הערכה וכימות של פערים מיקרו-אפיתל ברירית המעי הגס באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה חדשה להמחשת המיקום הספציפי שבו החדירות הטרנס-תאית והפרא-תאית מוגברת ברירית המעי הגס המודלקת. בבדיקה זו, אנו מיישמים צבע פלואורסצנטי של 10 kDa מצומד לדקסטרן הניתן לתיקון ליזין כדי לדמיין אזורי חדירות גבוהה (HPR) ברירית המעי הגס.

Abstract

תאי אפיתל המצפים את רירית המעי יוצרים מחסום פיזי המפריד בין תכולת הלומינל לבין האינטרסטיציום. פגיעה במחסום האפיתל נקשרה להתפתחות פתולוגיות שונות כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD). ברירית המודלקת, שחיקות שטחיות או מיקרו-שחיקה המשחיתות את שכבות האפיתל תואמות לאתרים בעלי חדירות גבוהה. מספר מנגנונים היו מעורבים בהיווצרות מיקרו-שחיקה, כולל שפיכת תאים ואפופטוזיס. מיקרו-שחיקה זו מייצגת לעתים קרובות פערי אפיתל מיקרוסקופיים המפוזרים באופן אקראי במעי הגס. הדמיה וכימות של פערי האפיתל הללו התגלו ככלי חשוב לחקירת תפקוד מחסום האפיתל במעי. כאן, אנו מתארים שיטה חדשה להמחשת המיקום הספציפי שבו החדירות הטרנס-תאית והפרא-תאית מוגברת ברירית המעי הגס המודלקת. בבדיקה זו, אנו מיישמים צבע פלואורסצנטי של 10 kDa מצומד לדקסטרן הניתן לתיקון ליזין כדי לדמיין אזורי חדירות גבוהה (HPR) ברירית המעי הגס. שימוש נוסף בסמני מוות תאים גילה כי HPR מקיף מוקדים אפופטוטיים שבהם מתרחשת שחול/נשירה של אפיתל. הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה פשוטה אך יעילה להמחשה וכימות של מיקרו-שחיקה במעי, שהיא כלי שימושי מאוד במודלים של מחלות, שבהם מחסום האפיתל של המעי נפגע.

Introduction

רירית מערכת העיכול (GI) יוצרת מחסום פיזי המפריד בין הסביבה החוץ-תאית לסביבה המארחת הפנימית, ומעורבת בספיגת חומרים מזינים, מים ואלקטרוליטים. מחסום המעי מקיף שכבת ריר המורכבת מגליקופרוטאינים, שכבה אחת של תאי אפיתל, והלמינה פרופריה הבסיסית הם תאי חיסון וסטרומה. תאי אפיתל המעי היוצרים את המחסום הפיזי מקושרים זה לזה על ידי קומפלקסים חלבונים שונים, הכוללים את צומת הדבקים (AJ), הצומת ההדוק (TJ) והדסמוזומים (DMs). ליקוי בתפקוד מחסום האפיתל מגביר את חדירות המעיים ומאפשר העברה של חומרים מזיקים ופתוגנים מהלומן לאינטרסטיציום¹. יש מספר הולך וגדל של מחלות שבהן מחסום האפיתל נפגע, כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) כמו מחלת קרוהן (CD), קוליטיס כיבית (UC) וקוליטיס לא מוגדרת (IC). שכיחות IBD עולה ברחבי העולם, עם שכיחות המתקרבת ל-0.5% במערב. למרות שהגורמים ל-IBD אינם ברורים, התגובה החיסונית/דלקתית המוגזמת המופעלת בדופן המעי תורמת ישירות לשיבוש מחסום האפיתל על ידי הגבלת ההקמה מחדש של הומאוסטזיס אפיתל במעי ^2,3,4. בנוסף, חולים עם דלקת מעי גס ממושכת נמצאים בסיכון גבוה לפתח סרטן המעי הגס (CRC)⁵. פתולוגיות אחרות הקשורות להפרעה במחסום האפיתל במעי הן תסמונת המעי הרגיז, השמנת יתר, מחלת צליאק, רגישות לגלוטן שאינה צליאק ואלרגיות למזון⁶. מסיבות אלה, יש צורך דחוף בפיתוח גישות ניסיוניות המאפשרות ניתוח של שלמות מחסום האפיתל במעי במודלים של בעלי חיים המחקים את הפתוגנזה המתרחשת בבני אדם.

כאן, הערכנו את החדירות הפרה-תאית הפסיבית במערכת העיכול ואת החדירות הטרנס-תאית הקשורה לתהליך דלקתי באפיתל המעי הגס באמצעות טכניקה פשוטה. כדי לחקור את הזרימה הטרנסמורלית של מקרומולקולות, מדדנו את הדיפוזיה הפסיבית של FITC-dextan (4 kDa) ו-RITC-dextan (10 kDa) בשקי המעי הגס ex vivo. יתר על כן, על ידי הזרקת דקסטרן פלואורסצנטי של 10 kDa הניתן לתיקון ליזין ללומן של שקי המעי, זיהינו באופן ספציפי את האזורים עם חדירות גבוהה ברירית המודלקת. השימוש בסמני אפופטוזיס ונוגדנים כנגד חלבוני AJ איפשר לנו להוכיח שאזורים בעלי חדירות גבוהה ברירית המודלקת תואמים לאזורים ספציפיים שבהם תאי אפיתל עוברים אפופטוזיס וצמתים בין תאים מופרעים. ניתן להשתמש בטכניקה חדשה זו כדי להעריך את שלמות האפיתל בכל מודל שבו מחסום האפיתל של המעי נפגע.

Protocol

כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (CICUAL).

1. הכנת חומרים וריאגנטים

1. יש לחמם מראש את תמיסת הרטמן (130 מ"מ NaCl, 28 מ"מ לקטט, 4 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ CaCl₂) ל-37 מעלות צלזיוס תוך בעבוע עם 95% O₂/5% CO₂. שמור על pH פיזיולוגי (7.4) לתמיסה.
2. לניתוח החדירות הפרה-תאית הפסיבית, הכינו פתרון עבודה על ידי המסה של 1 מ"ג/מ"ל של FITC-Dextran (4 kDa) ו-1 מ"ג/מ"ל של RITC-Dextran (10 kDa) בתמיסת הרטמן שחוממה מראש.
3. הכן תמיסה של 4 מיקרוגרם/מ"ל של Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) בתמיסה של הרטמן. אחסן פתרונות עבודה בצינור חרוטי של 15 מ"ל והגן מפני האור עד לשימוש.
   הערה: יהיה צורך ב-300 מיקרוליטר של תמיסת עבודה לכל מעי גס.
4. הכן תפר כירורגי על ידי חיתוך שני חלקים של 5 ס"מ לכל מעי גס. לולאה את התפרים לקשר לא סגור.

2. דיסקציה והכנה של הטראק במערכת העיכול

1. יש למנוע מזון מוצק למשך 6 שעות לפני המתת חסד של העכברים. ספק מי שתייה אד ליביטום.
   הערה: במידת האפשר, יש להניח את העכברים על תוספי ג'ל תזונתיים (מים מטוהרים, דבשה, דלעת, סירופ תירס, זרעי חמניות, חלבון חיטה, שמן צמחי, חומצת מזון, הידרוקולואידים, אלקטרוליטים, סיבי תירס, תערובת מינרלים NIH-31M, תערובת ויטמינים NIH-31M).
2. המתת חסד של עכברים בתא CO₂ ואחריו פריקת צוואר הרחם בהתאם לפרוטוקולי האתיקה המוסדיים.
3. עקר את הבטן ובית החזה עם 70% אתנול.
4. בעזרת מספריים מבצעים חתך באמצע הבטן וחושפים את חלל הצפק.
5. למטרות התמצאות, הפרד ונתח את המעי הגס על ידי חיתוך בקצה המעי הדק (החלק הסופי של האילאום) ממש לפני הצקום ולאחר מכן בקצה פי הטבעת. השתמש במלקחיים כירורגיים כדי להסיר בעדינות את המזנטריה ולהניח את המעי הגס בתמיסה של הרטמן.
6. חשוב לציין, על מנת לשמור על עקביות בין בעלי חיים, זהה קטעים דומים והשתמש בהם כדי להעריך חדירות. מומלץ מאוד להשתמש באזורים הקרובים ל-cecum.
7. השתמש במזרק אינסולין המצויד בצינורית פלסטיק קהה כדי לשטוף בעדינות את תכולת הלומינל הקיימת במעי הגס. אם הצואה יציבה, דחף בזהירות בעזרת מלקחיים קהים. לאחר הסרת הצואה יש לשטוף 3 פעמים עם 400 מיקרוליטר מתמיסת הרטמן.
8. קושרים את האזור הפרוקסימלי (הקרוב ביותר לצקום) ומניחים לולאת תפר קשורה מראש באזור הדיסטלי של המעי הגס. בעזרת מזרק המצויד בצינורית פלסטיק קהה, מלאו את שק המעי בתמיסה המכילה את בדיקת התשוקה. הסר בזהירות את צינורית הפלסטיק וקשר את הלולאה באזור הדיסטלי.
9. הנח את שק המעי בצינור חרוטי של 15 מ"ל עם 6 מ"ל של תמיסת הרטמן ודגר למשך שעה אחת כדי להעריך את הזרימה הפרה-תאית הפסיבית של FITC/RITC-Dextran או 30 דקות כדי לנתח את הזרימה של Alexa Fluor Fixable-Dextran.
   1. שמור על הצינורות החרוטיים המכילים את שקי המעיים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ והגן מפני אור.
10. למדוד את החדירות הפסיבית באמצעות FITC/RITC-Dextran. ב-0 ו-60 דקות, קח דגימה של 100 מיקרוליטר מהצינור החרוטי והעביר לצלחת של 96 בארות. הוסף בחזרה 100 מיקרוליטר של מדיה טרייה כדי להחליף את אמצעי האחסון שאבד.
11. מדידת דגימות ותקנים עבור FITC/RITC בקורא לוחות פלואורסצנטיים (עירור/פליטה של FITC: 495 ננומטר/519 ננומטר; עירור/פליטה של RITC: 570/595 ננומטר).
12. כדי למדוד את החדירות הפסיבית באמצעות Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran, הסר את המעיים, חתוך קרוב לקשר הקשירה הכירורגי וחתוך את המעי כדי לחשוף את הלומן כדי להסיר את התמיסה עם הבדיקה. שוטפים את לומן המעי פעמיים בתמיסת הרטמן קרה.
13. הנח את הרקמה בתבנית רקמה שמולאה בעבר בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T). כוון את הרקמה אנכית או אופקית בהתאם לצד שיש לחתך. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

3. צביעה אימונופלואורסצנטית

1. תקן חלקים קפואים של 20 מיקרומטר עם 3.7% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שטוף 3 פעמים עם מי מלח חוצץ פוספט קר (PBS; 37 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na₂HPO₄ ו-1.8 מ"מ KH₂ PO₄).
   הערה: חלקים אנכיים מהמעיים נוטים לרדת אם השטיפות חזקות מאוד.
2. יש לחלחל עם 0.2% TX-100/PBS למשך 12 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם PBS קר.
3. יש לחסום עם 0.2% BSA/PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.
4. יש לדלל את הנוגדן העיקרי בתמיסת החסימה ולדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר. שוטפים 3 פעמים עם PBS קר.
5. דגירה למשך שעה אחת עם נוגדנים משניים בתמיסת חסימה. שוטפים 3 פעמים עם PBS קר.
6. מרחו מדיום הרכבה על החתכים ואטמו בעזרת כיסוי. ניתן לאחסן את השקופיות עד 3 חודשים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

תוצאות

ברירית המודלקת, שחיקה שטחית או מיקרו-שחיקה פוגעת בשלמות חד-שכבת תא האפיתל ומייצגת אתרים בעלי חדירות גבוהה ^7,8. כדי להעריך אפשרויות כאלה, ניתחנו את החדירות הפסיבית ברירית המעי הגס המודלקת במודל עכברי קוליטיס נתרן גופרתי דקסטרן. בקצרה, במשך 5 ...

Discussion

הומאוסטזיס אפיתל הנובע מאיזון התפשטות התאים ואפופטוזיס אפיתל שומר על מחסום מעיים תקין ותפקודי. הפרעות קליניות רבות, כגון IBD, מלוות או מאופיינות בשינויים בחדירות המעי, דלקת ברירית והפרעה בהומאוסטזיס האפיתל¹. יחסי הגומלין בין התהליכים הללו עדיין שנויים במחלו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Caspase-3 antibody (1:1000)	Cell signaling	9664	Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti rabbit (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)	Invitrogen	A21209
Confocal microscope (Leica TCS SP8x)	Leica		HyD detectors  and White Light Laser
E-Cadherin antibody (1:750)	Sigma	MABT26	Rat monoclonal Delma-1 antibody
Ethanol 70%	Generic
Fixable-Dextran	Invitrogen	D22914	Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, anionic, fixable
FITC Dextran	Sigma	46944	Fluorescein isothiocyanate–dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's Solution	PiSA	HT PiSA
Incubator (AutoFlow NU-8500)	Nuaire
Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Black and White Polystyrene Plate	ThermoFisher Scientific
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phalloidin (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran	Sigma	R8881-100MG	Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
Secondary antibodies (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP-conjugated secondary antibodies
Suture threads	Generic		Braided silk and braided polyester surgical sutures are prefered.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1