccomandazioni in materia di sicurezza. Per evitare problemi durante il trasferimento o la rimozione del solenoide dall'incubatore, assicurarsi che i cavi non siano aggrovigliati. Scollegare i cavi dal trasformatore prima di rimuovere il solenoide dall'incubatore. Non posizionare mai il solenoide senza il supporto PMMA. Afferrare saldamente sia il supporto PMMA dalla base che il solenoide durante il trasferimento o la rimozione dall'incubatore.

Risultati

Simulazione computazionale
Le distribuzioni di FE e MF sono riportate nella figura 3. Da un lato, è stato possibile osservare la distribuzione omogenea dei FE nel sistema capacitivo(figura 3A). L'EF è stato tracciato per osservare in dettaglio l'entità del campo all'interno del campione biologico (figura 3B). Questa simulazione è stata utile per parametrizzare le dimensioni degli elettrodi e produrli per evit...

Discussione

I trattamenti utilizzati per guarire diverse patologie che colpiscono i tessuti umani sono terapie farmacologiche32 o interventi chirurgici33, che cercano di alleviare il dolore localmente o sostituire i tessuti colpiti con espianto o trapianti. Recentemente, la terapia cellulare autologa è stata proposta come terapia alternativa per il trattamento dei tessuti feriti, in cui le cellule sono isolate dal paziente e ampliate, attraverso tecniche in vitro, da impiantare nel si...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano il sostegno finanziario fornito da "Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnología, y la Innovación -Fondo Francisco José de Caldas- Minciencias" e Universidad Nacional de Colombia attraverso la sovvenzione n. 80740-290-2020 e il sostegno ricevuto da Valteam Tech - Research and Innovation per fornire le attrezzature e il supporto tecnico nell'edizione del video.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Electrical stimulator
Operational amplifierMotorolaLF-353N----
Quantity: 1
Resistors--------22 kΩ
Quantity: 1
Resistors--------10 kΩ
Quantity: 3
Resistors--------2.6 kΩ
Quantity: 2
Resistors--------2.2 kΩ
Quantity: 1
Resistors--------1 kΩ
Quantity: 1
Resistors--------220 Ω
Quantity: 2
Resistors--------22 Ω
Quantity: 5
Resistors--------10 Ω
Quantity: 1
Resistors--------6.8 Ω
Quantity: 1
Resistors--------3.3 Ω
Quantity: 2
Polyester capacitors--------1 nF
Quantity: 2
Polyester capacitors--------100 nF
Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFETToshiba2SK161----
Quantity: 1
Power transistor BJT NPNMospecTIP 31C----
Quantity: 1
Zener diodeMicrosemi1N4148----
Quantity: 1
SwitchToogle SwitchSPDT - T13----
Quantity: 3
Toroidal ferrite coreCaracol----T*22*14*8
Quantity: 1
Cooper wireGreenshine----AWG – 24
Quantity: 1
Relimate header with female housingADAFRUIT----8 pin connectors
Quantity: 1
Relimate header with female housingADAFRUIT----2 pin connectors
Quantity: 1
Female plug terminal connectorJIALUN----4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A
Quantity: 1
Aluminum Heat SinkAWIND----For TIP 31C transistor
Quantity: 1
LedCHANZON----5 mm red
Quantity: 1
Integrated circuit socket connectorTe Electronics Co., Ltd.----Double row 8-pin DIP
Quantity: 1
3 pin connectors setSTAR----JST PH 2.0
Quantity: 3
2 pin screw connectorsSTAR----For PCB
Quantity: 1
3 pin screw connectorsSTAR----For PCB
Quantity: 1
Banana connector test leadJIALUN----P1041 - 4 mm - 15 A
Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge leadJIALUN----4 mm male-male/female-female adapters - 15 A
Quantity: 1
Case--------ABS
Quantity: 1
Electrodes--------Stainless – steel
Quantity: 2
Electrode support--------Teflon
Quantity: 2
Printed circuit boardQuantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wireGreenshine----AWG – 18
Quantity: 1
AC power plugs--------120 V AC – 60 Hz
Quantity: 1
Banana female connector test leadJIALUN----1Set Dual Injection - 4 mm – 15 A
Quantity: 2
Banana male connector test leadJIALUN----1Set Dual Injection - 4 mm 15 A
Quantity: 1
Cell culture well plate support--------PMMA
Quantity: 1
FuseBussmann2A----
Quantity: 1
Transformer--------1A – 6 V AC
Quantity: 1
Tube--------PVC
Quantity: 1
Variable rheostatMCPBXS15010 Ω
Quantity: 1
General equipment
Digital dual source PeakTechDG 1022Z2 x 0 - 30 V / 0 - 5 A CC / 5 V / 3 A fijo
Quantity: 1
Digital OscilloscopeRigolDS1104Z Plus100 MHz, bandwidth, 4 channels
Quantity: 1
Digital multimeterFlukeF179Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz
Quantity: 1

Riferimenti

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