Накопление и распространение флуоресцентного микропластика на ранних стадиях жизни зебры

Резюме

Эмбрионы/личинки зебры развиваются внешне и оптически прозрачны. Биоаккумуляция микропластика у рыб на ранних стадиях жизни легко оценивается с помощью флуоресцентно помеченных микробусов.

Аннотация

В качестве нового типа загрязнителей окружающей среды микропластик широко распространен в водной среде и представляет собой высокую угрозу для водных организмов. Биоаккумуляция микропластика играет ключевую роль в их токсических эффектах; однако, как частицы, их биоаккумуляции отличаются от многих других загрязнителей. Описанный здесь является возможным методом визуального определения накопления и распределения микропластика в эмбрионах зебры или личинках с использованием флуоресцентного микропластика. Эмбрионы подвергаются воздействию различных концентраций (0,1, 1 и 10 мг/л) флуоресцентного микропластика диаметром 500 нм на 120 ч. В результатах показано, что микропластик может биоаккумулятироваться в эмбрионах/личинках зебры в зависимости от концентрации. Перед вылуплением вокруг эмбрионального хориона обнаружена сильная флуоресценция; в то время как в личинках зебры, желточный мешок, перикард, и желудочно-кишечного тракта являются основными накопленными участками микропластика. Результаты демонстрируют поглощение и интернализации микропластика у зебры на ранних стадиях жизни, что обеспечит основу для лучшего понимания воздействия микропластика на водных животных.

Введение

С момента первого синтеза в 1900-х годах, пластмассы широко используются в различных областях, что приводит к быстрому росту мирового производства¹. В 2018 году в мире было произведено около 360 миллионов тонн^{пластмасс.} Пластмассы в естественной среде будут деградировать до мелких частиц из-за химических, физических или биологических^{процессов 3.} Как правило, мелкие пластиковые частицы <5 мм в размерах определяются как микропластик^4. Микропластик также разработан для конкретных применений, таких как микробусы из косметической продукции⁵. Как почти постоянные загрязняющие вещества, микропластик накапливается в окружающей среде, и привлекли все большее внимание со стороны ученых, политиков^{и общественности 1,6}. Предыдущие исследования документально, что микропластик может вызвать неблагоприятные последствия у рыб, таких как повреждение^{желудочно-кишечного тракта 7},^{нейротоксичность 8}, эндокринные^{нарушения 9},^{окислительный стресс 10} и^{повреждение ДНК 11}. Тем не менее, токсичность микропластика до сих пор не полностью выявлена^12,13.

Эмбрионы зебры предлагают множество экспериментальных преимуществ, включая небольшие размеры, внешнее оплодотворение, оптическую прозрачность и большие сцепления, и считается идеальной моделью организма для изучения воздействия загрязняющих веществ на рыбу на ранних стадиях жизни. Кроме того, для оценки биологических реакций требуется лишь ограниченное количество испытательных веществ. Здесь эмбрионы зебры подвергаются воздействию различных концентраций микропластика (0,1, 1, 10 мг/л) в течение 5 дней, а также оцениваются биоаккумуляция и распределение микропластика в эмбрионах/личинках зебры. Этот результат будет способствовать нашему пониманию токсичности микропластика для рыб, и метод, описанный здесь потенциально может быть обобщен для определения накопления и распределения других видов флуоресцентных материалов на ранних стадиях жизни зебры.

протокол

Взрослые зебры происходят из Китайского ресурсного центра зебрафиш (Ухань, Китай). Эксперименты проводились в соответствии с национальным руководством "Руководство по этическому обзору благосостояния животных (GB/T35892-2018).

1. Коллекция эмбрионов

1. Поддерживайте рыбу в стеклянных резервуарах 20 л с ревергентной системой водопроводной воды с углем (рН 7,0 ± 0,2) при постоянной температуре (28 ± 0,5 градуса по Цельсию) на фотопериоде света 14:10 ч: темно.
2. Кормите рыбу два раза в день с Артемием nauplii. Рекомендуется, чтобы пища дается на максимум 3% массы рыбы в день и должны быть съедены в течение 5 минут каждый раз¹⁴.
3. Передача хорошо развитых взрослых зебры (с длиной тела 3-4 см) в нерестовой бак в соотношении одного самца к двум самкам в ночь перед размножением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На следующее утро рыба начинает появляться после начала светового цикла.
4. Собирайте яйца с помощью пипетки Pasteur. Промыть 10% раствором Хэнка несколько раз, а затем проверить на оплодотворение с помощью микроскопа. Оплодотворенные яйцеклетки проходят период расщепления примерно через 2 ч после оплодотворения (hpf) и могут быть четко определены¹⁵.
5. Инкубировать оплодотворенные эмбрионы в стакане 500 мл, содержащем 200 мл раствора 10% Хэнка с 1% метиленовым синим для дезинфекции при 28 градусах Цельсия. Не превышать скорость загрузки 1 эмбриона/2 мл раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 10% решение Хэнка состоит из 137 мМм NaCl, 5,4 мм ККл, 0,25 мм На₂HPO₄, 0,44 мМХ₂PO₄, 1,3 мМ CaCl₂, 1,0 мММ MgSO₄ и 4,2 мММ NaHCO₃.

2. Подготовка микропластиковых суспензий

1. Sonicate фондовый раствор зеленого флуоресцентно помечены полистироловые бусы (10 мг/мл) с номинальным диаметром 500 нм (возбуждение / выброс: 460/500 нм) в течение 10 минут.
2. Разбавить фондовый раствор 10% раствором Хэнка для получения желаемых растворов экспозиции (0,1, 1 и 10 мг/л).
3. Всегда подготовьте решения воздействия микропластика перед экспозицией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять осторожность при оценке токсического воздействия микропластика, потому что наличие консервантов, таких как азид натрия, в коммерческих формулировках частиц, может быть токсичным для различных организмов ¹⁶. Таким образом, эти добавки должны быть удалены или учтены в контроле перед проведением эксперимента токсичности.

3. Микропластиковая экспозиция

1. Случайным образом выберите 6 недавно оплодотворенных эмбрионов (4 л.с.), а затем перенесите в каждую колодец 6-хорошо пластины, содержащей 5 мл микропластиковых растворов с различными концентрациями. Включите контрольные группы, содержащие 10% решения Хэнка.
   1. Используйте тройной скважины (в общей сложности 18 эмбрионов) для каждого лечения.
2. Инкубировать эмбрионы под тем же светом: темный цикл и температуру, как взрослые (см. 1,2) и наблюдать каждые 12 часов. Немедленно удалите мертвых.
3. Обновляем микропластиковые растворы 90% каждые 24 ч. В период воздействия рыбу не кормят.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, вылупление эмбриона начинается с 48 л.с. и завершается примерно на 72 л.с.

4. Оценка распределения микропластика

1. В 24, 48, 72, 96 и 120 ч после оплодотворения, случайным образом выбрать эмбрионы / личинки (по одному из трех репликаций) и промыть с 10% раствор Хэнка.
2. Перенесите личинки в чашку Петри и подвергайте 0,016% трикаин для анестезии.
   1. Приготовьте бульонный раствор трикаина: 4 мг трикайна растворяется в 100 мл двойной дистиллированной воды и отрегулируйте рН до 7,0 с Tris-HCl (рН 9.0). Храните раствор бульона в морозильной камере.
   2. Подготовь рабочее решение. Разбавить фондовый раствор до нужной концентрации (0.016%) с 10% раствором Хэнка при комнатной температуре¹⁴.
3. Упорядочить эмбрионы / личинки и подготовиться к наблюдению.
4. Наблюдайте за рыбой с помощью флуоресцентного микроскопа и изображения с помощью программного обеспечения для визуализации.
5. Количественная оценка интенсивности флуоресценции у рыб с ImageJ.

Результаты

Распределение и накопление флуоресцентного микропластика показано на рисунке 1 и таблице 1. В неэкспонированных группах (контроль) не наблюдается видимой флуоресценции. Тем не менее, накопление флуоресценции находится вокруг хориона после воздействия различн...

Обсуждение

В соответствии с руководящим принципом по защите животных, используемых в научных целях, таких как Директива ЕС 2010/63/EU, разрешение на этику животных не является обязательным для эксперимента с ранними стадиями жизни зебры до стадии быть способным к самостоятельному кормлению (5 дней по?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Nikon, Japan	Eclipse Ti-S
Green fluorescently labeled polystyrene beads	Phosphorex, USA	2103A
Tricaine	Sigma-Aldrich, USA	A5040