Valutazione e quantificazione delle lacune micro epiteliali nella mucosa del colon mediante colorazione in immunofluorescenza

Riepilogo

Qui, descriviamo un nuovo metodo per visualizzare la posizione specifica in cui la permeabilità transcellulare e paracellulare è migliorata nella mucosa del colon infiammata. In questo saggio, applichiamo un colorante fluorescente da 10 kDa coniugato a un destrano fissabile con lisina per visualizzare le regioni ad alta permeabilità (HPR) nella mucosa del colon.

Abstract

Le cellule epiteliali che rivestono la mucosa intestinale creano una barriera fisica che separa il contenuto luminale dall'interstizio. La compromissione della barriera epiteliale è stata associata allo sviluppo di varie patologie come le malattie infiammatorie intestinali (IBD). Nella mucosa infiammata, le erosioni superficiali o le microerosioni che corrompono i monostrati epiteliali corrispondono a siti di elevata permeabilità. Diversi meccanismi sono stati implicati nella formazione di microerosioni, tra cui la perdita di cellule e l'apoptosi. Queste microerosioni rappresentano spesso lacune epiteliali microscopiche distribuite in modo casuale nel colon. La visualizzazione e la quantificazione di tali lacune epiteliali è emersa come uno strumento importante per studiare la funzione della barriera epiteliale intestinale. Qui, descriviamo un nuovo metodo per visualizzare la posizione specifica in cui la permeabilità transcellulare e paracellulare è migliorata nella mucosa del colon infiammata. In questo saggio, applichiamo un colorante fluorescente da 10 kDa coniugato a un destrano fissabile con lisina per visualizzare le regioni ad alta permeabilità (HPR) nella mucosa del colon. L'uso aggiuntivo di marcatori di morte cellulare ha rivelato che l'HPR comprende focolai apoptotici in cui si verifica l'estrusione/spargimento epiteliale. Il protocollo qui descritto fornisce un approccio semplice ma efficace per visualizzare e quantificare le microerosioni nell'intestino, che è uno strumento molto utile nei modelli di malattia, in cui la barriera epiteliale intestinale è compromessa.

Introduzione

La mucosa gastrointestinale (GI) crea una barriera fisica che separa l'ambiente extracellulare e l'ambiente interno dell'ospite ed è coinvolta nell'assorbimento di nutrienti, acqua ed elettroliti. La barriera intestinale comprende uno strato di muco costituito da glicoproteine, un monostrato di cellule epiteliali e la sottostante lamina propria dove risiedono le cellule immunitarie e stromali. Le cellule epiteliali intestinali che formano la barriera fisica sono collegate tra loro da diversi complessi proteici, che includono la giunzione aderente (AJ), la giunzione stretta (TJ) e i desmosomi (DM). La compromissione della funzione della barriera epiteliale aumenta la permeabilità intestinale e consente la traslocazione di sostanze nocive e patogeni dal lume all'interstizio¹. C'è un numero crescente di malattie in cui la barriera epiteliale è compromessa, come le malattie infiammatorie intestinali (IBD) come il morbo di Crohn (CD), la colite ulcerosa (UC) e la colite indeterminata (IC). L'incidenza delle IBD è in aumento in tutto il mondo, con una prevalenza che si avvicina allo 0,5% in Occidente. Sebbene le cause dell'IBD non siano chiare, l'eccessiva risposta immunitaria/infiammatoria innescata nella parete intestinale contribuisce direttamente alla rottura della barriera epiteliale limitando il ristabilimento dell'omeostasi epiteliale intestinale ^2,3,4. Inoltre, i pazienti con infiammazione del colon di lunga data sono ad alto rischio di sviluppare il cancro del colon-retto (CRC)⁵. Altre patologie associate alla rottura della barriera epiteliale intestinale sono la sindrome dell'intestino irritabile, l'obesità, la celiachia, la sensibilità al glutine non celiaca e le allergie alimentari⁶. Per questi motivi, vi è un urgente bisogno di sviluppare approcci sperimentali che consentano l'analisi dell'integrità della barriera epiteliale intestinale in modelli animali che imitano la patogenesi che si verifica nell'uomo.

Qui, abbiamo valutato la paracellulare passiva gastrointestinale e la permeabilità transcellulare associata a un processo infiammatorio nell'epitelio del colon utilizzando una semplice tecnica. Per studiare il flusso transmurale delle macromolecole, abbiamo misurato la diffusione passiva di FITC-destrano (4 kDa) e RITC-destrano (10 kDa) nelle sacche del colon ex vivo. Inoltre, iniettando un destrano fluorescente fissabile con lisina da 10 kDa nel lume delle sacche intestinali, abbiamo identificato in modo specifico le aree con elevata permeabilità nella mucosa infiammata. L'uso di marcatori di apoptosi e anticorpi contro le proteine AJ ci ha permesso di dimostrare che aree ad alta permeabilità nella mucosa infiammata corrispondono a regioni specifiche in cui le cellule epiteliali subiscono apoptosi e le giunzioni cellula-cellula sono interrotte. Questa nuova tecnica può essere utilizzata per valutare l'integrità dell'epitelio in qualsiasi modello in cui la barriera epiteliale intestinale è compromessa.

Protocollo

Tutte le procedure sono state esaminate e approvate dal Comitato istituzionale CINVESTAV per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (CICUAL).

1. Preparazione dei materiali e dei reagenti

1. Preriscaldare la soluzione di Hartmann (130 mM di NaCl, 28 mM di lattato, 4 mM di KCl, 1,5 mM di CaCl₂) a 37 °C mentre gorgoglia con il 95% di O₂/5% di CO₂. Mantenere il pH fisiologico (7,4) della soluzione.
2. Per analizzare la permeabilità paracellulare passiva, preparare una soluzione di lavoro sciogliendo 1 mg/mL di FITC-destrano (4 kDa) e 1 mg/mL di RITC-destrano (10 kDa) in una soluzione di Hartmann preriscaldata.
3. Preparare una soluzione da 4 μg/mL di Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) nella soluzione di Hartmann. Conservare le soluzioni di lavoro in una provetta conica da 15 ml e proteggerle dalla luce fino all'uso.
   NOTA: Saranno necessari 300 μL di soluzione di lavoro per colon.
4. Preparare una sutura chirurgica tagliando due sezioni di 5 cm per ogni intestino crasso. Avvolgere le suture in un nodo non chiuso.

2. Dissezione e preparazione del tratto gastrointestinale

1. Trattenere il cibo solido per 6 ore prima di sopprimere i topi. Fornire acqua potabile ad libitum.
   NOTA: Se possibile, metti i topi su integratori di gel nutritivi (acqua purificata, melassa, zucca, sciroppo di mais, semi di girasole, proteine del grano, olio vegetale, acido alimentare, idrocolloidi, elettroliti, fibra di mais, miscela di minerali NIH-31M, miscela di vitamine NIH-31M).
2. Eutanasia dei topi in una camera di CO₂ seguita da lussazione cervicale in conformità con i protocolli etici istituzionali.
3. Sterilizzare l'addome e il torace con etanolo al 70%.
4. Usando un paio di forbici, praticare un'incisione al centro dell'addome ed esporre la cavità peritoneale.
5. A scopo di orientamento, separare e sezionare l'intestino crasso tagliando alla fine dell'intestino tenue (parte terminale dell'ileo) subito prima del cieco e poi al bordo anale. Usa una pinza chirurgica per rimuovere delicatamente il mesentere e posizionare il colon nella soluzione di Hartmann.
6. È importante sottolineare che, al fine di mantenere la coerenza tra gli animali, identificare sezioni simili e utilizzarle per valutare la permeabilità. Si consiglia vivamente di utilizzare regioni vicine al cieco.
7. Utilizzare una siringa da insulina dotata di una cannula di plastica smussata per lavare delicatamente il contenuto luminale presente nel colon. Se le feci sono sode, spingere con cautela con l'aiuto di una pinza smussata. Dopo che le feci sono state rimosse, lavare 3 volte con 400 μl di soluzione di Hartmann.
8. Legare la regione prossimale (quella più vicina al cieco) e posizionare un anello di sutura pre-legato nella regione distale del colon. Con l'aiuto di una siringa dotata di cannula di plastica smussata, riempire il sacco intestinale con la soluzione contenente la sonda del desiderio. Rimuovere con cautela la cannula di plastica e legare l'anello nella regione distale.
9. Posizionare il sacco intestinale in una provetta conica da 15 mL con 6 mL di soluzione di Hartmann e incubare per 1 ora per valutare il flusso paracellulare passivo di FITC/RITC-Dextran o 30 min per analizzare il flusso di Alexa Fluor Fixable-Dextran.
   1. Mantenere i tubi conici contenenti le sacche intestinali a 37 °C con il 5% di CO₂ e proteggere dalla luce.
10. Per misurare la permeabilità passiva utilizzando FITC/RITC-Dextran. A 0 e 60 minuti, prelevare un campione da 100 μl dalla provetta conica e trasferirlo in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere nuovamente 100 μl di terreno fresco per sostituire il volume perso.
11. Misurare campioni e standard per FITC/RITC su un lettore di piastre fluorescenti (eccitazione/emissione FITC: 495 nm/519 nm; Eccitazione/emissione RITC: 570/595 nm).
12. Per misurare la permeabilità passiva utilizzando Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran, rimuovere l'intestino, tagliare vicino al nodo chirurgico e tagliare l'intestino per esporre il lume per rimuovere la soluzione con la sonda. Lavare il lume dell'intestino 2 volte con la soluzione fredda di Hartmann.
13. Posizionare il fazzoletto in uno stampo precedentemente riempito con il composto della Temperatura di Taglio Ottimale (O.C.T.). Orientare il tessuto verticalmente o orizzontalmente a seconda del lato da sezionare. Conservare i campioni a -80 °C.

3. Colorazione immunofluorescente

1. Fissare le sezioni congelate di 20 micrometri con paraformaldeide (PFA) al 3,7% per 20 minuti a temperatura ambiente e quindi lavare 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS; 37 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ e 1,8 mM KH₂ PO₄).
   NOTA: Le sezioni verticali dall'intestino tendono a staccarsi se i lavaggi sono molto forti.
2. Permeabilizzare con TX-100/PBS allo 0,2% per 12 minuti a temperatura ambiente e poi lavare 3 volte con PBS freddo.
3. Bloccare con 0,2% BSA/PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Diluire l'anticorpo primario in soluzione bloccante e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con PBS freddo.
5. Incubare per 1 ora con anticorpi secondari in soluzione bloccante. Lavare 3 volte con PBS freddo.
6. Applicare il mezzo di montaggio sui tagli e sigillare con un vetrino coprioggetti. I vetrini possono essere conservati fino a 3 mesi a -20 °C.

Risultati

Nella mucosa infiammata, erosioni superficiali o microerosioni compromettono l'integrità del monostrato cellulare epiteliale e rappresentano siti di elevata permeabilità ^7,8. Per valutare tali possibilità, abbiamo analizzato la permeabilità passiva nella mucosa del colon infiammata in un modello murino di colelite con destrano solfato di sodio. In breve, per 5 giorni, i topi C57BL/6J hanno ricevuto il 2,5% di DSS (p/v, 40-50 ...

Discussione

L'omeostasi epiteliale derivante dal bilanciamento della proliferazione cellulare e dell'apoptosi epiteliale mantiene una barriera intestinale corretta e funzionale. Molti disturbi clinici, come l'IBD, sono accompagnati o caratterizzati da alterazioni della permeabilità intestinale, infiammazione della mucosa e interruzione dell'omeostasi epiteliale¹. L'interazione tra questi processi è ancora molto controversa. Pertanto, lo sviluppo di nuovi approcci di ricerca...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Caspase-3 antibody (1:1000)	Cell signaling	9664	Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti rabbit (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)	Invitrogen	A21209
Confocal microscope (Leica TCS SP8x)	Leica		HyD detectors  and White Light Laser
E-Cadherin antibody (1:750)	Sigma	MABT26	Rat monoclonal Delma-1 antibody
Ethanol 70%	Generic
Fixable-Dextran	Invitrogen	D22914	Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, anionic, fixable
FITC Dextran	Sigma	46944	Fluorescein isothiocyanate–dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's Solution	PiSA	HT PiSA
Incubator (AutoFlow NU-8500)	Nuaire
Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Black and White Polystyrene Plate	ThermoFisher Scientific
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phalloidin (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran	Sigma	R8881-100MG	Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
Secondary antibodies (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP-conjugated secondary antibodies
Suture threads	Generic		Braided silk and braided polyester surgical sutures are prefered.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1