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Resumen

Este protocolo describe la generación de iPSC libres de integración a partir de fibroblastos de tejido fetal a través de la administración de plásmidos episomales por nucleofection seguido de la descripción de los métodos utilizados para la caracterización de iPSC y la diferenciación neuronal.

Resumen

Las aneuploidias cromosómicas causan malformaciones congénitas graves, incluidas malformaciones del sistema nervioso central y muerte fetal. El cribado genético prenatal es puramente diagnóstico y no aclara el mecanismo de la enfermedad. Aunque las células de fetos aneuploides son material biológico valioso que soporta la aneuploidía cromosómica, estas células son de corta duración, lo que limita su uso para experimentos de investigación posteriores. La generación de modelos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) es un método eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de rasgos aneuploides. Se autorrenovan y se diferencian en células especializadas que recuerdan al desarrollo embrionario. Por lo tanto, las iPSC sirven como excelentes herramientas para estudiar los eventos tempranos del desarrollo. El síndrome de Turner (TS) es una afección rara asociada con la falta total o parcial de un cromosoma X. El síndrome se caracteriza por infertilidad, baja estatura, trastornos endocrinos, metabólicos, autoinmunes y cardiovasculares y defectos neurocognitivos. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de fibroblastos a partir de tejido fetal TS (45XO), generación de TSiPSC libres de integración a través de la entrega de plásmidos de reprogramación episomal por nucleofection seguido de caracterización. Las TSiPSC de reprogramación se examinaron inicialmente mediante tinción de fosfatasa alcalina de células vivas seguida de un sondeo extenso para detectar biomarcadores de pluripotencia. Las colonias seleccionadas fueron diseccionadas mecánicamente, pasadas varias veces y se utilizaron células estables autorrenovadoras para experimentos posteriores. Las células expresaron factores de transcripción de pluripotencia OCT4, NANOG, SOX2, marcadores de superficie celular SSEA 4 y TRA1-81 típicos de las células madre pluripotentes. El cariotipo 45XO original se mantuvo después de la reprogramación. Las TSiPSCs fueron capaces de formar cuerpos embrioides y diferenciarse en células de endodermo, mesodermo y ectodermo expresando biomarcadores específicos del linaje ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Los plásmidos episomales exógenos se perdieron espontáneamente y no se detectaron después del paso 15 en las células. Estas TSiPSC son un valioso recurso celular para modelar el neurodesarrollo molecular y celular defectuoso que causa déficits neurocognitivos asociados con el síndrome de Turner.

Introducción

Las aneuploidies conducen a defectos de nacimiento / malformaciones congénitas y pérdida del embarazo en humanos. ~ 50% -70% de las muestras de pérdidas de embarazo muestran anomalías citogenéticas. Los embriones aneuploides perdidos al principio del embarazo no se pueden obtener fácilmente para el análisis experimental, lo que plantea la necesidad de desarrollar otros modelos que representen estrechamente la embriogénesis humana. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células diagnosticadas con trastornos genéticos se han utilizado para modelar las irregularidades genéticas representativas y su consecuencia en el desarrollo fetal1,2,3,4. Estas iPSC se asemejan a las células epiblásticas del embrión en desarrollo y pueden recapitular los eventos tempranos de formación embrionaria. Permiten comprender y caracterizar el programa de desarrollo de los linajes celulares y el modelado en embriones de mamíferos tempranos. iPSCs derivadas previamente de fibroblastos cutáneas y amniocitos de pruebas diagnósticas prenatales de síndromes de aneuploidía como monosomía X (síndrome de Turner), trisomía 8 (síndrome de Warkany 2), trisomía 13 (síndrome de Patau) y trisomía parcial 11; 22 (síndrome de Emanuel) han proporcionado información valiosa sobre el desarrollo fallido4.

El síndrome de Turner (STT) es una afección rara caracterizada por infertilidad femenina, baja estatura, trastornos endocrinos y metabólicos, un mayor riesgo de enfermedad autoinmune y una predisposición a la enfermedad cardiovascular5. Aunque es el único síndrome de monosomía que puede superar, también es letal para el embrión en desarrollo causando abortos espontáneos6. Los individuos sobrevivientes con SST presentan grados de alteración del material cromosómico X en sus células. Los cariotipos van desde la pérdida completa de un cromosoma X (45,XO) hasta mosaicos como 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la presencia de cromosomas en anillo, la presencia de material cromosómico Y,etc. 5.

El diagnóstico del síndrome generalmente se realiza mediante el cariotipo de sangre de individuos sintomáticos y el muestreo de vellosidades coriónicas (CVS) para detectar síndromes de aneuploidía temprana. Dado que los síndromes de aneuploidía representan ~ 30% de los abortos espontáneos, es rutinario cariotipar el producto de la concepción (POC) en un aborto espontáneo. Estas células fetales, incluidas las vellosidades coriónicas que poseen la anomalía citogenética y las iPSC derivadas de ellas, proporcionan una valiosa fuente de material biológico para estudiar los síndromes de aneuploidía4,6. Las iPSC de TS se han establecido previamente a partir de amniocitos a través de la reprogramación retroviral4,fibroblastos de vellosidades coriónicas (obtenidos a través del diagnóstico prenatal) a través de la reprogramación retroviral6,de células mononucleares sanguíneas7 a través de la reprogramación del virus de Sendai y de fibroblastos de la piel de los individuos de TS a través de la reprogramación lentiviral4 . Dado que el enfoque principal de nuestro laboratorio es comprender el fracaso del desarrollo, hemos generado IPSC TS a partir de POC, específicamente el componente de vellosidades coriónicas de un aborto espontáneo8. Todas las células aisladas de este tejido fetal tenían un cariotipo 45XO y producían iPSCs con el mismo cariotipo. Estas iPSC son únicas, ya que son las primeras que se generan a partir de un feto abortado y proporcionan un recurso valioso para estudiar las fallas del embarazo relacionadas con la aneuploidía. Este artículo proporciona una metodología detallada de la generación de iPSC a partir de esta fuente celular única a través de la reprogramación episomal.

Los primeros métodos de generación de iPSC utilizaron la transducción viral y los transposones para administrar los factores de reprogramación. Los métodos de inducción de células a la pluripotencia han evolucionado desde el uso de vectores retrovirales integradores9,vectores lentivirales excisables10,11 y métodos basados en transposones12 hasta vectores adenovirales no integradores13 y vectores basados en virus de Sendai14. La reprogramación basada en retrovirales y lentivirales, aunque eficiente, implica la integración de los factores de reprogramación en los cromosomas del huésped, causando mutaciones de inserción que tienen efectos imprevistos en las iPSC. Además, la reprogramación basada en virus impide la aplicación traslacional de iPSC. Se han explorado los sistemas basados en ARN15 y la entrega directa de proteínas16 para eliminar por completo los riesgos potenciales asociados con el uso de virus y transfecciones de ADN. Sin embargo, estos métodos han demostrado ser ineficientes.

En 2011, Okita et al. informaron una mejora en la eficiencia de la reprogramación por plásmidos episomales aumentados con la supresión de TP53 a través de shRNA. También reemplazaron cMYC con LMYC no transformador (MYC asociado al carcinoma de pulmón de células pequeñas) para mejorar la seguridad de las hiPSC. Estos plásmidos episomales expresan 5 factores de reprogramación: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC y shRNA para TP5317,18. Estos vectores se mantienen extracromosómicamente y se pierden de las células reprogramadas en el cultivo continuo, lo que hace que las líneas estén libres de transgenes dentro de 10-15 pasajes. La nucleofection es una forma especializada de electroporación que suministra ácidos nucleicos directamente al núcleo de las células huésped. Es un método eficiente para la entrega de los plásmidos de reprogramación en varios tipos de células. Los plásmidos episomales son rentables y compensan los altos costos de la nucleofección. Este método es eficiente y reproducible en condiciones optimizadas, produciendo iPSC estables a partir de una variedad de células somáticas. En este protocolo, describimos el método para la generación de iPSCs a partir de fibroblastos aislados del tejido fetal por nucleofección de plásmidos de reprogramación episomal. Aquí están los protocolos detallados para el aislamiento de fibroblastos de vellosidades coriónicas fetales, purificación de plásmidos, nucleofection, selección de colonias de la placa de reprogramación y establecimiento de iPSC estables.

Es esencial confirmar la presencia de rasgos de pluripotencia en las iPSC recién generadas. Esto incluye la demostración de factores relacionados con la pluripotencia (por ejemplo, expresión de fosfatasa alcalina, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherina; generalmente se muestra con ensayos de inmunofluorescencia o expresión génica), identificación de las tres capas germinales mediante ensayos de diferenciación in vitro para validar sus potenciales de diferenciación, cariotipo para determinar el contenido cromosómico, tipificación STR para establecer identidad con células madre, verificar la pérdida de genes exógenos, y ensayos in vivo más estrictos, como la formación de teratomas y la complementación tetraploide. Aquí describimos protocolos de caracterización de cariotipo, tinción de fosfatasa alcalina de células vivas, detección de biomarcadores relacionados con la pluripotencia por inmunofluorescencia, ensayos de diferenciación in vitro y método para demostrar pérdida de genes exógenos19.

Protocolo

Los FCV se obtuvieron del Hospital Manipal, Bangalore, bajo la aprobación del Comité de Ética de los Hospitales Manipal.

NOTA: Consulte la Tabla 1 para la composición de todos los búferes y soluciones.

1. Aislamiento de fibroblastos de vellosidades coriónicas fetales (FCV)

  1. Recogida de muestras y desintegración tisular en colagenasa
    1. Recolectar FCV en condiciones estériles en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y transportar (a temperatura ambiente) a la instalación de cultivo celular.
    2. Transfiera las vellosidades a una placa de Petri de 60 mm y lave varias veces (mínimo 4 veces) en PBS que contenga 1 solución antimicótica antimicótica (PBS-AA). Elimine el PBS-AA por completo mediante pipeteo.
    3. Tratar las vellosidades coriónicas con 1 ml de mezcla de colagenasa (5 mg/ml) durante 5 min a 37 °C.
    4. Neutralizar con medio de cultivo celular que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS), transferir digestión a un tubo de 15 mL y centrífuga a 225 x g durante 5 minutos para recoger las vellosidades desintegradas y las células liberadas como pellet.
  2. Subcultura y expansión del stock
    1. Placa de vellosidades desintegradas junto con células liberadas en un matraz de cultivo T25 que contiene 5 ml de medios completos (por ejemplo, AmnioMAX) y crecen hasta obtener un cultivo de fibroblastos confluentes.
    2. Expandir los fibroblastos en cultivo para preparar las existencias para su uso en experimentos posteriores de transfección y caracterización de la siguiente manera:
      1. Añadir 2 ml de tripsina al 0,05% al matraz T25 que contenga fibroblastos FCV e incubar a 37 °C durante 3-5 min para disociar las células.
      2. Después de la incubación, neutralice la tripsina agregando FBS (al mismo volumen que la tripsina).
        NOTA: El medio de cultivo que contiene FBS también se puede usar para neutralizar la tripsina, cuando se agrega a una proporción de 1: 3 tripsina: medios.
      3. Recoger las células disociadas en un tubo de 15 ml y centrifugar a 225 x g durante 5 min para obtener el pellet celular.
      4. Decantar el sobrenadante y el pellet de células resuspend en 1 ml de medio completo.
      5. Transfiera 500 μL cada uno a platos tratados con cultivo de tejidos de 60 mm y haga el volumen a 5 ml. Esta relación de división de 1:2, también se utilizó para pasajes posteriores.
  3. Crioconservación
    1. Realizar disociación enzimática utilizando tripsina al 0,05% como se describe en los pasos 1.2.2.1 - 1.2.2.3 y obtener pellet celular.
    2. Deseche el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet celular en 1 ml de mezcla de congelación, que comprende 1:9 dimetilsulfóxido (DMSO): FBS.
    3. Transfiera el contenido a un criovial estéril y coloque el vial en un recipiente de congelación.
    4. Congele durante la noche a -80 °C y luego transfiera los viales a nitrógeno líquido (-196 °C) al día siguiente.

2. Aislamiento y verificación del ADN de los plásmidos

  1. Preparación de células bacterianas
    1. Las existencias de glicerol de rayas de E. coli que contienen los tres plásmidos individuales pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK y pCXLE-hUL (de Addgene) en placas de agar Luria Bertani-ampicilina separadas.
    2. Inocular colonias individuales en cultivos iniciadores de 5 mL de Luria Bertani-ampicilina mediana. Incubar durante 8 horas a 37 °C con agitación (10 x g).
    3. Inocular 200 μL de este cultivo iniciador en 100 mL de Luria Bertani-ampicilina mediana. Incubar durante la noche a 37 °C con agitación.
    4. Cosechar durante la noche el cultivo bacteriano centrifugando a 6000 x g durante 15 min a 4 °C.
  2. Aislamiento de plásmidos con kit de purificación de plásmidos Midi
    1. Pellet bacteriano resuspend en tampón de resuspensión de 4 ml.
    2. Agregue 4 ml de tampón de lisis y mezcle bien invirtiendo vigorosamente 4-6 veces e incube a temperatura ambiente durante 5 min.
    3. Agregue 4 ml de tampón de neutralización preenfriado e invierta el tubo 4-6 veces para mezclar bien. Incubar en hielo durante 15 min.
    4. Centrifugar a ≥20.000 x g durante 30 min a 4 °C. Recoger el sobrenadante en un tubo fresco y volver a centrifugar a ≥20.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    5. Equilibre la columna aplicando 4 ml de tampón de equilibrio.
    6. Aplique el sobrenadante a la columna.
    7. Lave la columna dos veces con 10 ml de tampón de lavado.
    8. ADN eluto con 5 ml de tampón de elución caliente (65 °C).
    9. Precipitar el ADN añadiendo 3,5 mL de isopropanol al ADN eluido. Mezclar bien. Centrifugar a ≥15.000 x g durante 30 min a 4 °C. Decanta sobrenadante con cuidado.
    10. Lave el pellet de ADN con 2 ml de etanol al 70% y centrífuga a ≥15.000 x g durante 10 min. Decanta sobrenadante con cuidado.
    11. Gránulo seco al aire durante 5-10 min y disuelve el ADN en un volumen adecuado de agua de grado PCR para obtener una concentración final de 1 μg/mL.
      NOTA: No disuelva el ADN en tampones, ya que no es adecuado para la electroporación. La preparación de ADN plásmido antiguo no produce colonias reprogramadas.
  3. Verificación de plásmidos por digestión de restricción EcoRI
    1. Combine 15 μL de agua libre de nucleasa, 2 μL de tampón 10x, 1 μg de ADN plásmido y 1 μL de enzima EcoRI. Mezclar suavemente.
    2. Incubar la mezcla a 37 °C durante 15 min en un bloque de calor.
    3. Mezcle las muestras de plásmidos digeridos con 6x colorante de carga de gel de ADN y electroforesa en gel de agarosa al 1% en 1x tampón TAE con 0.5 μg / ml de bromuro de etidio. Incluye escalera de ADN estándar. Imagene el gel después de que el ADN se haya resuelto adecuadamente. Los tamaños de banda EcoRI esperados de pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F son 6,834 bp, 3,758 bp y 1,108 bp; pCXLE-hUL son 10.200 pb y 1.900 pb; pCXLE-hSK son 10.200 pb y 2.500 pb.

3. Nucleofection

  1. Peletización celular
    1. Cultivo de fibroblastos aislados de vellosidades coriónicas fetales en matraz T25 en 5 mL de medios completos hasta un 80-90% de confluencia.
    2. Lave las células dos veces con PBS y tripsinize como se describe en los pasos 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
    3. Retire el gránulo sobrenadante y resuspend en 5 ml de medios séricos reducidos (por ejemplo, Opti-MEM). Cuente las células con hemocitómetro y tome 106 células para la nucleofección. Centrifugadora a 225 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante por completo.
  2. Preparación de reactivos y nucleofection
    1. Preparar el reactivo nucleofector mezclando 0,5 ml de suplemento y 2,25 ml de solución de nucleofector (ambos proporcionados en el kit).
    2. Añadir 100 μL de solución nucleofectorial en un tubo de 1,5 ml. Añadir 1μg cada uno de pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK y pCXLE-hUL al tubo. Resuspenda suavemente 106 celdas (a partir del paso 3.1.2) en esta mezcla.
    3. Transfiera la suspensión de ADN celular a la cubeta, asegurándose de que la muestra cubra la parte inferior de la cubeta (proporcionada en el kit) sin burbujas de aire. Tapa la cubeta e insértelo en el soporte. Seleccione el Programa de nucleofectores U-23 (para alta eficiencia) y aplíquelo.
    4. Retire la cubeta del soporte y agregue 1 ml de soporte completo. Transfiera el contenido suavemente a una placa de Petri tratada con cultivo de tejidos de 60 mm llena de 4 ml de medios completos (a un total de 5 ml de medios). Incubar las células en una incubadora de CO2 humidificada a 37 °C.
    5. Después de 24 h, verifique si las células se han unido. Reemplace el medio por completo.
      NOTA: La tasa de muerte celular es alta en nucleofection dejando pocas células viables que se unen.
    6. Mantenga las celdas en medios completos durante 10 días y cambie a medios de pluripotencia durante los próximos 20 días.
      NOTA: Visualice las células regularmente para seguir los cambios morfológicos que ocurren en las células de reprogramación (como la morfología epitelial y la formación de colonias compactas) para confirmar si el experimento está funcionando. Alrededor de 25 colonias de iPSC se pueden ver después de 20 días de cultivo en medios de pluripotencia.

4. Recolección y propagación de colonias de iPSC

  1. Recoger colonia de la placa de reprogramación
    1. Diseccionar manualmente las colonias embrionarias similares a células madre formadas en la placa de reprogramación utilizando pipetas de vidrio tirado o agujas de jeringa de 1 ml y transferir a una placa previamente preparada con alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados con medio de pluripotencia o establecer cultivos libres de alimentador en placas recubiertas de Matrigel con medio mTESR.
      NOTA: Los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) se derivaron mediante aislamiento enzimático de embriones de ratón (diseccionados de ratones hembras embarazadas de 13-14 días) y se inactivaron mitóticamente mediante el tratamiento con mitomicina C. Establezca poblaciones de clones individuales mediante el crecimiento de colonias individuales a partir de la placa de reprogramación en platos separados o poblaciones de clones mixtos mediante la transferencia de muchas colonias de la placa de reprogramación a un solo plato.
  2. Transferencia mecánica de colonias emergentes a comederos frescos y pasaje para establecer iPSC estables
    1. Propague iPSCs en medio de pluripotencia alimentándose cada dos días y divida 1:3 cada 5-7 días. Prepare las existencias criopreservando en una mezcla congelada de KnockOut Serum Replacement y DMSO en la proporción 9: 1.
      NOTA: KnockOut Serum Replacement se utiliza en la mezcla de congelación para la criopreservación de iPSC en lugar de FBS, ya que los componentes en el FBS podrían inducir la diferenciación de las células pluripotentes durante la preservación a largo plazo.

5. Caracterización de las iPSC

NOTA: Los estudios de caracterización que incluyen PCR e inmunotinción para el biomarcador de pluripotencia se realizaron después del quinto número de paso. El cariotipo se realizó en un número de pasaje posterior.

  1. Cariotipo
    1. Tratar una placa de Petri confluente de 60 mm de iPSCs con colcemid durante 45 min en incubadora de CO2 humidificado a 37 °C.
    2. Cosecha por 0.05% tratamiento de tripsina y centrífuga. Retire el sobrenadante y pipetee los restos de medio para aflojar la bolita de la celda.
    3. Añadir 5 ml de solución hipotónica. Mezclar por tubo invertido e incubar durante 20 minutos a 37 °C. Centrifugadora a 225 x g durante 5 min.
      NOTA: El pellet obtenido debe aparecer esponjoso.
    4. Agregue 2.5 ml de solución fijadora de Carnoy lentamente, mientras golpea para aflojar el pellet.
    5. Prepare los ungues para el cariotipo dejando caer la suspensión celular sobre portaobjetos de vidrio limpios.
    6. Trate los portaobjetos con tripsina al 0,15% durante 1 minuto y lávese una vez con PBS. Luego se mancha con la solución de Giemsa durante 4 minutos y se termina con un lavado con agua destilada. Adquirir y procesar con el software adecuado.
  2. Demostración del estado libre de transgenes
    1. Aislamiento de ADN genómico
      1. Pipetear 20 μL de proteasa en la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      2. Agregue 200 μL de TSiPSC resuspendidos en PBS al tubo de la microcentrífuga.
      3. Añadir 200 μL de Buffer AL a la muestra y mezclar durante 15 s mediante vórtice de pulso.
      4. Incubar durante 10 min a 56 °C.
      5. Centrifuga brevemente el tubo de la microcentrífuga para eliminar las gotas del interior de la tapa.
      6. Agregue 200 μL de etanol (96-100%) a la muestra y mezcle nuevamente durante 15 s mediante vórtice de pulso. Después de mezclar, centrífuga brevemente el tubo para eliminar las gotas del interior de la tapa.
      7. Aplique cuidadosamente la mezcla del paso anterior a la mini columna de centrifugado (en un tubo de recolección de 2 ml) sin humedecer el borde. Cierre la tapa y centrífuga a 6000 x g durante 1 min. Deseche el tubo que contiene el filtrado y coloque la mini columna de centrifugado en un tubo de recolección limpio de 2 ml.
      8. Abra con cuidado la mini columna de centrifugado y sin humedecer el borde, agregue 500 μL de Buffer AW1. Cierre la tapa y la centrífuga a 6000 x g durante 1 min. Coloque la mini columna de centrifugado en un tubo de recolección limpio de 2 ml y deseche el tubo de recolección que contiene el filtrado.
      9. Abra con cuidado la mini columna de centrifugado y agregue 500 μL de Buffer AW2 sin humedecer el borde. Cierre la tapa y la centrífuga a toda velocidad (20.000 x g) durante 3 min.
      10. Coloque la mini columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de 2 ml y deseche el tubo de recolección antiguo con el filtrado. Centrífuga a toda velocidad durante 1 min para eliminar la posibilidad de un posible arrastre de Buffer AW2.
      11. Coloque la mini columna de centrifugado en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml y deseche el tubo de recolección que contiene el filtrado. Abra con cuidado la mini columna de centrifugado y agregue 200 μL Buffer AE o agua destilada. Incubar a temperatura ambiente (15-25 °C) durante 5 min, y luego centrifugar a 6000 x g durante 1 min.
    2. PCR de estado libre de transgenes (usando KAPA HiFi PCR Kit KR0368)
      1. Asegúrese de que todos los reactivos se descongelen y mezclen adecuadamente.
      2. Preparar una mezcla maestra de PCR que contenga el volumen apropiado de todos los componentes de reacción basados en la Tabla 2 (configurar reacciones en hielo).
      3. Transfiera los volúmenes apropiados de mezcla maestra de PCR, plantilla e imprimación a tubos de PCR individuales.
      4. Tapar las reacciones individuales, mezclar y centrifugar brevemente.
      5. Realizar PCR siguiendo la Tabla 3.
  3. Identificación de biomarcadores de pluripotencia
    1. Tinción de fosfatasa alcalina (AP)
      1. Prepare una solución de tinción viva 1x AP diluyendo 3 μL de solución de stock 500x en 1.5 mL DMEM/F-12 por cada 10 cm2 de área de cultivo.
      2. Retire el medio de la placa de cultivo iPSC. Lave el cultivo con DMEM/F-12 una vez. Agregue la solución de tinción viva 1x AP a las iPSC. Incubar a 37 °C durante 45 min.
      3. Retire la mancha AP y lávese dos veces con DMEM/F-12. Agregue DMEM / F-12 fresco e imagen bajo microscopio fluorescente utilizando un filtro FITC estándar dentro de los 30-90 minutos posteriores a la tinción.
    2. Inmunotinción para biomarcadores de pluripotencia
      1. Fije cultivos iPSC confluentes con paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 °C. Lavar tres veces con PBS Tween 20 (PBST), cada lavado durante 5 min.
      2. Permeabilizar las células con Tritón X-100 al 0,3% en PBST durante 15 minutos a temperatura ambiente. Lavar tres veces con PBST.
        NOTA: La permeabilización debe hacerse solo para antígenos intracelulares.
      3. Bloquee las células con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBST durante 30 min a temperatura ambiente. Tinción de las células con anticuerpos primarios (diluidos 1:1000 en BSA al 1%) durante la noche. Después de la incubación primaria de anticuerpos, lavar tres veces con PBST.
      4. Incubar las células con el anticuerpo secundario (diluido 1:1000 en BSA al 1%) durante 5 h a temperatura ambiente. Lavar tres veces con PBST.
      5. Etiquetar los núcleos con 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 1 minuto. Lave las células una vez con PBST.
      6. Captura de imágenes bajo microscopio fluorescente.

6. Ensayos de diferenciaciónin vitro

  1. Diferenciación del cuerpo embrónido (EB)
    1. Cortar las colonias de iPSC en trozos pequeños, recoger y enchap en placas de Petri de baja fijación en medio de cuerpo embrionario. Cultive las células durante 15 días reemplazando el medio cada 3 días.
      NOTA: Los EBs del día 15 se pueden usar directamente para la detección de los tres biomarcadores de la capa germinal. Alternativamente, se pueden inducir linajes celulares específicos con factores de crecimiento, seguidos de la detección de biomarcadores.
  2. Diferenciación del endodermo (hepatocito)
    1. Cultivar las iPSCs en cultivos monocapa en medio de pluripotencia.
    2. Una vez confluente, cambie a medios RPMI 1640 con 1x insulina transferrina selenita y 100 ng / ml de activina A durante 2 días, seguido de crecimiento en medios RPMI 1640 con 30 ng / ml bFGF y 20 ng / mL BMP4 durante 9 días. Reemplace el medio cada 2 días.
    3. A partir del día 10, suplementar los medios con 0,1 μM de dexametasona. Termine el experimento el día 20.
  3. Diferenciación del mesodermo (cardiomiocitos)
    1. Placa día 8 EBs en placas recubiertas de Matrigel al 0,5% en medio corporal embrionario. Permita que los EBs se conecten y contraigan.
    2. Suplementar medios con 20 ng/mL BMP4 y crecer durante 20 días. Reemplace el medio cada 2-3 días. Termine el experimento el día 20.
  4. Diferenciación ectodermo (neuronal)
    1. Placa día 4 EBs sobre 2 μg/cm2 placas recubiertas de colágeno tipo IV en medio corporal embrionario. Permita que los EBs se conecten y contraigan.
    2. Al día siguiente, cambie el medio a DMEM F-12 con 2 mg / ml de glucosa, 1x insulina transferrina selenita y 2.5 μg / ml de fibronectina. Termine el experimento el día 15.
  5. Formación de organoides cerebrales
    1. Cultive TSiPSCs en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm en MEFs hasta un 70-80% de confluente. Cortar las colonias y recoger en un tubo de 15 ml. Centrifugar las células a 225 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
    2. Lavar los trozos de colonias resuspensándolos en 2 mL de PBS y centrifugar para retirar el sobrenadante.
    3. Agregue 1 ml de tripsina al 0.05% y golpee el tubo para desalojar las células. Incubar el tubo a 37 °C durante 3-4 min para disociar las piezas de la colonia en una suspensión de una sola célula.
    4. Neutralizar la tripsina por dilución con 4 ml de medios de pluripotencia que contengan 10 μg/ml inhibidor de la proteína quinasa asociada a rho (ROCK) diclorhidrato Y-27632 (ROCKi) para prevenir la muerte celular inducida por disociación.
    5. Centrifugación para obtener un pellet. Deseche el sobrenadante y resuspónda las células en un medio corporal embrionario de 2 ml que contenga 10 μg/ml de ROCKi.
    6. Retire 10 μL de suspensión celular para el recuento celular. Añadir 10 μL de azul de tripano para detectar células muertas. Cuente las células usando un hemocitómetro.
    7. Añadir el volumen adecuado de medio corporal embrionario con ROCKi a la suspensión celular para obtener 9.000 células vivas por 150 μL.
    8. Placa de 150 μL en cada pozo de una placa de 96 pozos de baja fijación e incubar en una incubadora de CO2 humidificada a 37 °C. Revise las placas para la agregación después de 24 horas. El día 2 retire suavemente el medio y reemplácelo con un medio embrionario fresco sin ROCKi.
    9. El día 6, transfiera EBs a los pozos de una placa de 24 pozos de baja fijación que contenga 500 μL de medio de inducción neural compuesto por DMEM-F12 con suplemento de N2 al 1%, suplemento de GlutaMAX de 2 mM y 1 mM de aminoácidos no esenciales y 1 μg/ml de heparina. Cambie el medio cada 2 días.
    10. Después de 5 días en medio de inducción neural, incruste los agregados neuroepiteliales en Matrigel colocando en capas un cuadrado de parapelícula de 2 cm x 2 cm sobre una bandeja de punta vacía de puntas de 200 μL. Presione parafilm con los dedos enguantados sobre cada orificio en la bandeja de la punta para hacer pequeñas abolladuras. Parafilm limpio con 70% de etanol para esterilizar.
    11. Transfiera el cuadrado de la película en un plato de 60 mm. Use puntas cortadas de 200 μL para transferir los agregados neuroepiteliales a las abolladuras en la parapelícula. Eliminar el exceso de medio mediante pipeteo.
    12. Agregue 30 μL de Matrigel descongelado en los agregados neuroepitleiales y coloque el agregado en el centro del Matrigel usando una punta de pipeta. Coloque el plato de 60 mm durante 20-30 min en una incubadora de 37 °C para que el Matrigel polimerice.
    13. Añadir 5 mL de medio de diferenciación organoidea cerebral compuesto por 1:1 DMEM-F12: Medio neurobasal, suplemento 0,5% N2, 2,5 μg/mL de insulina, suplemento glutaMAX 2 mM, NEAA 0,5 mM, suplemento de B27 al 1% y 2,5 ml de penicilina-estreptomicina.
    14. Usando un forrórceps estéril, gire la lámina de parafilm y agite el plato hasta que los agregados incrustados de Matrigel caigan de la hoja en el medio. Cultive los agregados incrustados en una incubadora de CO2 humidificada a 37 °C durante 4 días dando cambios de medios en días alternos.
    15. Después de 4 días de cultivo estático, coloque los platos de 60 mm en un agitador orbital instalado dentro de la incubadora que agita a 50 rpm. Culta los organoides durante 3 meses dando cambios completos en los medios con el medio de diferenciación organoide cerebral cada 3 días.

Resultados

Generación de iPSCs sin integración a partir de un feto abortado espontáneamente con cariotipo 45XO
Se aislaron fibroblastos de FCV con un cariotipo 45XO específico del síndrome de Turner (ST) y se nucleofectaron con plásmidos de reprogramación episomal para generar TSiPSCs que pueden ser utilizados para el modelado posterior del síndrome, específicamente los déficits neurológicos asociados (Figura 1a&b). Se utilizaron vectores episomales no in...

Discusión

La generación de modelos celulares estables de tejido fetal citogenéticamente anormal es necesaria para perpetuar el fenotipo defectuoso. La ruta iPSC es el método más eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de propiedades defectuosas20.

Las células madre pluripotentes (PSC) muestran propiedades de autorrenovación y diferenciación en células especializadas que recuerdan a los embriones de escisión temprana21. Por lo...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El apoyo financiero para la investigación anterior fue proporcionado por la Academia de Educación Superior manipal. La caracterización de la línea se realizó parcialmente en el laboratorio de M.M. Panicker en NCBS. Agradecemos a Anand Diagnostic Laboratory por su ayuda con el cariotipo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15% trypsinThermo Fisher Scientific27250018G Banding
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindoleSigma AldrichD8417Immunocytochemistry
Activin ASigma AldrichSRP3003Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live StainThermo Fisher ScientificA14353AP staining
AMAXA Nucleofector IILonza-Nucleofection
AmnioMAX II complete mediaThermo Fisher Scientific, Gibco11269016Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
AmpicillinHiMediaTC021Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11059Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11034Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546InvitrogenA11035Immunocytochemistry
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific, Gibco15240096Contamination control
Anti-E-CadherinBD Biosciences610181Immunocytochemistry
Anti-NanogBD Biosciences560109Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4BD Biosciences611202Immunocytochemistry
Anti-SOX17BD Biosciences561590Immunocytochemistry
Anti-SOX2BD Biosciences561469Immunocytochemistry
Anti-SSEA4BD Biosciences560073Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81MilliporeMAB4381Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]Sigma AldrichF0291Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4Sigma AldrichSRP3016Differentiation assays
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3059Blocking
Collagen Human Type IVBD Biosciences354245Differentiation assays
Collagenase blendSigma AldrichC8051Digestion of foetal chorionic villi
DexamethasoneSigma AldrichD4902Differentiation assays
DMEM F12Thermo Fisher Scientific11320033Differentiation assays
FastDigest EcoR1Thermo ScientificFD0274Restriction digestion
FibronectinSigma AldrichF2518Differentiation assays
Giemsa StainHiMediaS011G Banding
Glacial Acetic AcidHiMediaAS001Fixative for karyotyping
GlucoseSigma AldrichG7528Differentiation assays
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodiumSigma AldrichH3149Differentiation assays
Insulin solution humanSigma AldrichI9278Differentiation assays
Insulin Transferrin SeleniteSigma AldrichI1884Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kitKapa BiosystemsKR0368OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX ColcemidThermo Fisher Scientific15210040Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEMThermo Fisher Scientific10829018Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agarHiMediaM1151FPlasmid purification
MatrigelBD Biosciences356234Differentiation assays
MEM Non-essential amino acidsThermo Fisher Scientific11140035Pluripotency and Embryoid body medium
MethanolHiMediaMB113Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/βMilliporeMAB1552Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector KitLonzaVAPD-1001Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)Sigma AldrichP6148Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-FAddgene27077Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSKAddgene27078Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hULAddgene27080Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin  Thermo Fisher Scientific, 15070063Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanateSigma AldrichP1951Immunocytochemistry
Phosphate buffered salineSigma AldrichP44171 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prepQIAGEN12143Plasmid purification
Potassium Chloride SolutionHiMediaMB043Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood KitQiagen51104Genomic DNA isolation
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093Hepatocyte differentiation medium
Sodium CitrateHiMediaRM255Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100HiMediaMB031Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, Gibco25300054Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20HiMediaMB067Preparation of PBST
β III tubulinSigma AldrichT8578Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochlorideSigma AldrichY0503Differentiation assays

Referencias

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