Evaluación y cuantificación de micro brechas epiteliales en la mucosa colónica mediante tinción de inmunofluorescencia

Resumen

Aquí, describimos un nuevo método para visualizar la ubicación específica donde se mejora la permeabilidad transcelular y paracelular en la mucosa colónica inflamada. En este ensayo, aplicamos un colorante fluorescente de 10 kDa conjugado con un dextrano fijable en lisina para visualizar regiones de alta permeabilidad (HPR) en la mucosa colónica.

Resumen

Las células epiteliales que recubren la mucosa intestinal crean una barrera física que separa el contenido luminal del intersticio. El deterioro de la barrera epitelial se ha asociado con el desarrollo de diversas patologías como las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). En la mucosa inflamada, las erosiones superficiales o microerosiones que corrompen las monocapas epiteliales corresponden a sitios de alta permeabilidad. Varios mecanismos han sido implicados en la formación de microerosiones, incluyendo el desprendimiento celular y la apoptosis. Estas microerosiones a menudo representan brechas epiteliales microscópicas distribuidas aleatoriamente en el colon. La visualización y cuantificación de esas brechas epiteliales se ha convertido en una herramienta importante para investigar la función de la barrera epitelial intestinal. Aquí, describimos un nuevo método para visualizar la ubicación específica donde se mejora la permeabilidad transcelular y paracelular en la mucosa colónica inflamada. En este ensayo, aplicamos un colorante fluorescente de 10 kDa conjugado con un dextrano fijable en lisina para visualizar regiones de alta permeabilidad (HPR) en la mucosa colónica. El uso adicional de marcadores de muerte celular reveló que la HPR abarca focos apoptóticos donde se produce la extrusión/desprendimiento epitelial. El protocolo aquí descrito proporciona un enfoque simple pero efectivo para visualizar y cuantificar las microerosiones en el intestino, que es una herramienta muy útil en modelos de enfermedad, en los que la barrera epitelial intestinal está comprometida.

Introducción

La mucosa gastrointestinal (GI) crea una barrera física que separa el entorno extracelular y el entorno interno del huésped, y participa en la absorción de nutrientes, agua y electrolitos. La barrera intestinal abarca una capa de moco constituida por glicoproteínas, una monocapa de células epiteliales, y la lámina propia subyacente son células inmunes y estromales residen. Las células epiteliales intestinales que forman la barrera física están unidas entre sí por diferentes complejos proteicos, que incluyen la unión adherente (AJ), la unión estrecha (TJ) y los desmosomas (DM). El deterioro de la función de barrera epitelial aumenta la permeabilidad intestinal y permite la translocación de sustancias nocivas y patógenos del lumen al intersticio¹. Cada vez son más las enfermedades en las que la barrera epitelial se ve comprometida, como las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como la enfermedad de Crohn (EC), la colitis ulcerosa (CU) y la colitis indeterminada (CI). La incidencia de la EII está aumentando en todo el mundo, con una prevalencia cercana al 0,5% en Occidente. Aunque las causas de la EII no están claras, la respuesta inmunitaria/inflamatoria excesiva desencadenada en la pared intestinal contribuye directamente a la ruptura de la barrera epitelial al limitar el restablecimiento de la homeostasis epitelial intestinal ^2,3,4. Además, los pacientes con inflamación colónica de larga duración tienen un alto riesgo de desarrollar cáncer colorrectal (CCR)⁵. Otras patologías asociadas a la ruptura de la barrera epitelial intestinal son el síndrome del intestino irritable, la obesidad, la enfermedad celíaca, la sensibilidad al gluten no celíaca y las alergias alimentarias⁶. Por estas razones, existe una necesidad urgente para el desarrollo de enfoques experimentales que permitan analizar la integridad de la barrera epitelial intestinal en modelos animales que imitan la patogénesis que ocurre en humanos.

En este trabajo se evaluó la permeabilidad paracelular pasiva gastrointestinal y la permeabilidad transcelular asociada a un proceso inflamatorio en el epitelio colónico mediante una técnica sencilla. Para investigar el flujo transmural de macromoléculas, medimos la difusión pasiva de FITC-dextrano (4 kDa) y RITC-dextrano (10 kDa) en sacos colónicos ex vivo. Además, mediante la inyección de un dextrano fluorescente fijable en lisina de 10 kDa en la luz de los sacos intestinales, identificamos específicamente las áreas con alta permeabilidad en la mucosa inflamada. El uso de marcadores de apoptosis y anticuerpos contra las proteínas AJ permitió demostrar que las áreas de alta permeabilidad en la mucosa inflamada corresponden a regiones específicas donde las células epiteliales sufren apoptosis y se rompen las uniones célula-célula. Esta nueva técnica se puede utilizar para evaluar la integridad del epitelio en cualquier modelo en el que la barrera epitelial intestinal esté comprometida.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) del CINVESTAV.

1. Preparación de materiales y reactivos

1. Precalentar la solución de Hartmann (130 mM de NaCl, 28 mM de lactato, 4 mM de KCl, 1,5 mM de CaCl₂) a 37 °C mientras burbujea con 95% de O₂/5% de CO₂. Mantener el pH fisiológico (7,4) de la solución.
2. Para analizar la permeabilidad paracelular pasiva, prepare una solución de trabajo disolviendo 1 mg/mL de FITC-Dextrano (4 kDa) y 1 mg/mL de RITC-Dextrano (10 kDa) en una solución de Hartmann precalentada.
3. Prepare una solución de 4 μg/mL de Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) en la solución de Hartmann. Almacene las soluciones de trabajo en un tubo cónico de 15 ml y protéjalas de la luz hasta su uso.
   NOTA: Serán necesarios 300 μL de solución de trabajo por colon.
4. Prepare una sutura quirúrgica cortando dos secciones de 5 cm para cada intestino grueso. Enrolla las suturas en un nudo sin cerrar.

2. Disección y preparación de la tráqueo gastrointestinal

1. Suspenda los alimentos sólidos durante 6 horas antes de sacrificar a los ratones. Proporcionar agua potable ad libitum.
   NOTA: Si es posible, coloque a los ratones en suplementos de gel nutritivo (agua purificada, melaza, calabaza, jarabe de maíz, semillas de girasol, proteína de trigo, aceite vegetal, ácido alimentario, hidrocoloides, electrolitos, fibra de maíz, mezcla mineral NIH-31M, mezcla de vitaminas NIH-31M).
2. Eutanasia de ratones en una cámara de CO₂ seguida de luxación cervical de acuerdo con los protocolos éticos institucionales.
3. Esterilizar el abdomen y el tórax con etanol al 70%.
4. Con unas tijeras, haga una incisión en el centro del abdomen y exponga la cavidad peritoneal.
5. Para fines de orientación, separe y diseccione el intestino grueso cortando en el extremo del intestino delgado (porción final del íleon) justo antes del ciego y luego en el borde anal. Use pinzas quirúrgicas para extraer suavemente el mesenterio y colocar el colon en la solución de Hartmann.
6. Es importante destacar que, con el fin de mantener la consistencia entre los animales, identifique secciones similares y utilícelas para evaluar la permeabilidad. Es muy recomendable utilizar regiones cercanas al ciego.
7. Utilice una jeringa de insulina equipada con una cánula de plástico roma para enjuagar suavemente el contenido luminal presente en el colon. Si las heces son firmes, empuje con cuidado con la ayuda de pinzas romas. Una vez eliminadas las heces, lavar 3 veces con 400 μL de solución de Hartmann.
8. Amarre la región proximal (la más cercana al ciego) y coloque un asa de sutura preatada en la región distal del colon. Con la ayuda de una jeringa equipada con una cánula de plástico roma, llene el saco intestinal con la solución que contiene la sonda de deseo. Retire con cuidado la cánula de plástico y ate el lazo en la región distal.
9. Colocar el saco intestinal en un tubo cónico de 15 mL con 6 mL de solución de Hartmann e incubar durante 1 h para evaluar el flujo paracelular pasivo de FITC/RITC-Dextrano o 30 min para analizar el flujo de Alexa Fluor Fixable-Dextran.
   1. Mantener los tubos cónicos que contienen los sacos intestinales a 37 °C con 5% de CO₂ y proteger de la luz.
10. Medir la permeabilidad pasiva utilizando FITC/RITC-Dextran. A los 0 y 60 min, tome una muestra de 100 μL del tubo cónico y transfiérala a una placa de 96 pocillos. Vuelva a añadir 100 μL de medios nuevos para reemplazar el volumen perdido.
11. Muestras de medición y estándares para FITC/RITC en un lector de placas fluorescentes (excitación/emisión FITC: 495 nm/519 nm; Excitación/emisión RITC: 570/595 nm).
12. Para medir la permeabilidad pasiva con Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran, retire los intestinos, corte cerca del nudo de amarre quirúrgico y corte el intestino para exponer el lumen para eliminar la solución con la sonda. Lave el lumen del intestino 2 veces con solución fría de Hartmann.
13. Coloque el tejido en un molde de tejido previamente lleno con compuesto de temperatura óptima de corte (O.C.T.). Oriente el tejido vertical u horizontalmente según el lado a seccionar. Almacene las muestras a -80 °C.

3. Tinción inmunofluorescente

1. Fije las secciones congeladas de 20 micrómetros con paraformaldehído (PFA) al 3,7% durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego lave 3 veces con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS; 37 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ y 1,8 mM KH₂ PO₄).
   NOTA: Las secciones verticales de los intestinos tienden a desprenderse si los lavados son muy fuertes.
2. Permeabilizar con 0.2% TX-100/PBS durante 12 min a temperatura ambiente y luego lavar 3 veces con PBS frío.
3. Bloquee con 0.2% BSA/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. Diluir el anticuerpo primario en solución bloqueante e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con PBS frío.
5. Incubar durante 1 h con anticuerpos secundarios en solución bloqueante. Lavar 3 veces con PBS frío.
6. Aplique medio de montaje a los cortes y selle con un cubreobjetos. Los portaobjetos pueden almacenarse hasta 3 meses a -20 °C.

Resultados

En la mucosa inflamada, las erosiones superficiales o microerosiones comprometen la integridad de la monocapa de células epiteliales y representan sitios de alta permeabilidad ^7,8. Para evaluar estas posibilidades, analizamos la permeabilidad pasiva en la mucosa colónica inflamada en un modelo murino de colitis por sulfato sódico de dextrano. En resumen, durante 5 días, los ratones C57BL/6J recibieron un 2,5% de DSS (p/v, 40-...

Discusión

La homeostasis epitelial resultante del equilibrio de la proliferación celular y la apoptosis epitelial mantiene una barrera intestinal adecuada y funcional. Muchos trastornos clínicos, como la EII, se acompañan o caracterizan por alteraciones de la permeabilidad intestinal, inflamación de la mucosa y alteración de la homeostasis epitelial¹. La interacción entre esos procesos sigue siendo muy controvertida. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos enfoques de i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Caspase-3 antibody (1:1000)	Cell signaling	9664	Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti rabbit (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)	Invitrogen	A21209
Confocal microscope (Leica TCS SP8x)	Leica		HyD detectors  and White Light Laser
E-Cadherin antibody (1:750)	Sigma	MABT26	Rat monoclonal Delma-1 antibody
Ethanol 70%	Generic
Fixable-Dextran	Invitrogen	D22914	Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, anionic, fixable
FITC Dextran	Sigma	46944	Fluorescein isothiocyanate–dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's Solution	PiSA	HT PiSA
Incubator (AutoFlow NU-8500)	Nuaire
Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Black and White Polystyrene Plate	ThermoFisher Scientific
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phalloidin (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran	Sigma	R8881-100MG	Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
Secondary antibodies (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP-conjugated secondary antibodies
Suture threads	Generic		Braided silk and braided polyester surgical sutures are prefered.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1