Acumulação e Distribuição de Microplásticos Fluorescentes nos Estágios Iniciais da Vida dos Zebrafish

Resumo

Os embriões/larvas de zebrafish desenvolvem-se externamente e são opticamente transparentes. A bioacúscula de microplásticos em peixes em estágios iniciais da vida é prontamente avaliada com microesferas fluorescentes rotuladas.

Resumo

Como um novo tipo de poluente ambiental, o microplástico tem sido amplamente encontrado no ambiente aquático e representa uma alta ameaça aos organismos aquáticos. A bioacúsculação de microplásticos desempenha um papel fundamental em seus efeitos tóxicos; no entanto, como uma particulada, suas bioacúsculas são diferentes de muitos outros poluentes. Descrito aqui é um método viável para determinar visualmente o acúmulo e distribuição de microplásticos em embriões de zebrafish ou larvas usando microplásticos fluorescentes. Os embriões são expostos a diferentes concentrações (0,1, 1 e 10 mg/L) de microplásticos fluorescentes com diâmetro de 500 nm para 120 h. É mostrado nos resultados que os microplásticos podem bioacúsolar em embriões/larvas de zebrafish de forma dependente da concentração. Antes de eclodir, a fluorescência forte é encontrada ao redor do acorde embrionário; enquanto em larvas de zebrafish, o saco de gema, pericárdio e trato gastrointestinal são os principais locais acumulados de microplásticos. Os resultados demonstram a absorção e internalização de microplásticos em zebrafish em estágios iniciais da vida, o que fornecerá base para uma melhor compreensão do impacto dos microplásticos nos animais aquáticos.

Introdução

Desde a primeira sintetização na década de 1900, os plásticos são amplamente utilizados em diversos campos, resultando em rápido crescimento da produção global¹. Em 2018, aproximadamente 360 milhões de toneladas de plásticos foram produzidas em todo o mundo². Os plásticos no ambiente natural se degradarão a partículas finas devido aos processos químicos, físicos ou biológicos³. Geralmente, partículas plásticas finas <5 mm de tamanho são definidas como microplásticos⁴. Os microplásticos também são projetados para aplicações específicas, como microesferas de produtos cosméticos⁵. Como contaminantes quase permanentes, os microplásticos são acumulados no meio ambiente, e têm atraído cada vez mais atenção de cientistas, formuladores de políticas e público^1,6. Estudos anteriores documentaram que microplásticos podem causar efeitos adversos em peixes, como danos gastrointestinais^7,neurotoxicidade^8,interrupção endócrina^9,estresse oxidativo¹⁰ e dano de DNA¹¹. No entanto, a toxicidade dos microplásticos não foi totalmente revelada até agora^12,13.

Os embriões de zebrafish oferecem uma série de vantagens experimentais, incluindo pequeno tamanho, fertilização externa, transparência óptica e grandes embreagens, e é considerado como um organismo modelo ideal para in vivo estudar os efeitos de poluentes em peixes em estágios iniciais da vida. Além disso, apenas quantidades limitadas de substâncias de teste são necessárias para a avaliação de respostas biológicas. Aqui, os embriões de zebrafish são expostos a diferentes concentrações de microplásticos (0,1, 1, 10 mg/L) durante 5 dias, e a bioacúscula e distribuição de microplásticos em embriões/larvas de zebrafish são avaliadas. Este resultado avançará nossa compreensão sobre a toxicidade dos microplásticos aos peixes, e o método descrito aqui pode potencialmente ser generalizado para determinar o acúmulo e distribuição de outros tipos de materiais fluorescentes nos estágios iniciais da vida dos zebrafish.

Protocolo

Os zebrafish adultos são originários do Centro de Recursos de Zebrafish da China (Wuhan, China). Os experimentos foram realizados em conformidade com o guia nacional "Guia Animal Laboratorial para Revisão Ética do Bem-Estar Animal (GB/T35892-2018).

1. Coleção de embriões

1. Mantenha os peixes em tanques de vidro de 20 L com sistema de água da torneira filtrado por carvão (pH 7.0 ± 0,2) a uma temperatura constante (28 ± 0,5 °C) em um fotoperperióduodo de 14:10 h de luz: escuro.
2. Alimente os peixes duas vezes por dia com Artemia nauplii. Recomenda-se que o alimento seja dado no máximo 3% de peso de peixe por dia e deve ser comido dentro de 5 min cada^{vez 14}.
3. Transfira zebrafish adulto bem desenvolvido (com comprimento corporal de 3-4 cm) para o tanque de desova em uma proporção de um macho para duas fêmeas na noite anterior à reprodução.
   NOTA: Na manhã seguinte, os peixes começam a desovar após o início do ciclo de luz.
4. Colete ovos usando uma pipeta Pasteur. Enxágüe com 10% da solução de Hank várias vezes, e depois verifique se há fertilização usando um microscópio. Os óvulos fertilizados passam pelo período de decote após aproximadamente 2h de fertilização pós-fertilização (hpf) e podem ser claramente identificados¹⁵.
5. Incubar os embriões fertilizados em um béquer de 500 mL contendo 200 mL de solução de 10% hank com 1% de azul metileno para desinfecção a 28 °C. Não exceda uma taxa de carregamento de 1 solução embrionária/2 mL.
   NOTA: 10% A solução da Hank é composta por 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO₄, 0,44 mM KH₂PO₄, 1,3 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO₄ e 4,2 mM NaHCO₃.

2. Preparação de suspensões microplásticas

1. Sonicate a solução de estoque de contas de poliestireno rotulados fluorescente verde (10 mg/mL) com diâmetro nominal de 500 nm (excitação/emissão: 460/500 nm) por 10 minutos.
2. Diluir a solução de estoque com 10% da solução da Hank para produzir as soluções de exposição desejadas (0,1, 1 e 10 mg/L).
3. Prepare sempre as soluções de exposição de microplásticos antes da exposição.
   NOTA: Deve-se ter cuidado ao avaliar os efeitos tóxicos dos microplásticos, pois a presença de conservantes, como o azida de sódio, nas formulações de partículas comerciais, pode ser tóxica para diferentes organismos ¹⁶. Portanto, esses aditivos devem ser removidos ou contabilizados nos controles antes de realizar o experimento de toxicidade.

3. Exposição microplástica

1. Selecione aleatoriamente 6 embriões recém-fertilizados (4 hpf), e depois transfira para cada poço de placa de 6 poços contendo 5 mL de soluções microplásticas com diferentes concentrações. Inclua os grupos de controle contendo 10% da solução de Hank.
   1. Use poços triplicados (com um total de 18 embriões) para cada tratamento.
2. Incubar os embriões sob a mesma luz: ciclo escuro e temperatura que os adultos (ver 1,2) e observar a cada 12 horas. Remova os mortos imediatamente.
3. Renovar as soluções microplásticas 90% a cada 24 h. Durante o período de exposição, os peixes não são alimentados.
   NOTA: Geralmente, a eclosão do embrião começa em 48 cvf e é completa em cerca de 72 cvf.

4. Avaliação da distribuição microplástica

1. Aos 24, 48, 72, 96 e 120 h pós fertilização, selecione aleatoriamente os embriões/larvas (um de cada uma das três réplicas) e enxágue com 10% da solução de Hank.
2. Transfira as larvas para uma placa de Petri e exponha a 0,016% de tricaine para anestesia.
   1. Prepare a solução de estoque de tricaine: 4 mg de pó de tricaine é dissolvido em 100 mL de água dupla destilada, e ajuste o pH para 7.0 com Tris-HCl (pH 9.0). Guarde a solução de estoque no congelador.
   2. Prepare a solução de trabalho. Diluir a solução de estoque para a concentração desejada (0,016%) com solução de 10% Hank à temperatura ambiente¹⁴.
3. Organize os embriões/larvas e prepare-se para observação.
4. Observe o peixe com um microscópio de fluorescência e imagem com software de imagem.
5. Quantifique a intensidade da fluorescência em peixes com ImageJ.

Resultados

A distribuição e o acúmulo de microplásticos fluorescentes são mostrados na Figura 1 e Tabela 1. Nenhuma fluorescência visível é observada no grupo não exposto (controle). No entanto, um acúmulo de fluorescência é encontrado em torno do chorão após exposição a diferentes concentrações de microplásticos (24 hpf). A fluorescência verde também é detectada em larvas, e os níveis de fluorescência parecem aumentar de forma dependente da concentração e do ...

Discussão

De acordo com a diretriz sobre a proteção de animais utilizados para fins científicos, como a Diretiva da UE 2010/63/UE, a permissão de ética animal não é obrigatória para um experimento com estágios iniciais de zebrafish até o estágio de ser capaz de alimentação independente (5 dias após a fertilização)¹⁷. No entanto, a melhor prática de bem-estar é importante para otimizar o uso de zebrafish, e, por exemplo, os métodos humanos de anestesia e eutanásia devem ser preocupantes. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Nikon, Japan	Eclipse Ti-S
Green fluorescently labeled polystyrene beads	Phosphorex, USA	2103A
Tricaine	Sigma-Aldrich, USA	A5040