Avaliação e quantificação de microlacunas epiteliais na mucosa colônica usando coloração por imunofluorescência

Resumo

Aqui, descrevemos um novo método para visualizar a localização específica de onde a permeabilidade transcelular e paracelular é aumentada na mucosa colônica inflamada. Neste ensaio, aplicamos um corante fluorescente de 10 kDa conjugado a um dextrano fixável em lisina para visualizar regiões de alta permeabilidade (HPR) na mucosa colônica.

Resumo

As células epiteliais que revestem a mucosa intestinal criam uma barreira física que separa o conteúdo luminal do interstício. O comprometimento da barreira epitelial tem sido associado ao desenvolvimento de várias patologias, como doenças inflamatórias intestinais (DII). Na mucosa inflamada, erosões superficiais ou microerosões que corrompem as monocamadas epiteliais correspondem a locais de alta permeabilidade. Vários mecanismos têm sido implicados na formação de microerosões, incluindo derramamento celular e apoptose. Essas microerosões geralmente representam lacunas epiteliais microscópicas distribuídas aleatoriamente no cólon. A visualização e quantificação dessas lacunas epiteliais emergiu como uma ferramenta importante para investigar a função da barreira epitelial intestinal. Aqui, descrevemos um novo método para visualizar a localização específica de onde a permeabilidade transcelular e paracelular é aumentada na mucosa colônica inflamada. Neste ensaio, aplicamos um corante fluorescente de 10 kDa conjugado a um dextrano fixável em lisina para visualizar regiões de alta permeabilidade (HPR) na mucosa colônica. O uso adicional de marcadores de morte celular revelou que o HPR abrange focos apoptóticos onde ocorre extrusão/derramamento epitelial. O protocolo aqui descrito fornece uma abordagem simples, mas eficaz, para visualizar e quantificar microerosões no intestino, o que é uma ferramenta muito útil em modelos de doenças, nos quais a barreira epitelial intestinal está comprometida.

Introdução

A mucosa gastrointestinal (GI) cria uma barreira física que separa o ambiente extracelular e o meio interno do hospedeiro e está envolvida na absorção de nutrientes, água e eletrólitos. A barreira intestinal engloba uma camada de muco constituída de glicoproteínas, uma monocamada de células epiteliais e a lâmina própria subjacente são células imunes e estromais. As células epiteliais intestinais que formam a barreira física estão ligadas entre si por diferentes complexos proteicos, que incluem a junção aderente (AJ), a junção apertada (TJ) e os desmossomos (DMs). O comprometimento da função de barreira epitelial aumenta a permeabilidade intestinal e permite a translocação de substâncias nocivas e patógenos do lúmen para o interstício¹. Há um número crescente de doenças em que a barreira epitelial está comprometida, como as doenças inflamatórias intestinais (DII) como a doença de Crohn (DC), colite ulcerativa () e colite indeterminada (CI). A incidência de DII está aumentando em todo o mundo, com uma prevalência próxima a 0,5% no Ocidente. Embora as causas da DII não sejam claras, a resposta imunológica/inflamatória excessiva desencadeada na parede intestinal contribui diretamente para a ruptura da barreira epitelial, limitando o restabelecimento da homeostase epitelial intestinal ^2,3,4. Além disso, pacientes com inflamação colônica de longa duração apresentam alto risco de desenvolver câncer colorretal (CCR)⁵. Outras patologias associadas à ruptura da barreira epitelial intestinal são síndrome do intestino irritável, obesidade, doença celíaca, sensibilidade ao glúten não celíaca e alergias alimentares⁶. Por essas razões, há uma necessidade urgente do desenvolvimento de abordagens experimentais que permitam a análise da integridade da barreira epitelial intestinal em modelos animais mimetizando a patogênese que ocorre em humanos.

Aqui, avaliamos a permeabilidade passiva paracelular gastrointestinal e a permeabilidade transcelular associada a um processo inflamatório no epitélio colônico usando uma técnica simples. Para investigar o fluxo transmural de macromoléculas, medimos a difusão passiva de FITC-dextrano (4 kDa) e RITC-dextrano (10 kDa) em sacos colônicos ex vivo. Além disso, ao injetar um dextrano fluorescente de 10 kDa fixável em lisina no lúmen dos sacos intestinais, identificamos especificamente as áreas com alta permeabilidade na mucosa inflamada. O uso de marcadores de apoptose e anticorpos contra proteínas AJ nos permitiu demonstrar que áreas de alta permeabilidade na mucosa inflamada correspondem a regiões específicas onde as células epiteliais sofrem apoptose e as junções célula-célula são interrompidas. Esta nova técnica pode ser usada para avaliar a integridade do epitélio em qualquer modelo em que a barreira epitelial intestinal esteja comprometida.

Protocolo

Todos os procedimentos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (CICUAL) do CINVESTAV.

1. Preparação de materiais e reagentes

1. Pré-aqueça a solução de Hartmann (130 mM de NaCl, 28 mM de lactato, 4 mM de KCl, 1,5 mM de CaCl₂) a 37 ° C enquanto borbulha com 95% de O₂/5% de CO₂. Manter o pH fisiológico (7,4) da solução.
2. Para analisar a permeabilidade paracelular passiva, prepare uma solução de trabalho dissolvendo 1 mg/mL de FITC-Dextrano (4 kDa) e 1 mg/mL de RITC-Dextrano (10 kDa) em solução de Hartmann pré-aquecida.
3. Prepare uma solução de 4 μg/ml de Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) na solução de Hartmann. Armazene as soluções de trabalho em um tubo cônico de 15 mL e proteja da luz até o uso.
   NOTA: Serão necessários 300 μL de solução de trabalho por cólon.
4. Prepare uma sutura cirúrgica cortando duas seções de 5 cm para cada intestino grosso. Enrole as suturas em um nó não fechado.

2. Dissecção e preparação do trac gastrointestinal

1. Retenha alimentos sólidos por 6 horas antes de sacrificar os ratos. Forneça água potável ad libitum.
   NOTA: Se possível, coloque os ratos em suplementos de gel nutritivo (Água purificada, Melaço, Abóbora, Xarope de Milho, Sementes de Girassol, Proteína de Trigo, Óleo Vegetal, Ácido Alimentar, Hidrocolóides, Eletrólitos, Fibra de Milho, Mistura Mineral NIH-31M, Mistura de Vitaminas NIH-31M).
2. Eutanasiar camundongos em uma câmara de CO₂ seguida de luxação cervical de acordo com os protocolos de ética institucional.
3. Esterilize o abdômen e o tórax com etanol a 70%.
4. Usando uma tesoura, faça uma incisão no meio do abdômen e exponha a cavidade peritoneal.
5. Para fins de orientação, separe e disseque o intestino grosso cortando no final do intestino delgado (porção final do íleo) logo antes do ceco e depois na borda anal. Use uma pinça cirúrgica para remover suavemente o mesentério e coloque o cólon na solução de Hartmann.
6. É importante ressaltar que, para manter a consistência entre os animais, identifique seções semelhantes e use para avaliar a permeabilidade. O uso de regiões próximas ao ceco é altamente recomendável.
7. Use uma seringa de insulina equipada com uma cânula de plástico embotada para lavar suavemente o conteúdo luminal presente no cólon. Se as fezes estiverem firmes, empurre cuidadosamente com a ajuda de uma pinça romba. Após a remoção das fezes, lave 3 vezes com 400 μL de solução de Hartmann.
8. Amarre a região proximal (a mais próxima do ceco) e coloque uma alça de sutura pré-amarrada na região distal do cólon. Com a ajuda de uma seringa equipada com uma cânula de plástico embotada, encha o saco intestinal com a solução que contém a sonda de desejo. Remova cuidadosamente a cânula de plástico e amarre o laço na região distal.
9. Coloque o saco intestinal em um tubo cônico de 15 mL com 6 mL de solução de Hartmann e incube por 1 h para avaliar o fluxo paracelular passivo de FITC/RITC-Dextran ou 30 min para analisar o fluxo do Alexa Fluor Fixable-Dextran.
   1. Manter os tubos cónicos que contêm os sacos intestinais a 37 °C com 5% de CO₂ e proteger da luz.
10. Medir a permeabilidade passiva usando FITC/RITC-Dextran. Em 0 e 60 min, pegue uma amostra de 100 μL do tubo cônico e transfira para uma placa de 96 poços. Adicione novamente 100 μL de mídia nova para substituir o volume perdido.
11. Meça amostras e padrões para FITC/RITC em um leitor de placas fluorescentes (excitação/emissão FITC: 495 nm/519 nm; Excitação/emissão RITC: 570/595 nm).
12. Para medir a permeabilidade passiva usando Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran, remova os intestinos, corte rente ao nó do laço cirúrgico e corte o intestino para expor o lúmen para remover a solução com a sonda. Lave o lúmen do intestino 2 vezes com solução fria de Hartmann.
13. Coloque o tecido em um molde de tecido previamente preenchido com composto de temperatura de corte ideal (OCT). Oriente o tecido vertical ou horizontalmente de acordo com o lado a ser seccionado. Armazenar as amostras a -80 °C.

3. Coloração imunofluorescente

1. Fixe seções congeladas de 20 micrômetros com paraformaldeído (PFA) a 3,7% por 20 min em temperatura ambiente e, em seguida, lave 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS; 37 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ e 1,8 mM KH₂ PO₄).
   NOTA: As seções verticais dos intestinos tendem a sair se as lavagens forem muito fortes.
2. Permeabilize com 0,2% de TX-100/PBS por 12 min em temperatura ambiente e depois lave 3 vezes com PBS frio.
3. Bloco com 0,2% BSA/PBS por 1 hora em temperatura ambiente.
4. Diluir o anticorpo primário em solução de bloqueio e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Lave 3 vezes com PBS frio.
5. Incubar durante 1 h com anticorpos secundários em solução de bloqueio. Lave 3 vezes com PBS frio.
6. Aplique o meio de montagem nos cortes e sele com uma lamínula. As lâminas podem ser armazenadas por até 3 meses a -20 °C.

Resultados

Na mucosa inflamada, erosões superficiais ou microerosões comprometem a integridade da monocamada de células epiteliais e representam locais de alta permeabilidade ^7,8. Para avaliar tais possibilidades, analisamos a permeabilidade passiva na mucosa colônica inflamada em um modelo murino de colite com sulfato de sódio dextrano. Em resumo, por 5 dias, camundongos C57BL / 6J receberam 2,5% de DSS (p / v, 40-50 kDa) dissolvido e...

Discussão

A homeostase epitelial resultante do equilíbrio da proliferação celular e da apoptose epitelial mantém uma barreira intestinal adequada e funcional. Muitos distúrbios clínicos, como a DII, são acompanhados ou caracterizados por alterações na permeabilidade intestinal, inflamação da mucosa e ruptura da homeostase epitelial¹. A interação entre esses processos ainda é altamente controversa. Portanto, o desenvolvimento de novas abordagens de pesquisa par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Caspase-3 antibody (1:1000)	Cell signaling	9664	Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti rabbit (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)	Invitrogen	A21209
Confocal microscope (Leica TCS SP8x)	Leica		HyD detectors  and White Light Laser
E-Cadherin antibody (1:750)	Sigma	MABT26	Rat monoclonal Delma-1 antibody
Ethanol 70%	Generic
Fixable-Dextran	Invitrogen	D22914	Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, anionic, fixable
FITC Dextran	Sigma	46944	Fluorescein isothiocyanate–dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's Solution	PiSA	HT PiSA
Incubator (AutoFlow NU-8500)	Nuaire
Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Black and White Polystyrene Plate	ThermoFisher Scientific
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phalloidin (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran	Sigma	R8881-100MG	Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
Secondary antibodies (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP-conjugated secondary antibodies
Suture threads	Generic		Braided silk and braided polyester surgical sutures are prefered.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1