הצטברות והפצה של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי בשלבי החיים המוקדמים של דגי זברה

Summary

עוברים/זחלים של דגי זברה מתפתחים חיצונית והם שקופים אופטית. הביואקומולציה של מיקרופלסטיק בדגים בשלבי חיים מוקדמים מוערכת בקלות עם מיקרוביאדות בעלות תווית פלואורסצנטית.

Abstract

כסוג חדש של מזהם סביבתי, מיקרופלסטיק נמצא באופן נרחב בסביבה הימית ומהווה איום גבוה על אורגניזמים ימיים. הביואקומולציה של מיקרופלסטיק ממלאת תפקיד מרכזי בהשפעות הרעילות שלהם; עם זאת, כחלקיקים, הביואקומולציות שלהם שונות ממזהמים רבים אחרים. המתוארת כאן היא שיטה אפשרית כדי לקבוע חזותית את הצטברות והפצה של מיקרופלסטיק בעוברים זברה או זחלים באמצעות מיקרופלסטיק פלואורסצנטי. עוברים נחשפים לריכוזים שונים (0.1, 1 ו-10 מ"ג/ליטר) של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי בקוטר של 500 ננומטר ל-120 שעות. זה מוצג בתוצאות כי מיקרופלסטיק יכול bioaccumulate בעוברים זברה / זחלים באופן תלוי ריכוז. לפני הבקיעה, פלואורסצנטיות חזקה נמצא סביב chorion עוברי; בעוד בזחלים זברה, שק החלמון, קרום הלב, ומערכת העיכול הם האתרים המצטברים העיקריים של מיקרופלסטיק. התוצאות ממחישות את ספיגת והפנמה של מיקרופלסטיק בזברה בשלבי חיים מוקדמים, אשר יספקו בסיס להבנה טובה יותר של ההשפעה של מיקרופלסטיק על בעלי חיים ימיים.

Introduction

מאז מסונתז לראשונה בשנת 1900, פלסטיק נמצאים בשימוש נרחב בתחומים שונים, וכתוצאה מכך צמיחה מהירה של הייצור העולמי¹. בשנת 2018 יוצרו ברחבי העולם כ-360 מיליון^טוןפלסטיק. הפלסטיק בסביבה הטבעית יתפרק לחלקיקים עדינים עקב תהליכים כימיים, פיזיקליים או ביולוגיים³. בדרך כלל, חלקיקי פלסטיק עדינים <5 מ"מ בגודל מוגדרים מיקרופלסטיק⁴. מיקרופלסטיק מתוכנן גם עבור יישומים ספציפיים, כגון microbeads ממוצרי קוסמטיקה⁵. כמזהמים כמעט קבועים, מיקרופלסטיק מצטבר בסביבה, ומשכו תשומת לב גוברת ממדענים, קובעי מדיניות והציבור^1,6. מחקרים קודמים תיעדו כי מיקרופלסטיק עלול לגרום לתופעות לוואי בדגים, כגון נזק למערכת העיכול⁷, neurotoxicity⁸, הפרעה אנדוקרינית⁹, מתח חמצוני¹⁰ ונזק DNA¹¹. עם זאת, הרעילות של מיקרופלסטיק לא נחשפה במלואה עד כה^12,13.

עוברי זברה מציעים יתרונות ניסיוניים רבים, כולל גודל קטן, הפריה חיצונית, שקיפות אופטית ומצמדים גדולים, ונחשבים כאורגניזם מודל אידיאלי לחקר ההשפעות של מזהמים על דגים בשלבי חיים מוקדמים. בנוסף, רק כמויות מוגבלות של חומרי בדיקה נדרשים להערכת תגובות ביולוגיות. כאן, עוברי זברה נחשפים לריכוזים שונים של מיקרופלסטיק (0.1, 1, 10 מ"ג / ליטר) במשך 5 ימים, ואת ביואקומולציה והפצה של מיקרופלסטיק בעוברים / זחלים זברה מוערכים. תוצאה זו תקדם את הבנתנו לגבי הרעילות של מיקרופלסטיק לדגים, ואת השיטה המתוארת כאן ניתן להכליל באופן פוטנציאלי כדי לקבוע את הצטברות והפצה של סוגים אחרים של חומרים פלואורסצנטיים בשלבי החיים המוקדמים של זברה.

Protocol

דגי זברה בוגרים מקורם במרכז המשאבים של דגי הזברה בסין (ווהאן, סין). הניסויים נערכו בהתאם למדריך הלאומי "הנחיות לבעלי חיים במעבדה לבדיקה אתית של רווחת בעלי חיים (GB/T35892-2018).

1. אוסף עוברים

1. לשמור על דגים 20 L מיכלי זכוכית עם מערכת מי ברז מסונן פחם (pH 7.0 ± 0.2) בטמפרטורה קבועה (28 ± 0 °C (60 °F) על photoperiod של 14:10 שעות אור: כהה.
2. להאכיל דגים פעמיים ביום עם ארטמיה נאופלי. מומלץ כי האוכל ניתן לכל היותר 3% משקל דגים ליום ויש לאכול בתוך 5 דקות בכל פעם¹⁴.
3. מעבירים דג זברה בוגר מפותח (עם אורך גוף של 3-4 ס"מ) למיכל ההשרצה ביחס של זכר אחד לשתי נקבות בלילה שלפני הרבייה.
   הערה: למחרת בבוקר, הדגים מתחילים להשריץ לאחר תחילת מחזור האור.
4. לאסוף ביצים באמצעות פיפטה פסטר. יש לשטוף עם 10% מהתמיסה של האנק מספר פעמים, ולאחר מכן לבדוק אם יש הפריה באמצעות מיקרוסקופ. ביצים מופרות לעבור את תקופת המחשוף לאחר כ 2 שעות לאחר הפריה (hpf) והוא יכול להיות מזוהה בבירור¹⁵.
5. דגירה העוברים מופרית 500 מל המכיל 200 מל של 10% הפתרון של האנק עם 1% כחול מתילן לחיטוי ב 28 °C (69 °F). אין לחרוג מקצב הטעינה של פתרון עובר אחד/2 מ"ל.
   הערה: 10% הפתרון של האנק מורכב 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM_{Na 2}HPO₄, 0.44 מ"מ KH₂PO₄, 1.3 mM CaCl₂, 1.0 mM MgSO₄ ו 4.2 mM NaHCO₃.

2. הכנת מתלים מיקרופלסטיק

1. Sonicate את פתרון המלאי של חרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים ירוקים שכותרתו (10 מ"ג / מ"ל) בקוטר נומינלי של 500 ננומטר (עירור / פליטה: 460/500 ננומטר) במשך 10 דקות.
2. לדלל את פתרון המניה עם 10% הפתרון של האנק לייצר את פתרונות החשיפה הרצויים (0.1, 1, ו 10 מ"ג / ליטר).
3. תמיד להכין את פתרונות החשיפה של מיקרופלסטיק לפני החשיפה.
   הערה: יש לנקוט זהירות בעת הערכת ההשפעות הרעילות של מיקרופלסטיק, כי נוכחותם של חומרים משמרים, כגון נתרן אזיד, בניסוחים החלקיקים המסחריים, יכולה להיות רעילה לאורגניזמים שונים ¹⁶. לכן, תוספים אלה יש להסיר או בחשבון את הפקדים לפני ביצוע ניסוי רעילות.

3. חשיפה מיקרופלסטיק

1. בחר באופן אקראי 6 עוברים מופרים טריים (4 כ"ס), ולאחר מכן העברה לכל באר של צלחת 6 באר המכילה 5 מ"ל של פתרונות מיקרופלסטיק עם ריכוזים שונים. כלול את קבוצות הבקרה המכילות 10% מהפתרון של האנק.
   1. השתמש בארות משולשות (עם סך של 18 עוברים) עבור כל טיפול.
2. דגירה העוברים תחת אותו אור: מחזור כהה וטמפרטורה כמבוגרים (ראה 1.2) ולהתבונן כל 12 שעות. הסר את המתים מיד.
3. לחדש את הפתרונות מיקרופלסטיק 90% כל 24 שעות. במהלך תקופת החשיפה, הדגים אינם ניזונים.
   הערה: בדרך כלל, הבקיעה של העובר מתחילה ב 48 hpf ומשלימה על 72 hpf.

4. הערכת התפלגות מיקרופלסטיק

1. ב 24, 48, 72, 96, ו 120 שעות לאחר ההפריה, לבחור באופן אקראי את העוברים / הזחלים (אחד מכל אחד משלושת השכפולים) ולשטוף עם 10% הפתרון של האנק.
2. מעבירים את הזחלים לצלחת פטרי וחושפים ל-0.016% טריקאין להרדמה.
   1. הכינו את פתרון המלאי של הטריקאין: 4 מ"ג אבקת טריקאין מומסים ב-100 מ"ל של מים מזוקקים כפולים, ומתאימים את ה-pH ל-7.0 עם Tris-HCl (pH 9.0). אחסן את תמיסת המלאי במקפיא.
   2. הכן את פתרון העבודה. לדלל את פתרון המניה לריכוז הרצוי (0.016%) עם 10% הפתרון של האנק בטמפרטורת החדר^14.
3. מסדרים את העוברים/הזחלים ומתכוננים לתצפית.
4. שימו לב לדגים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותמונה עם תוכנת הדמיה.
5. כימתו את עוצמת הפלואורסצנטיות בדגים באמצעות ImageJ.

תוצאות

ההתפלגות וההצטברות של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי מוצגות באיור 1 ובטבלה 1. לא נצפתה פלואורסצנטיות גלויה בקבוצה (פקד) שלא נחשפו. עם זאת, הצטברות של פלואורסצנטיות נמצא סביב chorion לאחר חשיפה לריכוזים שונים של מיקרופלסטיק (24 hpf). פלואורסצנטיות ירוקה מזוהה גם בזחלים, ונראה כ?...

Discussion

על פי ההנחיה להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות, כגון הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU, אישור אתיקה של בעלי חיים אינו חובה לניסוי בשלבי חיים מוקדמים של דגי זברה עד לשלב היכולת להאכיל באופן עצמאי (5 ימים לאחר ההפריה)¹⁷. עם זאת, שיטת הרווחה הטובה ביותר חשובה לאופטימיזציה של השימו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Nikon, Japan	Eclipse Ti-S
Green fluorescently labeled polystyrene beads	Phosphorex, USA	2103A
Tricaine	Sigma-Aldrich, USA	A5040