Acumulación Y Distribución De Microplásticos Fluorescentes En Las Primeras Etapas De La Vida Del Pez Cebra

Resumen

Los embriones/larvas de pez cebra se desarrollan externamente y son ópticamente transparentes. La bioacumulación de microplásticos en peces en etapas tempranas de la vida se evalúa fácilmente con microperlas etiquetadas fluorescentemente.

Resumen

Como nuevo tipo de contaminante ambiental, el microplástico se ha encontrado ampliamente en el medio acuático y representa una gran amenaza para los organismos acuáticos. La bioacumulación de los microplásticos juega un papel clave en sus efectos tóxicos; sin embargo, como partículas, sus bioacumulaciones son diferentes de muchos otros contaminantes. Aquí se describe un método factible para determinar visualmente la acumulación y distribución de microplásticos en embriones o larvas de pez cebra utilizando microplásticos fluorescentes. Los embriones se exponen a diferentes concentraciones (0,1, 1 y 10 mg/L) de microplásticos fluorescentes con un diámetro de 500 nm durante 120 h. Se muestra en los resultados que los microplásticos pueden bioacumularse en embriones/larvas de pez cebra de una manera dependiente de la concentración. Antes de la eclosión, se encuentra una fuerte fluorescencia alrededor del corion embrionario; mientras que en las larvas de pez cebra, el saco vitelino, el pericardio y el tracto gastrointestinal son los principales sitios acumulados de microplásticos. Los resultados demuestran la absorción e internalización de microplásticos en el pez cebra en etapas tempranas de la vida, lo que proporcionará la base para una mejor comprensión del impacto de los microplásticos en los animales acuáticos.

Introducción

Desde que se sintetizó por primera vez en la década de 1900, los plásticos son ampliamente utilizados en varios campos, lo que resulta en un rápido crecimiento de la producción mundial¹. En 2018, se produjeron aproximadamente 360 millones de toneladas de plásticos en todo el mundo². Los plásticos en el medio natural se degradarán a partículas finas debido a procesos químicos, físicos o biológicos³. En general, las partículas plásticas finas de tamaño <5 mm se definen como microplásticos⁴. Los microplásticos también están diseñados para aplicaciones específicas, como las microperlas de productos cosméticos⁵. Como contaminantes casi permanentes, los microplásticos se acumulan en el medio ambiente, y han atraído cada vez más la atención de los científicos, los responsables de la formulación de políticas y el público^1,6. Estudios previos documentaron que los microplásticos podían causar efectos adversos en los peces, como daño gastrointestinal^7,neurotoxicidad^8,alteración endocrina^9,estrés oxidativo¹⁰ y daño en el ADN^11. Sin embargo, la toxicidad de los microplásticos no se ha revelado completamente hasta ahora^12,13.

Los embriones de pez cebra ofrecen muchas ventajas experimentales, incluyendo tamaño pequeño, fertilización externa, transparencia óptica y embragues grandes, y es considerado como un organismo modelo ideal para estudiar in vivo los efectos de los contaminantes en los peces en las primeras etapas de la vida. Además, sólo se necesitan cantidades limitadas de sustancias de ensayo para la evaluación de las respuestas biológicas. Aquí, los embriones de pez cebra se exponen a diferentes concentraciones de microplásticos (0,1, 1, 10 mg / L) durante 5 días, y se evalúa la bioacumulación y distribución de microplásticos en embriones / larvas de pez cebra. Este resultado avanzará nuestra comprensión sobre la toxicidad de los microplásticos para los peces, y el método descrito aquí puede potencialmente generalizarse para determinar la acumulación y distribución de otros tipos de materiales fluorescentes en las primeras etapas de la vida del pez cebra.

Protocolo

Los peces cebra adultos se originan en el Centro de Recursos de Pez Cebra de China (Wuhan, China). Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la guía nacional "Guía de animales de laboratorio para la revisión ética del bienestar animal (GB/T35892-2018).

1. Recolección de embriones

1. Mantener los peces en tanques de vidrio de 20 L con sistema de agua del grifo filtrada por carbón recirculante (pH 7.0 ± 0.2) a una temperatura constante (28 ± 0.5 °C) en un fotoperiodo de 14:10 h luz: oscuro.
2. Alimente a los peces dos veces al día con Artemia nauplii. Se recomienda que la comida se dé a un máximo del 3% de peso de pescado por día y debe comerse dentro de los 5 min cada vez^{que 14.}
3. Transferir peces cebra adultos bien desarrollados (con una longitud corporal de 3-4 cm) en el tanque de desove en una proporción de un macho a dos hembras la noche antes de la cría.
   NOTA: A la mañana siguiente, los peces comienzan a desovar después del inicio del ciclo de luz.
4. Recoger los huevos con una pipeta Pasteur. Enjuague con la solución de Hank al 10% varias veces y luego verifique la fertilización con un microscopio. Los óvulos fertilizados experimentan el período de escisión después de aproximadamente 2 h después de la fertilización (hpf) y pueden ser claramente identificados¹⁵.
5. Incubar los embriones fertilizados en un casto de 500 mL que contenga 200 mL de solución de Hank al 10% con 1% de azul de metileno para su desinfección a 28 °C. No exceda una velocidad de carga de 1 embrión/2 mL de solución.
   NOTA: La solución de Hank al 10% se compone de 137 mM De NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na₂HPO_4,0.44 mM KH₂PO_4,1.3 mM CaCl_2,1.0 mM MgSO₄ y 4.2 mM NaHCO_3.

2. Preparación de suspensiones microplásticas

1. Sonicar la solución común de perlas de poliestireno verdes marcados fluorescentemente (10 mg / mL) con diámetro nominal de 500 nm (excitación / emisión: 460 / 500 nm) durante 10 minutos.
2. Diluya la solución común con la solución de Hank al 10% para producir las soluciones de exposición deseadas (0,1, 1 y 10 mg/L).
3. Prepare siempre las soluciones de exposición de los microplásticos antes de la exposición.
   NOTA: Se debe tener precaución al evaluar los efectos tóxicos de los microplásticos, ya que la presencia de conservantes, como la azida de sodio, en las formulaciones de partículas comerciales, puede ser tóxica para diferentes organismos ¹⁶. Por lo tanto, estos aditivos deben eliminarse o tenerse en cuenta en los controles antes de realizar un experimento de toxicidad.

3. Exposición a microplásticos

1. Seleccione aleatoriamente 6 embriones recién fertilizados (4 hpf), y luego transfiera a cada pozo de una placa de 6 pozos que contenga 5 mL de soluciones microplásticas con diferentes concentraciones. Incluya los grupos de control que contienen el 10% de la solución de Hank.
   1. Utilice pozos triplicados (con un total de 18 embriones) para cada tratamiento.
2. Incubar los embriones bajo la misma luz: ciclo oscuro y temperatura que los adultos (ver 1.2) y observar cada 12 horas. Retire los muertos inmediatamente.
3. Renovar las soluciones microplásticas 90% cada 24 h. Durante el período de exposición, los peces no son alimentados.
   NOTA: Generalmente, la eclosión del embrión comienza en 48 hpf y se completa a unos 72 hpf.

4. Evaluación de la distribución de microplásticos

1. A las 24, 48, 72, 96 y 120 h después de la fertilización, seleccione aleatoriamente los embriones /larvas (uno de cada una de las tres réplicas) y enjuague con la solución de Hank al 10%.
2. Transferir las larvas en una placa de Petri y exponer a 0.016% tricaine para la anestesia.
   1. Preparar la solución común de tricaína: 4 mg de polvo de tricaina se disuelve en 100 mL de agua destilada doble, y ajustar el pH a 7.0 con Tris-HCl (pH 9.0). Guarde la solución de stock en el congelador.
   2. Prepare la solución de trabajo. Diluir la solución común a la concentración deseada (0.016%) con 10% de solución de Hank a temperatura ambiente¹⁴.
3. Organice los embriones/larvas y prepárese para la observación.
4. Observe a los peces con un microscopio de fluorescencia e imagen con software de imágenes.
5. Cuantificar la intensidad de fluorescencia en peces con ImageJ.

Resultados

La distribución y acumulación de microplásticos fluorescentes se muestran en la Figura 1 y tabla 1. No se observa fluorescencia visible en el grupo no expuesto (control). Sin embargo, se encuentra una acumulación de fluorescencia que rodea el corion después de la exposición a diferentes concentraciones de microplásticos (24 hpf). La fluorescencia verde también se detecta en larvas, y los niveles de fluorescencia parecen aumentar de una manera dependiente de la concen...

Discusión

De acuerdo con la directriz sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos, como la Directiva 2010/63/UE de la UE, el permiso de ética animal no es obligatorio para un experimento con etapas tempranas de la vida del pez cebra hasta la etapa de ser capaz de alimentarse de forma independiente (5 días después de la fertilización)¹⁷. Sin embargo, las mejores prácticas de bienestar son importantes para optimizar el uso del pez cebra y, por ejemplo, los métodos humanos de a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Nikon, Japan	Eclipse Ti-S
Green fluorescently labeled polystyrene beads	Phosphorex, USA	2103A
Tricaine	Sigma-Aldrich, USA	A5040