Accumulation et distribution de microplastiques fluorescents aux premiers stades de leur vie chez le poisson zèbre

Résumé

Les embryons/larves de poisson zèbre se développent à l’extérieur et sont optiquement transparents. La bioaccumulation des microplastiques chez les poissons aux premiers stades de leur cycle biologique est facilement évaluée à l’autise avec des microbilles marqués par fluorescence.

Résumé

En tant que nouveau type de polluant environnemental, le microplastique a été largement présent dans le milieu aquatique et constitue une menace élevée pour les organismes aquatiques. La bioaccumulation des microplastiques joue un rôle clé dans leurs effets toxiques; cependant, en tant que particules, leurs bioaccumulations sont différentes de celles de nombreux autres polluants. Décrit ici est une méthode réalisable pour déterminer visuellement l’accumulation et la distribution des microplastiques dans les embryons de poissons zèbres ou les larves à l’aide de microplastiques fluorescents. Les embryons sont exposés à différentes concentrations (0,1, 1 et 10 mg/L) de microplastiques fluorescents d’un diamètre de 500 nm pendant 120 h. Les résultats montrent que les microplastiques peuvent se bioaccumuler dans les embryons/larves de poisson zèbre d’une manière dépendante de la concentration. Avant l’éclosion, une forte fluorescence se retrouve autour du chorion embryonnaire; tandis que chez les larves de poissons zèbres, le sac vitellin, le péricarde et le tractus gastro-intestinal sont les principaux sites accumulés de microplastiques. Les résultats démontrent l’absorption et l’internalisation des microplastiques chez le poisson zèbre aux premiers stades de sa vie, ce qui fournira une base pour mieux comprendre l’impact des microplastiques sur les animaux aquatiques.

Introduction

Depuis leur première synthèse dans les années 1900, les plastiques sont largement utilisés dans divers domaines, ce qui entraîne une croissance rapide de la production mondiale¹. En 2018, environ 360 millions de tonnes de plastiques ont été produites dans le monde². Les plastiques dans l’environnement naturel se dégraderont en particules fines en raison de processus chimiques, physiques ou biologiques³. En général, les particules fines de plastique de <5 mm sont définies comme des microplastiques^4. Les microplastiques sont également conçus pour des applications spécifiques, telles que les microbilles de produits cosmétiques⁵. En tant que contaminants quasi permanents, les microplastiques s’accumulent dans l’environnement et ont attiré de plus en plus l’attention des scientifiques, des décideurs et du public^1,6. Des études antérieures ont documenté que les microplastiques pouvaient causer des effets indésirables chez les poissons, tels que des dommages gastro-intestinaux^7,la neurotoxicité^8,la perturbation endocrinienne^9,le stress oxydatif¹⁰ et les dommages à l’ADN^11. Cependant, la toxicité des microplastiques n’a pas été entièrement révélée jusqu’à présent^12,13.

Les embryons de poisson zèbre offrent de nombreux avantages expérimentaux, y compris la petite taille, la fécondation externe, la transparence optique et les grandes couvées, et sont considérés comme un organisme modèle idéal pour étudier in vivo les effets des polluants sur les poissons aux premiers stades de leur vie. En outre, seules des quantités limitées de substances d’essai sont nécessaires pour l’évaluation des réponses biologiques. Ici, les embryons de poisson zèbre sont exposés à différentes concentrations de microplastiques (0,1, 1, 10 mg/L) pendant 5 jours, et la bioaccumulation et la distribution des microplastiques dans les embryons/larves de poissons zèbres sont évaluées. Ce résultat fera progresser notre compréhension de la toxicité des microplastiques pour les poissons, et la méthode décrite ici peut potentiellement être généralisée pour déterminer l’accumulation et la distribution d’autres types de matériaux fluorescents dans les premiers stades de vie du poisson zèbre.

Protocole

Les poissons zèbres adultes sont originaires du China Zebrafish Resource Center (Wuhan, Chine). Les expériences ont été menées conformément au guide national « Ligne directrice sur les animaux de laboratoire pour l’examen éthique du bien-être des animaux (GB/T35892-2018).

1. Collecte d’embryons

1. Maintenir les poissons dans des réservoirs en verre de 20 L avec un système d’eau du robinet filtré au charbon de combustion (pH 7,0 ± 0,2) à une température constante (28 ± 0,5 °C) sur une photopériode de 14:10 h clair : foncé.
2. Nourrissez les poissons deux fois par jour avec Artemia nauplii. Il est recommandé que la nourriture soit donnée à max. 3% de poids de poisson par jour et doit être mangée dans les 5 minutes à chaque fois¹⁴.
3. Transférer des poissons zèbres adultes bien développés (d’une longueur de corps de 3 à 4 cm) dans le réservoir de frai dans un rapport d’un mâle à deux femelles la nuit précédant la reproduction.
   REMARQUE: Le lendemain matin, les poissons commencent à frayer après le début du cycle de lumière.
4. Recueillir les œufs à l’aide d’une pipette Pasteur. Rincez plusieurs fois avec la solution de Hank à 10%, puis vérifiez la fertilisation à l’aide d’un microscope. Les œufs fécondés subissent la période de clivage après environ 2 h après la fécondation (hpf) et peuvent être clairement identifiés¹⁵.
5. Incuber les embryons fécondés dans un bécher de 500 mL contenant 200 mL de solution de Hank à 10 % avec du bleu de méthylène à 1 % pour la désinfection à 28 °C. Ne pas dépasser un taux de charge de 1 embryo/solution de 2 mL.
   NOTE : 10% de la solution de Hank est composée de 137 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 0,25 mM de_Na2HPO4,0,44 mM_KH2PO4,1,3 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgSO4 et 4,2 mM deNaHCO3.

2. Préparation de suspensions microplastiques

1. Soniquer la solution mère de billes vertes de polystyrène marqués par fluorescence (10 mg/mL) d’un diamètre nominal de 500 nm (excitation/émission : 460/500 nm) pendant 10 minutes.
2. Diluer la solution mère avec la solution de Hank à 10 % pour produire les solutions d’exposition souhaitées (0,1, 1 et 10 mg/L).
3. Préparez toujours les solutions d’exposition des microplastiques avant l’exposition.
   NOTA : Il faut faire preuve de prudence lors de l’évaluation des effets toxiques des microplastiques, car la présence de conservateurs, tels que l’azide de sodium, dans les formulations commerciales de particules, peut être toxique pour différents organismes ¹⁶. Par conséquent, ces additifs doivent être retirés ou comptabilisés dans les témoins avant de mener une expérience de toxicité.

3. Exposition aux microplastiques

1. Sélectionnez au hasard 6 embryons nouvellement fécondés (4 hpf), puis transférez dans chaque puits une plaque de 6 puits contenant 5 mL de solutions de microplastiques à différentes concentrations. Inclure les groupes témoins contenant 10 % de la solution de Hank.
   1. Utilisez des puits triples (avec un total de 18 embryons) pour chaque traitement.
2. Incuber les embryons sous la même lumière: cycle sombre et température que les adultes (voir 1.2) et observer toutes les 12 heures. Retirez les morts immédiatement.
3. Renouveler les solutions microplastiques 90% toutes les 24 h. Pendant la période d’exposition, les poissons ne sont pas nourris.
   REMARQUE: Généralement, l’éclosion de l’embryon commence à 48 hpf et se termine à environ 72 hpf.

4. Évaluation de la distribution des microplastiques

1. À 24, 48, 72, 96 et 120 h après la fécondation, sélectionnez au hasard les embryons/larves (un de chacune des trois répétitions) et rincez avec 10 % de la solution de Hank.
2. Transférer les larves dans une boîte de Pétri et les exposer à 0,016% de tricaine pour l’anesthésie.
   1. Préparer la solution mère de tricaine : 4 mg de poudre de tricaine sont dissous dans 100 mL d’eau distillée double, et ajuster le pH à 7,0 avec tris-HCl (pH 9,0). Conservez la solution mère dans le congélateur.
   2. Préparez la solution de travail. Diluer la solution mère à la concentration souhaitée (0,016%) avec 10% de la solution de Hank à température ambiante¹⁴.
3. Disposer les embryons/larves et se préparer à l’observation.
4. Observez le poisson avec un microscope à fluorescence et imagez avec un logiciel d’imagerie.
5. Quantifier l’intensité de fluorescence chez les poissons avec ImageJ.

Résultats

La distribution et l’accumulation des microplastiques fluorescents sont illustrées à la figure 1 et au tableau 1. Aucune fluorescence visible n’est observée dans le groupe non exposé (témoin). Cependant, une accumulation de fluorescence est trouvée autour du chorion après exposition à différentes concentrations de microplastiques (24 hpf). La fluorescence verte est également détectée chez les larves, et les niveaux de fluorescence semblent augmenter d’une m...

Discussion

Selon la ligne directrice sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, telle que la directive 2010/63/UE de l’UE, l’autorisation d’éthique animale n’est pas obligatoire pour une expérience avec les premiers stades de vie du poisson zèbre jusqu’au stade de la capacité d’alimentation indépendante (5 jours après la fécondation)¹⁷. Cependant, les meilleures pratiques en matière de bien-être sont importantes pour optimiser l’utilisation du poisson zèbre et,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Nikon, Japan	Eclipse Ti-S
Green fluorescently labeled polystyrene beads	Phosphorex, USA	2103A
Tricaine	Sigma-Aldrich, USA	A5040