Evaluation and Quantification of Micro Epithelial Gaps in the Colonic Mucosa using Immunofluorescence Staining

요약

여기에서는 염증이 있는 결장 점막에서 transcellular 및 paracellular permeability가 향상되는 특정 위치를 시각화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 분석에서는 결장 점막의 고투과성 영역(HPR)을 시각화하기 위해 라이신 고정성 덱스트란에 접합된 10kDa 형광 염료를 적용합니다.

초록

장 점막을 감싸고 있는 상피 세포는 내강 내용물과 간질을 분리하는 물리적 장벽을 만듭니다. 상피 장벽 손상은 염증성 장 질환(IBD)과 같은 다양한 병리의 발병과 관련이 있습니다. 염증이 있는 점막에서 상피 단층을 손상시키는 표재성 미란 또는 미세 미란은 투과성이 높은 부위에 해당합니다. 세포 흘리기(cell shedding)와 세포사멸(apoptosis)을 포함한 몇 가지 메커니즘이 미세 침식의 형성과 관련이 있습니다. 이러한 미세침식은 종종 결장에 무작위로 분포된 미세한 상피 간극을 나타냅니다. 이러한 상피 간극의 시각화 및 정량화는 장 상피 장벽 기능을 조사하는 데 중요한 도구로 부상했습니다. 여기에서는 염증이 있는 결장 점막에서 transcellular 및 paracellular permeability가 향상되는 특정 위치를 시각화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 분석에서는 결장 점막의 고투과성 영역(HPR)을 시각화하기 위해 라이신 고정성 덱스트란에 접합된 10kDa 형광 염료를 적용합니다. 세포 사멸 마커를 추가로 사용한 결과, HPR은 상피 압출/탈락이 발생하는 세포사멸 병소(apoptotic foci)를 포함하는 것으로 나타났습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 장의 미세 침식을 시각화하고 정량화하는 간단하지만 효과적인 접근 방식을 제공하며, 이는 장 상피 장벽이 손상된 질병 모델에서 매우 유용한 도구입니다.

서문

위장(GI) 점막은 세포 외 환경과 내부 숙주 환경을 분리하는 물리적 장벽을 만들고 영양분, 수분 및 전해질의 흡수에 관여합니다. 장 장벽은 상피 세포의 단층인 당단백질로 구성된 점액층을 둘러싸고 있으며, 그 아래에 있는 얇은 판은 면역 세포와 기질 세포가 있습니다. 물리적 장벽을 형성하는 장 상피 세포는 고착 연접(AJ), 밀착 연접(TJ) 및 데스모솜(DM)을 포함하는 서로 다른 단백질 복합체에 의해 함께 연결되어 있습니다. 상피 장벽 기능의 손상은 장 투과성을 증가시키고 유해 물질 및 병원체를 내강에서 간질로 전좌할 수 있게 합니다¹. 크론병(CD)과 같은 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염(UC) 및 불확정 대장염(IC)과 같이 상피 장벽이 손상되는 질병이 증가하고 있습니다. IBD의 발병률은 전 세계적으로 증가하고 있으며, 서구에서는 0.5%에 가까운 유병률을 보이고 있습니다. IBD의 원인은 불분명하지만, 장 벽에서 유발되는 과도한 면역/염증 반응은 장 상피 항상성의 재확립을 제한함으로써 상피 장벽 파괴에 직접적으로 기여합니다 ^2,3,4. 또한 장기간 결장 염증을 앓고 있는 환자는 대장암(CRC) 발병 위험이 높습니다⁵. 장 상피 장벽 파괴와 관련된 다른 병리학으로는 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 비만(obes), 셀리악병(celiac disease), 비셀리악병(non-celiac gluten sensitivity), 식품 알레르기(food allergies) 등이 있다⁶. 이러한 이유로 인간에서 발생하는 발병 기전을 모방한 동물 모델에서 장 상피 장벽의 무결성을 분석할 수 있는 실험적 접근 방식의 개발이 시급히 필요합니다.

여기에서는 간단한 기술을 사용하여 위장 수동 paracellular와 결장 상피의 염증 과정과 관련된 세포 간 투과성을 평가했습니다. 거대분자의 transmural flow를 조사하기 위해 생체 외 결장 주머니에서 FITC-dextran(4kDa) 및 RITC-dextran(10kDa)의 수동 확산을 측정했습니다. 또한, 형광 10kDa lysine-fixable dextran을 장낭의 내강에 주입하여 염증이 있는 점막에서 투과성이 높은 영역을 구체적으로 식별했습니다. AJ 단백질에 대한 세포사멸 마커 및 항체를 사용하여 염증이 있는 점막의 높은 투과성 영역이 상피 세포가 세포사멸을 겪고 세포-세포 접합이 파괴되는 특정 영역에 해당한다는 것을 입증할 수 있었습니다. 이 새로운 기술은 장 상피 장벽이 손상된 모든 모델에서 상피의 무결성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

모든 절차는 CINVESTAV 실험실 동물 관리 및 사용을 위한 기관 위원회(CICUAL)에서 검토 및 승인했습니다.

1. 재료 및 시약의 준비

1. Hartmann 용액 (130 mM NaCl, 28 mM lactate, 4 mM KCl, 1.5 mM CaCl₂ )을 37 ° C로 예열하면서 95 % O₂ / 5 % CO₂로 버블링합니다. 용액의 생리학적 pH(7.4)를 유지합니다.
2. 수동 세포 주위 투과성을 분석하기 위해 예열 된 Hartmann 용액에 1mg/mL의 FITC-Dextran(4kDa)과 1mg/mL의 RITC-Dextran(10kDa)을 용해하여 작업 용액을 준비합니다.
3. Hartmann 용액에 Alexa Fluor647 Fixable-Dextran(10kDa)의 4μg/mL 용액을 준비합니다. 작업 용액을 15mL 원뿔형 튜브에 보관하고 사용할 때까지 빛으로부터 보호하십시오.
   참고: 결장당 300μL의 작업 용액이 필요합니다.
4. 각 대장에 대해 5cm 절개 2개를 절단하여 외과용 봉합사를 준비합니다. 봉합사를 닫히지 않은 매듭으로 고리를 만듭니다.

2. 위장 기관의 해부 및 준비

1. 쥐를 안락사시키기 전에 6시간 동안 단단한 음식을 먹지 마십시오. 임시로 마실 물을 제공하십시오.
   참고: 가능하면 영양 젤 보충제(정제수, 당밀, 호박, 옥수수 시럽, 해바라기씨, 밀 단백질, 식물성 기름, 식품 산, 하이드로콜로이드, 전해질, 옥수수 섬유, NIH-31M 미네랄 믹스, NIH-31M 비타민 믹스)에 쥐를 놓습니다.
2. CO₂ 챔버에서 마우스를 안락사시킨 후 기관 윤리 프로토콜에 따라 자궁경부 탈구를 수행합니다.
3. 복부와 흉부를 70% 에탄올로 살균합니다.
4. 가위를 사용하여 복부 중앙을 절개하여 복강을 노출시킵니다.
5. 오리엔테이션을 위해 맹장 바로 앞의 소장 끝(회장의 끝 부분)을 절단한 다음 항문 가장자리를 절단하여 대장을 분리하고 해부합니다. 수술용 겸자를 사용하여 장간막을 부드럽게 제거하고 Hartmann 용액에 결장을 배치합니다.
6. 중요한 것은 동물 간의 일관성을 유지하기 위해 유사한 섹션을 식별하고 투과성을 평가하는 데 사용하는 것입니다. 맹장에 가까운 부위를 사용하는 것이 좋습니다.
7. 뭉툭한 플라스틱 캐뉼라가 장착된 인슐린 주사기를 사용하여 결장에 존재하는 내강 내용물을 부드럽게 씻어냅니다. 대변이 단단하면 뭉툭한 집게를 사용하여 조심스럽게 밀어 넣으십시오. 대변을 제거한 후 400μL의 Hartmann 용액으로 3회 세척합니다.
8. 근위부(맹장에 가장 가까운 곳)를 묶고 결장의 원위 부위에 미리 묶인 봉합 고리를 놓습니다. 뭉툭한 플라스틱 캐뉼라가 장착된 주사기를 사용하여 소원 프로브가 들어 있는 용액으로 장 주머니를 채웁니다. 플라스틱 캐뉼러를 조심스럽게 제거하고 원위 부위에 고리를 묶습니다.
9. 6mL의 Hartmann 용액이 든 15mL 원뿔형 튜브에 장낭을 넣고 FITC/RITC-Dextran의 수동 세포주위 흐름을 평가하기 위해 1시간 동안 배양하거나 Alexa Fluor Fixable-Dextran의 흐름을 분석하기 위해 30분 동안 배양합니다.
   1. 장 주머니가 들어있는 원뿔형 튜브를 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 유지하고 빛으로부터 보호하십시오.
10. FITC/RITC-Dextran을 사용하여 수동 투과성을 측정합니다. 0분 및 60분에 원뿔형 튜브에서 100μL 샘플을 채취하여 96웰 플레이트로 옮깁니다. 손실된 부피를 대체하기 위해 100μL의 새 배지를 다시 추가합니다.
11. 형광 플레이트 리더에서 FITC/RITC(FITC 여기/방출: 495 nm/519 nm; RITC 여기/방출: 570/595 nm).
12. Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran을 사용하여 수동 투과성을 측정하려면 장을 제거하고 수술용 넥타이 매듭 가까이를 절단한 다음 장을 절단하여 내강을 노출시켜 프로브로 용액을 제거합니다. 장의 내강을 차가운 Hartmann 용액으로 2회 세척합니다.
13. 이전에 최적 절단 온도 화합물(O.C.T.)로 채워진 조직 틀에 조직을 놓습니다. 절편할 면에 따라 조직을 수직 또는 수평으로 향하게 합니다. 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오.

3. 면역형광성 염색

1. 실온에서 3.7% 파라포름알데히드(PFA)로 20마이크로미터의 동결 부분을 20분 동안 고정한 다음 차가운 인산염 완충 식염수(PBS; 37 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ 및 1.8 mM KH₂ PO₄)로 3회 세척합니다.
   참고: 장의 수직 부분은 세척이 매우 강하면 벗겨지는 경향이 있습니다.
2. 실온에서 0.2% TX-100/PBS로 12분 동안 투과한 후 차가운 PBS로 3회 세척합니다.
3. 실온에서 0.2% BSA/PBS로 1시간 동안 차단합니다.
4. 1차 항체를 차단 용액에 희석하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 차가운 PBS로 3회 세탁합니다.
5. 차단 용액에 2차 항체를 넣어 1시간 동안 배양합니다. 차가운 PBS로 3회 세탁합니다.
6. 절단 부위에 장착 매체를 바르고 커버슬립으로 밀봉합니다. 슬라이드는 -20°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다.

결과

염증이 생긴 점막에서 표재성 미란 또는 미세미란은 상피세포 단층의 무결성을 손상시키고 투과성이 높은 부위를 나타냅니다 ^7,8. 이러한 가능성을 평가하기 위해 dextran sodium sulfate 대장염 쥐 모델에서 염증이 있는 결장 점막의 수동 투과성을 분석했습니다. 간단히 말해서, 5일 동안 C57BL/6J 마우스는 식수에 용해된 2.5% DSS(w/v, 40-5...

토론

세포 증식과 상피 세포사멸의 균형을 통해 발생하는 상피 항상성은 적절하고 기능적인 장 장벽을 유지합니다. IBD와 같은 많은 임상 질환은 장 투과성의 변화, 점막의 염증 및 상피 항상성의 파괴를 동반하거나 특징지어집니다¹. 이러한 프로세스 간의 상호 작용은 여전히 논란의 여지가 많습니다. 따라서 이러한 과정을 적절하게 조사하기 위한 새로운 연...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Caspase-3 antibody (1:1000)	Cell signaling	9664	Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti rabbit (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)	Invitrogen	A21209
Confocal microscope (Leica TCS SP8x)	Leica		HyD detectors  and White Light Laser
E-Cadherin antibody (1:750)	Sigma	MABT26	Rat monoclonal Delma-1 antibody
Ethanol 70%	Generic
Fixable-Dextran	Invitrogen	D22914	Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, anionic, fixable
FITC Dextran	Sigma	46944	Fluorescein isothiocyanate–dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's Solution	PiSA	HT PiSA
Incubator (AutoFlow NU-8500)	Nuaire
Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Black and White Polystyrene Plate	ThermoFisher Scientific
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phalloidin (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran	Sigma	R8881-100MG	Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
Secondary antibodies (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP-conjugated secondary antibodies
Suture threads	Generic		Braided silk and braided polyester surgical sutures are prefered.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1