Оценка и количественная оценка микроэпителиальных промежутков в слизистой оболочке толстой кишки с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания

Резюме

В этой статье мы описываем новый метод визуализации конкретного места, где трансцеллюлярная и парацеллюлярная проницаемость усиливается в воспаленной слизистой оболочке толстой кишки. В этом анализе мы применяем флуоресцентный краситель с массой 10 кДа, конъюгированный с декстраном, фиксируемым лизином, для визуализации областей с высокой проницаемостью (HPR) в слизистой оболочке толстой кишки.

Аннотация

Эпителиальные клетки, выстилающие слизистую оболочку кишечника, создают физический барьер, отделяющий содержимое люминала от интерстиция. Нарушение эпителиального барьера связано с развитием различных патологий, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). В воспаленной слизистой оболочке поверхностные эрозии или микроэрозии, повреждающие монослои эпителия, соответствуют участкам высокой проницаемости. В образовании микроэрозий участвует несколько механизмов, включая выделение клеток и апоптоз. Эти микроэрозии часто представляют собой микроскопические эпителиальные промежутки, случайно распределенные в толстой кишке. Визуализация и количественная оценка этих эпителиальных промежутков стали важным инструментом для исследования барьерной функции кишечного эпителия. В этой статье мы описываем новый метод визуализации конкретного места, где трансцеллюлярная и парацеллюлярная проницаемость усиливается в воспаленной слизистой оболочке толстой кишки. В этом анализе мы применяем флуоресцентный краситель с массой 10 кДа, конъюгированный с декстраном, фиксируемым лизином, для визуализации областей с высокой проницаемостью (HPR) в слизистой оболочке толстой кишки. Дополнительное использование маркеров клеточной смерти показало, что HPR охватывает апоптотические очаги, где происходит экструзия/отслаивание эпителия. Описанный здесь протокол обеспечивает простой, но эффективный подход к визуализации и количественной оценке микроэрозий в кишечнике, что является очень полезным инструментом в моделях заболеваний, при которых кишечный эпителиальный барьер нарушен.

Введение

Слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) создает физический барьер, который разделяет внеклеточную среду и внутреннюю среду хозяина и участвует в усвоении питательных веществ, воды и электролитов. Кишечный барьер включает в себя слой слизи, состоящий из гликопротеинов, монослой эпителиальных клеток, а также лежащую в основе собственную пластинку, в которой находятся иммунные и стромальные клетки. Эпителиальные клетки кишечника, образующие физический барьер, связаны между собой различными белковыми комплексами, которые включают в себя адгезивное соединение (AJ), плотное соединение (TJ) и десмосомы (DMs). Нарушение функции эпителиального барьера увеличивает проницаемость кишечника и позволяет перемещать вредные вещества и патогены из просвета в интерстиций¹. Растет число заболеваний, при которых эпителиальный барьер нарушен, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), такие как болезнь Крона (БК), язвенный колит (ЯК) и интерминантный колит (ИЦ). Заболеваемость ВЗК растет во всем мире, а на Западе ее распространенность приближается к 0,5%. Хотя причины ВЗК неясны, чрезмерная иммунная/воспалительная реакция, вызванная стенкой кишечника, непосредственно способствует нарушению эпителиального барьера, ограничивая восстановление гомеостаза кишечного эпителия ^2,3,4. Кроме того, пациенты с длительным воспалением толстой кишки подвержены высокому риску развития колоректального рака (КРР)⁵. Другими патологиями, связанными с нарушением кишечного эпителиального барьера, являются синдром раздраженного кишечника, ожирение, целиакия, нецелиакическая чувствительность к глютену и пищевая аллергия⁶. По этим причинам существует острая необходимость в разработке экспериментальных подходов, позволяющих анализировать целостность кишечного эпителиального барьера на животных моделях, имитирующих патогенез, происходящий у человека.

Здесь мы оценили желудочно-кишечную пассивную парацеллюлярную и трансцеллюлярную проницаемость, связанную с воспалительным процессом в эпителии толстой кишки, с помощью простой методики. Для исследования трансмурального потока макромолекул мы измерили пассивную диффузию FITC-декстрана (4 кДа) и RITC-декстрана (10 кДа) в мешочках толстой кишки ex vivo. Кроме того, путем введения флуоресцентного декстрана с массой 10 кДа, фиксируемого лизином, в просвет кишечных мешков, мы специально идентифицировали участки с высокой проницаемостью в воспаленной слизистой оболочке. Использование маркеров апоптоза и антител к белкам AJ позволило продемонстрировать, что участки с высокой проницаемостью в воспаленной слизистой оболочке соответствуют специфическим участкам, где происходит апоптоз эпителиальных клеток и нарушаются межклеточные соединения. Этот новый метод может быть использован для оценки целостности эпителия в любой модели, где нарушен кишечный эпителиальный барьер.

протокол

Все процедуры были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом CINVESTAV по уходу и использованию лабораторных животных (CICUAL).

1. Подготовка материалов и реактивов

1. Предварительно подогрейте раствор Гартмана (130 мМ NaCl, 28 мМ лактата, 4 мМ KCl, 1,5 мМ CaCl₂) до 37 °C при барботировании с 95% O₂/5% CO₂. Поддерживайте физиологический pH (7,4) для раствора.
2. Для анализа пассивной парацеллюлярной проницаемости готовят рабочий раствор, растворяя в предварительно подогретом растворе Гартмана 1 мг/мл ФИТК-декстрана (4 кДа) и 1 мг/мл РИТК-декстрана (10 кДа).
3. Приготовьте 4 мкг/мл раствора Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 кДа) в растворе Гартмана. Храните рабочие растворы в конической пробирке объемом 15 мл и беречь от света до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: потребуется 300 μл рабочего раствора на толстую кишку.
4. Подготовьте хирургический шов, вырезав два среза по 5 см для каждой толстой кишки. Закрутите швы в незамкнутый узел.

2. Вскрытие и подготовка желудочно-кишечного тракта

1. Откажитесь от твердой пищи в течение 6 часов перед усыплением мышей. Обеспечьте питьевую воду в неограниченном количестве.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, давайте мышам питательные гелевые добавки (очищенная вода, патока, тыква, кукурузный сироп, семена подсолнечника, пшеничный белок, растительное масло, пищевая кислота, гидроколлоиды, электролиты, кукурузная клетчатка, минеральная смесь NIH-31M, витаминная смесь NIH-31M).
2. Усыплять мышей в камере_СО2 с последующим вывихом шейки матки в соответствии с протоколами институциональной этики.
3. Простерилизуйте брюшную полость и грудную клетку с помощью 70% этанола.
4. С помощью ножниц сделайте разрез посередине живота и обнажите брюшную полость.
5. В целях ориентации отделите и рассеките толстую кишку, разрезав в конце тонкой кишки (конечная часть подвздошной кишки) прямо перед слепой кишкой, а затем на анальной краю. С помощью хирургических щипцов аккуратно удалите брыжейку и поместите толстую кишку в раствор Гартмана.
6. Важно отметить, что для поддержания согласованности между животными выявляйте похожие участки и используйте их для оценки проницаемости. Настоятельно рекомендуется использовать регионы, близкие к слепой кишке.
7. Используйте инсулиновый шприц, оснащенный тупой пластиковой канюлей, чтобы аккуратно промыть содержимое просвета, присутствующее в толстой кишке. Если стул твердый, осторожно надавите с помощью тупых щипцов. После того, как кал будет удален, промыть 3 раза 400 мкл раствора Гартмана.
8. Перевяжите проксимальную область (ближайшую к слепой кишке) и поместите предварительно перевязанный шов-петлю в дистальную область толстой кишки. С помощью шприца, оснащенного затупленной пластиковой канюлей, заполните кишечный мешок раствором, содержащим зонд желания. Аккуратно снимите пластиковую канюлю и завяжите петлю в дистальной области.
9. Поместите кишечный мешок в коническую пробирку объемом 15 мл с 6 мл раствора Гартмана и инкубируйте в течение 1 часа, чтобы оценить пассивный парацеллюлярный поток FITC/RITC-декстрана, или 30 минут, чтобы проанализировать поток Alexa Fluor Fixable-Dextran.
   1. Поддерживайте коническую трубку, содержащую кишечные мешочки, при температуре 37 °C с 5%_CO2 и защищайте от света.
10. Для измерения пассивной проницаемости с помощью FITC/RITC-Dextran. Через 0 и 60 минут возьмите образец объемом 100 мкл из конической трубки и переложите его в планшет на 96 лунок. Добавьте обратно 100 μL свежей среды, чтобы восполнить потерянный объем.
11. Измерение образцов и стандартов для FITC/RITC на считывателе флуоресцентных пластин (возбуждение/излучение FITC: 495 нм/519 нм; Возбуждение/излучение RITC: 570/595 нм).
12. Чтобы измерить пассивную проницаемость с помощью Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran, удалите кишечник, разрежьте его близко к хирургическому узлу и разрежьте кишечник, чтобы обнажить просвет для удаления раствора с помощью зонда. Промыть просвет кишечника 2 раза холодным раствором Гартмана.
13. Поместите ткань в тканевую форму, предварительно заполненную составом для оптимальной температуры резки (O.C.T.). Расположите ткань вертикально или горизонтально в соответствии с стороной, которую нужно рассекать. Храните образцы при температуре -80 °C.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Зафиксировать замороженные срезы размером 20 мкм с 3,7% параформальдегидом (PFA) на 20 мин при комнатной температуре, а затем 3 раза промыть холодным фосфатным буферным раствором (PBS; 37 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄ и 1,8 мМ KH₂ PO₄).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вертикальные срезы кишечника имеют тенденцию отрываться, если промывки очень сильные.
2. Пропитать 0,2% TX-100/PBS в течение 12 минут при комнатной температуре, а затем 3 раза вымыть холодной PBS.
3. Заблокируйте 0,2% BSA/PBS на 1 час при комнатной температуре.
4. Разведите первичное антитело в блокирующем растворе и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре. Умыться 3 раза холодной PBS.
5. Инкубировать в течение 1 ч с вторичными антителами в блокирующем растворе. Умыться 3 раза холодной PBS.
6. Нанесите монтажное средство на пропилы и запечатайте покровным стеклом. Предметные стекла могут храниться до 3 месяцев при температуре -20 °C.

Результаты

В воспаленной слизистой оболочке поверхностные эрозии или микроэрозии нарушают целостность монослоя эпителиальных клеток и представляют собой участки с высокой проницаемостью ^7,8. Чтобы оценить такие возможности, мы проанализировали...

Обсуждение

Эпителиальный гомеостаз, возникающий в результате балансировки пролиферации клеток и эпителиального апоптоза, поддерживает надлежащий и функциональный кишечный барьер. Многие клинические расстройства, такие как ВЗК, сопровождаются или характеризуются изменениям?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Caspase-3 antibody (1:1000)	Cell signaling	9664	Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti rabbit (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)	Invitrogen	A21209
Confocal microscope (Leica TCS SP8x)	Leica		HyD detectors  and White Light Laser
E-Cadherin antibody (1:750)	Sigma	MABT26	Rat monoclonal Delma-1 antibody
Ethanol 70%	Generic
Fixable-Dextran	Invitrogen	D22914	Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, anionic, fixable
FITC Dextran	Sigma	46944	Fluorescein isothiocyanate–dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's Solution	PiSA	HT PiSA
Incubator (AutoFlow NU-8500)	Nuaire
Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Black and White Polystyrene Plate	ThermoFisher Scientific
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phalloidin (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran	Sigma	R8881-100MG	Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
Secondary antibodies (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP-conjugated secondary antibodies
Suture threads	Generic		Braided silk and braided polyester surgical sutures are prefered.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1