JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, epizomal plazmidlerin nükleofeksiyon ile verilmesi yoluyla fetal doku fibroblastlarından entegrasyonsuz iPSC'lerin üretilmesini ve ardından iPSC karakterizasyonu ve nöronal farklılaşma için kullanılan yöntemlerin tanımlanmasını açıklar.

Özet

Kromozomal aneuploidiler merkezi sinir sistemi malformasyonları ve fetal ölüm de dahil olmak üzere şiddetli konjenital malformasyonlara neden olur. Prenatal genetik tarama tamamen tanısaldır ve hastalık mekanizmasını aydınlatmaz. Aneuploid fetüslerden gelen hücreler kromozomal aneuploidi taşıyan değerli biyolojik malzeme olmasına rağmen, bu hücreler kısa ömürlüdür ve aşağı akış araştırma deneyleri için kullanımlarını sınırlar. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) modellerinin üretilmesi, aneuploid özelliklerinin sürekli korunması için hücre hazırlamanın etkili bir yöntemidir. Embriyonik gelişimi anımsatan özel hücrelere kendi kendini yeniler ve ayırt ederler. Bu nedenle, iPSC'ler erken gelişim olaylarını incelemek için mükemmel araçlar olarak hizmet vermektedir. Turner sendromu (TS), tamamen veya kısmen eksik bir X kromozomu ile ilişkili nadir bir durumdur. Sendrom infertilite, kısa boy, endokrin, metabolik, otoimmün ve kardiyovasküler bozukluklar ve nöroknasitif kusurlar ile karakterizedir. Aşağıdaki protokol, fibroblastların TS (45XO) fetal dokudan izolasyonu ve kültleştirilmesini, epizomal yeniden programlanan plazmidlerin nükleofeksiyon ve ardından niteleme yoluyla entegrasyonsuz TSiPSC'lerin üretilmesini açıklamaktadır. Yeniden programlanan TSiPSC'ler başlangıçta canlı hücre alkali fosfataz boyama ve ardından pluripotency biyobelirteçler için kapsamlı problama ile tarandı. Seçilen koloniler mekanik olarak parçalandı, birkaç kez geçirildi ve daha fazla deney için kararlı kendini yenileyen hücreler kullanıldı. Hücreler pluripotency transkripsiyon faktörlerini ifade etti OCT4, NANOG, SOX2, hücre yüzey belirteçleri SSEA 4 ve TRA1-81 pluripotent kök hücrelere özgüdür. Orijinal 45XO karyotip, yeniden programlama sonrası tutuldu. TSiPSC'ler embriyoid cisimleri oluşturabildi ve endoderm, mezoderm ve ektoderm hücrelerine dönüşerek soyuna özgü biyobelirteçlere ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRIKÜLER AĞIR CHAINα/β), (βIII TUBULIN)) hücrelerine farklılaştı. Eksojen epizomal plazmidler kendiliğinden kaybedildi ve hücrelerde 15. Bu TSiPSC'ler Turner sendromu ile ilişkili nörokingtif açıklara neden olan kusurlu moleküler ve hücresel nörogelişim modellemek için değerli bir hücresel kaynaktır.

Giriş

Aneuploidiler insanlarda doğum kusurlarına/konjenital malformasyonlara ve gebelik kaybına yol açar. Gebelik kayıplarından elde edilen örneklerin ~%50-%70'inde sitogenetik anormallikler görülür. Gebelikte erken kaybedilen aneuploid embriyolar, insan embriyogenezini yakından temsil eden başka modeller geliştirme ihtiyacını artıran deneysel analizler için kolayca elde edilemez. Genetik bozukluk tanısı alan hücrelerden elde edilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), temsili genetik düzensizliklerive fetal gelişim 1 , 2,3,4üzerindeki sonuçları modellemek için kullanılmıştır. Bu iPSC'ler gelişmekte olan embriyonun epiblast hücrelerine benzer ve embriyo oluşumunun erken olaylarını nüksedebilir. Erken memeli embriyolarında hücre soylarının ve desenlerinin gelişim programının anlaşılmasına ve karakterizasyonuna izin verirler. Daha önce monozomi X (Turner sendromu), trizomi 8 (Warkany sendromu 2), trizomi 13 (Patau sendromu) ve kısmi trizomi 11 gibi aneuploidi sendromlarının prenatal tanı testlerinden cilt fibroblastları ve amniyositlerden elde edilen iPSC'ler; 22 (Emanuel sendromu) başarısız gelişim hakkında değerli içgörüler sağlamıştır4.

Turner sendromu (TS), kadın kısırlığı, kısa boy, endokrin ve metabolik bozukluklar, otoimmün hastalık riskinin artması ve kardiyovasküler hastalığa yatkınlık ile karakterize nadir bir durumdur5. Hayatta kalabilen tek monosomi sendromu olmasına rağmen, spontan kürtajlara neden olan gelişmekte olan embriyo için de ölümcüldür6. TS ile hayatta kalan bireyler hücrelerinde X kromozomal malzemenin değişim dereceleri ile mevcuttur. Karyotipler bir X kromozomunun (45,XO) tamamen kaybolmasından 45,XO/46,XX gibi mozaiklere kadar uzanır; 45,XO/47,XXX, halka kromozomlarının varlığı, Y kromozomal malzemenin varlığı, vb5.

Sendromun tanısı genellikle semptomatik bireylerin kanının karyotipingi ve erken aneuploidi sendromlarını tespit etmek için koryonik villi örnekleme (CVS) ile yapılır. Anöploidi sendromları spontan kürtajların ~%30'unu oluşturduğundan, spontan kürtaj üzerine gebe kalma (POC) ürününü karyotip etmek rutindir. Sitogenetik anormalliğe sahip koryonik villi ve onlardan türetilen iPSC'ler de dahil olmak üzere bu fetal hücreler, aneuploidi sendromlarını incelemek için değerli bir biyolojik malzeme kaynağı sağlar4,6. TS iPSC'ler daha önce retroviral reprogramlama yoluyla amniyositlerden4, koryonik villi fibroblastları (prenatal tanı ile elde edilir) retroviral yoluyla kurulmuştur. reprogramming6, sendai virüs reprogramming yoluyla kan mononükleer hücrelerden7 ve lentiviral yeniden programlama yoluyla TS bireylerin cilt fibroblastları4 . Laboratuvarımızın birincil odağı gelişimsel başarısızlığı anlamak olduğundan, POC'den TS iPSC'leri, özellikle de spontan bir kürtajın koryonik villi bileşenini oluşturduk8. Bu fetal dokudan izole edilen tüm hücrelerin 45XO karyotipi vardı ve aynı karyotipe sahip iPSC'ler verdi. Bu iPSC'ler, kürtaj yapılan bir fetüsten ilk oluşturulanlar olduğu ve aneuploidi ile ilgili gebelik başarısızlıklarını incelemek için değerli bir kaynak sağladıkları için benzersizdir. Bu makalede, epizomal yeniden programlama yoluyla bu benzersiz hücre kaynağından iPSC'lerin neslinin ayrıntılı bir metodolojisi sağlanmıştır.

iPSC neslinin ilk yöntemleri, yeniden programlama faktörlerini sunmak için viral transdüksiyon ve transposonlar kullandı. Hücreleri pluripotency'ye indükleme yöntemleri retroviral vektörler9, uyarılabilir lentiviral vektörler10 , 11ve transposon bazlı yöntemler12'yi entegre etmeyen adenoviral vektörler13 ve Sendai virüs bazlı vektörler14kullanılarak evrimleşmiştir. Retroviral ve lentiviral bazlı yeniden programlama, verimli olmasına rağmen, yeniden programlama faktörlerinin konak kromozomlarına entegrasyonunu içerir ve iPSC'lerde öngörülemeyen etkileri olan ekleme mutasyonlarına neden olur. Ayrıca, viral tabanlı yeniden programlama, iPSC'lerin çevirisel uygulamasını engeller. Virüslerin ve DNA transfeksiyonlarının kullanımıyla ilgili potansiyel riskleri tamamen ortadan kaldırmak için RNA tabanlı sistemler15 ve doğrudan protein iletimi16 araştırılmıştır. Ancak, bu yöntemlerin verimsiz olduğu kanıtlanmıştır.

2011 yılında Okita ve arkadaşları, shRNA ile TP53 bastırma ile artırılmış epizomal plazmidler tarafından yeniden programlama verimliliğinin arttığını bildirdi. Ayrıca hiPSC'lerin güvenliğini artırmak için cMYC'yi dönüştürmeyen LMYC (küçük hücreli akciğer karsinomu ilişkili MYC) ile değiştirdiler. Bu epizomal plazmidler 5 yeniden programlama faktörünü ifade eder: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC ve TP53için shRNA17,18. Bu vektörler ekstra kromozomal olarak korunur ve sürekli kültür üzerine yeniden programlanan hücrelerden kaybolur, böylece çizgileri 10-15 pasaj içinde transgene-free hale getirir. Nükleofeksiyon, nükleik asitleri doğrudan konak hücrelerin çekirdeğine ulaştıran özel bir elektroporasyon şeklidir. Plazmidlerin çeşitli hücre tiplerine yeniden programlanması için etkili bir yöntemdir. Epizomal plazmidler uygun maliyetlidir ve nükleofeksiyonun yüksek maliyetlerini telafi eder. Bu yöntem, çeşitli somatik hücrelerden kararlı iPSC'ler sağlayan optimize edilmiş koşullar altında verimli ve tekrarlanabilir. Bu protokolde epizomal reprogramlama plazmidlerinin nükleofeksiyonu ile fetal dokudan izole edilen fibroblastlardan iPSC'lerin üretilmesi için yöntemi açıklıyoruz. İşte fetal koryonik villiden fibroblast izolasyonu, plazmid saflaştırma, nükleofeksiyon, kolonilerin yeniden programlama plakasından toplanması ve stabil iPSC'lerin kurulması için ayrıntılı protokoller.

Yeni oluşturulan iPSC'lerde pluripotency özelliklerinin varlığını onaylamak önemlidir. Bu, pluripotency ile ilgili faktörlerin gösterimini içerir (örneğin, alkalin fosfataz ekspresyonu, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; genellikle immünofluoresans veya gen ekspresyon tahlilleri ile gösterilir), üç mikrop tabakasının farklılaşma potansiyellerini doğrulamak için in vitro farklılaşma testleriyle tanımlanması, kromozomal içeriği belirlemek için karyotipleme, ebeveyn hücreleriyle kimlik oluşturmak için STR yazma, eksojen genlerin kaybını doğrulama, ve teratom oluşumu ve tetraploid kompleasyonu gibi daha sıkı in vivo tahliller. Burada karyotipingin karakterizasyon protokollerini, canlı hücreler alkali fosfataz boyamayı, pluripotency ile ilgili biyobelirteçlerin immünofluoresans ile tespitini, in vitro farklılaşma tahlillerini ve eksojen gen kaybını gösterme yöntemini açıklıyoruz19.

Protokol

FCV, Bengaluru'daki Manipal Hastanesi'nden Manipal Hastaneleri Etik Kurulu onayı altında alındı.

NOT: Tüm arabelleklerin ve çözümlerin bileşimi için Tablo 1'e bakın.

1. Fibroblastların fetal koryonik villiden (FCV) izolasyonu

  1. Kollajenazda örnek toplama ve doku parçalanması
    1. FCV'yi fosfat tamponlu salin (PBS) içinde steril koşullarda toplayın ve hücre kültürü tesisine (oda sıcaklığında) taşıyın.
    2. Villiyi 60 mm Petri kabına aktarın ve 1x Antibiyotik Antimycotic çözeltisi (PBS-AA) içeren PBS'de birkaç kez (en az 4 kez) yıkayın. PBS-AA'yı pipetleme ile tamamen çıkarın.
    3. Koryonik villiyi 1 mL kollajenaz karışımı (5 mg/mL) ile 37 °C'de 5 dakika boyunca tedavi edin.
    4. %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren hücre kültürü ortamı ile nötralize edin, parçalanmış villi ve serbest bırakılan hücreleri pelet olarak toplamak için 5 dakika boyunca 15 mL'lik bir tüpe ve 225 x g'da santrifüje sindirin aktarın.
  2. Alt kültür ve stok genişlemesi
    1. Plaka, 5 mL tam ortam (örneğin, AmnioMAX) içeren bir T25 kültür şişesinde salınan hücrelerle birlikte villi parçalandı ve birleştiği fibroblast kültürü elde edilene kadar büyüdü.
    2. Sonraki transfeksiyon ve karakterizasyon deneylerinde kullanılmak üzere stokları hazırlamak için kültürdeki fibroblastları aşağıdaki gibi genişletin:
      1. FCV fibroblastları içeren T25 şişesine 2 mL% 0.05 trypsin ekleyin ve hücreleri ayrıştırmak için 37 °C'de 3-5 dakika kuluçkaya yatırın.
      2. İnkübasyondan sonra, FBS ekleyerek trypsin'i nötralize edin (tripsin ile aynı hacimde).
        NOT: FBS içeren kültür ortamı, 1:3 trypsin:media oranında eklendiğinde tripsin nötralize etmek için de kullanılabilir.
      3. Parçalanmış hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve hücre peletini elde etmek için 5 dakika boyunca 225 x g'da santrifüj.
      4. 1 mL tam ortamda hücre peletini dekant süpernatant ve resuspend.
      5. Her biri 500 μL'yi 60 mm doku kültürüyle işlenmiş yemeklere aktarın ve hacmi 5 mL'ye kadar yapın. 1:2'lik bu bölme oranı, sonraki pasajlar için de kullanıldı.
  3. Kriyoprezervasyon
    1. 1.2.2.1 - 1.2.2.3 adımlarında açıklandığı gibi %0.05 tripsin kullanarak enzymatic ayrışma gerçekleştirin ve hücre pelet elde edin.
    2. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1:9 dimetil sülfit (DMSO) içeren 1 mL donma karışımında yeniden atın: FBS.
    3. İçeriği steril bir cryovial'a aktarın ve şişeyi dondurucu bir kaba yerleştirin.
    4. -80 °C'de gece boyunca dondurun ve ertesi gün şişeleri sıvı nitrojene (-196 °C) aktarın.

2. Plasmids DNA İzolasyonu ve doğrulaması

  1. Bakteriyel Hücre Hazırlama
    1. Ayrı Luria Bertani-ampisilin agar plakalarında üç ayrı plazmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK ve pCXLE-hUL (Addgene'den) içeren E. coli'nin çizgi gliserol stokları.
    2. Tek kolonileri 5 mL Luria Bertani-ampisilin ortamının başlangıç kültürlerine aşılar. Sallama (10 x g) ile 37 °C'de 8 saat kuluçkaya yatır.
    3. Bu başlangıç kültürünün 200 μL'lik kısmını 100 mL Luria Bertani-ampisilin ortamına aşıla. 37 °C'de bir gecede sallanarak kuluçkaya yaslanın.
    4. 4 °C'de 15 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüjleme yaparak gece bakteri kültürünü hasat edin.
  2. Midi Plasmid arıtma kiti ile plazmid izolasyonu
    1. Bakteri peletlerini 4 mL resüspensiyon tamponunda yeniden dirildi.
    2. 4 mL lizis tamponu ekleyin ve 4-6 kez kuvvetlice ters çevirerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. 4 mL önceden soğutulmuş nötralizasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırmak için tüpü 4-6 kez ters çevirin. 15 dakika boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
    4. 4 °C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g ≥ santrifüj. Süpernatantı taze bir tüpte toplayın ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 20.000 x g ≥ yeniden santrifüjüne bakın.
    5. 4 mL denge arabelleği uygulayarak sütunu dengele.
    6. Üstnatant sütuna uygulayın.
    7. Kolonu 10 mL yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
    8. 5 mL sıcak (65 °C) elüasyon tamponu ile DNA'sı elute edin.
    9. Elde edilen DNA'ya 3,5 mL izopropanol ekleyerek DNA'yı çökelt. İyice karıştırın. 4 °C'de 30 dakika boyunca 15.000 x g ≥ santrifüj. Dekont süpernatant dikkatlice.
    10. DNA peletini 2 mL%70 etanol ve santrifüjle 15.000 x g ≥ 10 dakika boyunca yıkayın. Dekont süpernatant dikkatlice.
    11. 5-10 dakika boyunca hava kuruluğunda pelet ve 1 μg/mL'lik son konsantrasyon elde etmek için DNA'yı uygun bir PCR sınıfı su hacminde çözün.
      NOT: Elektroporasyon için uygun olmadığı için DNA'yı tamponlarda eritmeyin. Eski plazmid DNA preparatı yeniden programlanmış koloniler yapmaz.
  3. EcoRI kısıtlama sindirimi ile Plasmid Doğrulaması
    1. 15 μL nükleaz içermeyen su, 2 μL 10x tampon, 1 μg plazmid DNA ve 1 μL EcoRI enzimini birleştirin. Yavaşça karıştırın.
    2. Karışımı 37 °C'de bir ısı bloğunda 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Sindirilen plazmid örneklerini 6x DNA jeli yükleme boyası ve elektrofori ile 1x TAE tamponunda% 1 agarose jel üzerinde 0,5 μg/ mL ethidium bromür ile karıştırın. Standart DNA merdiveni ekleyin. DNA uygun şekilde çözüldükten sonra jeli görüntüleyin. pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F'nin beklenen EcoRI bant boyutları 6.834 bp, 3.758 bp ve 1.108 bp'dir; pCXLE-hUL 10.200 bp ve 1.900 bp'dir; pCXLE-hSK 10.200 bp ve 2.500 bp'dir.

3. Nükleofeksiyon

  1. Hücre peletleme
    1. T25 şişeskteki izole fetal koryonik villi fibroblastları% 80-90 izdiah edene kadar 5 mL tam medyada kültür edin.
    2. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve 1.2.2.1 - 1.2.2.3 adımlarında açıklandığı gibi trypsinize edin.
    3. 5 mL azaltılmış serum medyasında (örneğin, Opti-MEM) süpernatant, resuspend peleti çıkarın. Hemositometre ile hücreleri sayın ve nükleofeksiyon için10 6 hücre alın. 5 dakika boyunca 225 x g'da santrifüj. Üstnatant tamamen çıkarın.
  2. Reaktif hazırlama ve nükleofeksiyon
    1. 0,5 mL takviye ve 2,25 mL nükleofector çözeltisini (her ikisi de kit içinde sağlanır) karıştırarak nükleofector reaktifini hazırlayın.
    2. 1,5 mL'lik bir tüpe 100 μL nükleofector çözeltisi ekleyin. Tüpe her biri 1μg pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK ve pCXLE-hUL ekleyin. Bu karışımda 106 hücreyi (adım 3.1.2'den itibaren) nazikçe yeniden biriktirin.
    3. Hücre DNA süspansiyonunu cuvette'e aktarın, numunenin herhangi bir hava kabarcığı olmadan cuvette'in altını (kit içinde sağlanır) kaplamasını sağlayın. Cuvette'i kapla ve tutucuya tak. Nükleofector Programı U-23'ü seçin (yüksek verimlilik için) ve uygulayın.
    4. Cuvette'i tutucudan çıkarın ve 1 mL tam ortam ekleyin. İçeriği hafifçe 4 mL tam ortamla dolu 60 mm doku kültürüne aktarın (toplam 5 mL ortama). Hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöründe kuluçkaya yatırın.
    5. 24 saat sonra, hücrelerin takılı olup olmadığını kontrol edin. Ortamı tamamen değiştirin.
      NOT: Nükleofeksiyonda hücre ölüm hızı yüksektir ve bu da bağlanan birkaç canlı hücre bırakır.
    6. Hücreleri 10 gün boyunca tam ortamda tut ve sonraki 20 gün boyunca pluripotency ortamına kaydırın.
      NOT: Deneyin işe yarayıp yaramadığını doğrulamak için hücreleri yeniden programlayan hücrelerde (epitel morfolojisi ve kompakt koloni oluşumu gibi) meydana gelen morfolojik değişiklikleri takip etmek için düzenli olarak görselleştirin. Pluripotency medyasında 20 günlük kültürden sonra yaklaşık 25 iPSC kolonisi görülebilir.

4. iPSC kolonilerinin toplanması ve yayılması

  1. Koloniyi yeniden programlama plakasından toplama
    1. Çekilen cam pipetler veya 1 mL şırınga iğneleri kullanarak yeniden programlama kabında oluşan embriyonik kök hücre benzeri kolonileri manuel olarak parçalara ayırın ve pluripotency ortasına sahip inaktive fare embriyonik fibroblast besleyicilerle daha önce hazırlanmış plakaya aktarın veya mTESR aracı ile Matrigel kaplı plakalarda besleyici serbest kültürler oluşturun.
      NOT: Fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) fare embriyolarından enzimatik izolasyon kullanılarak türetilmiştir (13-14 günlük hamile dişi farelerden diseksiyon) ve mitomycin C tedavisi ile mitotik olarak inaktive edilmiştir. Tek klon popülasyonlarını, ayrı tabaklarda yeniden programlama plakasından veya karışık klon popülasyonlarından tek kolonileri yeniden programlama plakasından tek bir yemeğe aktararak kurun.
  2. Gelişmekte olan kolonilerin taze besleyicilere mekanik transferi ve istikrarlı iPSC'ler kurmak için geçiş
    1. Her iki günde bir beslenerek iPSC'leri pluripotency ortamında yayın ve her 5-7 günde bir 1:3 bölün. KnockOut Serum Replacement ve DMSO'nun 9:1 oranında donma karışımında kriyoprezer tasarrufu yaparak stokları hazırlayın.
      NOT: Nakavt Serum Replasmanı, FBS'deki bileşenler uzun süreli koruma sırasında pluripotent hücrelerin farklılaşmasına neden olabileceğinden, FBS yerine iPSC'lerin kriyoprezervasyonu için donma karışımında kullanılır.

5. iPSC'lerin Karakterizasyonu

NOT: PCR ve pluripotency biyobelirteç için immünostaining dahil olmak üzere karakterizasyon çalışmaları beşinci pasaj numarasından sonra yapılmıştır. Karyotyping daha sonraki bir pasaj numarasında gerçekleştirildi.

  1. Karyotyping
    1. 37 °C'de nemlendirilmiş CO2 inkübatöründe 45 dakika boyunca kolemidli bir iPSC'nin birleştirilmiş 60 mm Petri kabına muamele edin.
    2. %0,05 trypsin tedavisi ve santrifüj ile hasat edin. Hücre peletini gevşetmek için üstnatantı çıkarın ve kalan ortam izlerini pipet.
    3. 5 mL hipotonik çözelti ekleyin. Tüpü ters çevirerek karıştırın ve 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. 5 dakika boyunca 225 x g'da santrifüj.
      NOT: Elde edilen pelet kabarık görünmelidir.
    4. Peletin gevşemesi için dokunarak Carnoy'un fiksatif çözeltisine yavaşça 2,5 mL ekleyin.
    5. Hücre süspansiyonu temiz cam kaydıraklara bırakarak karyotipleme için spreadler hazırlayın.
    6. Slaytları 1 dakika boyunca % 0,15 tripsin ile tedavi edin ve PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra Giemsa çözeltisi ile 4 dakika lekelendirin ve damıtılmış bir su yıkama ile bitirin. Uygun yazılımları edin ve işleyin.
  2. Transgene serbest statüsünün gösterimi
    1. Genomik DNA İzolasyonu
      1. Pipet 20 μL proteaz 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün altına.
      2. Mikrosantrifüj tüpüne PBS'de yeniden depolanmış 200 μL TSiPSC ekleyin.
      3. Numuneye 200 μL Tampon AL ekleyin ve darbe girdabı ile 15 sn karıştırın.
      4. 56 °C'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
      5. Kapağın içindeki damlaları gidermek için mikrosantrifüj tüpünü kısaca santrifüjlayın.
      6. Numuneye 200 μL etanol (%96-100) ekleyin ve darbe girdabı ile 15 sn boyunca tekrar karıştırın. Karıştırdıktan sonra, kapağın içinden damlaları çıkarmak için tüpü kısa bir süre santrifüjlayın.
      7. Karışımı bir önceki adımdan mini spin sütununa (2 mL toplama tüpünde) jantı ıslatmadan dikkatlice uygulayın. Kapağı kapatın ve 1 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüj. Filtrat içeren tüpü atın ve mini spin sütununu temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin.
      8. Mini spin sütununu dikkatlice açın ve jantı ıslatmadan 500 μL Tampon AW1 ekleyin. Kapağı ve santrifüjü 6000 x g'da 1 dakika kapatın. Mini spin sütununu temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin ve filtrat içeren toplama tüpünü atın.
      9. Mini spin sütununu dikkatlice açın ve jantı ıslatmadan 500 μL Tampon AW2 ekleyin. Kapağı ve santrifüjü 3 dakika boyunca tam hızda (20.000 x g) kapatın.
      10. Mini spin sütununu yeni bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin ve eski toplama tüpünü filtratla birlikte atın. Olası Buffer AW2 taşıma olasılığını ortadan kaldırmak için 1 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin.
      11. Mini spin sütununu temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve filtratı içeren toplama tüpünü atın. Mini spin sütununu dikkatlice açın ve 200 μL Tampon AE veya damıtılmış su ekleyin. Oda sıcaklığında (15-25 °C) 5 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 1 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüjlayın.
    2. Transgene-Free Status PCR (KAPA HiFi PCR Kiti KR0368 Kullanılarak)
      1. Tüm reaktiflerin düzgün bir şekilde çözüldüğüne ve karıştırıldığına emin olun.
      2. Tablo 2'ye dayalı tüm reaksiyon bileşenlerinin uygun hacmini içeren bir PCR ana karışımı hazırlayın (buz üzerinde reaksiyonlar ayarlayın).
      3. Uygun hacimlerde PCR master mix, şablon ve astarı tek tek PCR tüplerine aktarın.
      4. Bireysel reaksiyonları kaplayın, karıştırın ve kısaca santrifüjlayın.
      5. Tablo 3'ünardından PCR gerçekleştirin.
  3. Pluripotency biyobelirteç tanımlaması
    1. Alkali fosfataz (AP) boyama
      1. Her 10 cm2 kültür alanı için 1,5 mL DMEM/F-12'de 3 μL 500x stok çözeltisini seyrelterek 1x AP canlı leke çalışma çözeltisi hazırlayın.
      2. Ortamı iPSC kültür çanaktan çıkarın. Kültürü DMEM/F-12 ile bir kez yıkayın. 1x AP canlı leke çözümünü iPSC'lere ekleyin. 45 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
      3. AP lekesini çıkarın ve DMEM/F-12 ile iki kez yıkayın. 30-90 dakikalık boyama içinde standart bir FITC filtresi kullanarak floresan mikroskop altında taze DMEM/F-12 ve görüntü ekleyin.
    2. Pluripotency biyobelirteçler için immünostaining
      1. Birikmiş iPSC kültürlerini 4 °C'de bir gecede %4 paraformaldehit ile düzeltin. Her biri 5 dakika boyunca yıkayın PBS Tween 20 (PBST) ile üç kez yıkayın.
      2. PBST'de %0,3 Triton X-100 ile hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika geçirgen hale verin. PBST ile üç kez yıkayın.
        NOT: Permeabilizasyon sadece hücre içi antijenler için yapılmalıdır.
      3. PBST'de %3 sığır serum albümini (BSA) olan hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bloke edin. Hücreleri primer antikorlarla (%1 BSA'da 1:1000 seyreltilmiş) bir gecede lekelendirin. Primer antikor inkübasyonundan sonra PBST ile üç kez yıkayın.
      4. Hücreleri ikincil antikorla (%1 BSA'da 1:1000 seyreltilmiş) oda sıcaklığında 5 saat kuluçkaya yatırın. PBST ile üç kez yıkayın.
      5. Çekirdeği 1 dakika boyunca 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) ile etiketle. Pbst ile hücreleri bir kez yıkayın.
      6. Floresan mikroskop altında görüntüler yakalayın.

6.In vitro farklılaşma tahlilleri

  1. Embriyoid Vücut (EB) Farklılaşması
    1. iPSC kolonilerini küçük parçalara ayırın, embriyoid vücut ortamında düşük ekli Petri kaplarında toplayın ve tabaklayın. Her 3 günde bir orta boy değiştirerek hücreleri 15 gün boyunca büyütün.
      NOT: 15 QB günü, üç mikrop tabakası biyobelirteçlerinin tespiti için doğrudan kullanılabilir. Alternatif olarak, büyüme faktörleri ile spesifik hücre soyları indüklenebilir, ardından biyobelirteç tespiti.
  2. Endoderm (Hepatosit) farklılaşması
    1. Monolayer kültürlerdeki iPSC'leri pluripotency ortamında büyütün.
    2. Bir kez birleştiğinde, 2 gün boyunca 1x İnsülin Transferrin Selenit ve 100 ng/mL activin A ile RPMI 1640 medyasına geçin, ardından 9 gün boyunca 30 ng/mL bFGF ve 20 ng/mL BMP4 ile RPMI 1640 ortamlarında büyüme. Her 2 günde bir ortamı değiştirin.
    3. 10 günden itibaren, 0.1 μM deksametazon ile ek ortam. Deneyi 20.
  3. Mezoderm (Kardiyomiyosit) farklılaşması
    1. Embriyoid vücut ortamında %0,5 Matrigel kaplı plakalarda plaka günü 8BS. ED'lerin takılmasına ve daraltmasına izin verin.
    2. 20 ng/mL BMP4 ile ek medya ve 20 gün boyunca büyüyün. Her 2-3 günde bir ortamı değiştirin. Deneyi 20.
  4. Ektoderm (Nöronal) farklılaşması
    1. Embriyoid vücut ortamında 2 μg/cm2 kollajen tip IV kaplı plakalar üzerinde plaka günü 4 ES. ED'lerin takılmasına ve daraltmasına izin verin.
    2. Ertesi gün, orta ila 2mg / mL glikoz, 1x İnsülin Transferrin Selenit ve 2.5μg / mL fibronektin ile DMEM F-12'ye kaydırın. Deneyi 15.
  5. Serebral organoid oluşumu
    1. TSIPSC'leri% 70-80 bir araya gelene kadar MEF'lerde 35 mm doku kültürü çanasında büyütün. Kolonileri kesin ve 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Hücreleri 5 dakika boyunca 225 x g'da santrifüj edin. Üstnatant atın.
    2. Üst saltantı çıkarmak için 2 mL PBS ve santrifüjde yeniden oluşturarak koloni parçalarını yıkayın.
    3. % 0.05 trypsin 1 mL ekleyin ve hücreleri yerinden çıkarmak için tüpe dokunun. Koloni parçalarını tek bir hücre süspansiyonuna dağıtmak için tüpü 37 °C'de 3-4 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Ayrışmaya bağlı hücre ölümünü önlemek için 10 μg/mL rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 dihidrochloride (ROCKi) içeren 4 mL pluripotency media ile seyreltilerek tripsin nötralize edin.
    5. Bir pelet elde etmek için santrifüj. Süpernatantı atın ve hücreleri 10 μg/mL ROCKi içeren 2mL embriyoid vücut ortamında yeniden biriktirin.
    6. Hücre sayımı için 10 μL hücre süspansiyonu çıkarın. Ölü hücreleri tespit etmek için 10 μL Trypan mavisi ekleyin. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
    7. 150 μL başına 9.000 canlı hücre elde etmek için hücre süspansiyonuna ROCKi ile uygun miktarda embriyoid vücut ortamı ekleyin.
    8. Plaka 150 μL düşük ekli 96 kuyu plakasının her kuyusunda ve 37 °C'de nemlendirilmiş bir CO2 inkübatörde kuluçkaya yaslanın. 24 saat sonra plakaları toplama için kontrol edin. 2. günde ortamı hafifçe çıkarın ve ROCKi olmadan taze embriyoid ortamı ile değiştirin.
    9. 6. günde, DB'leri% 1 N2 takviyesi, 2 mM GlutaMAX takviyesi ve 1 mM esansiyel olmayan amino asitler ve 1 μg / mL heparin ile DMEM-F12'den oluşan 500 μL nöral indüksiyon ortamı içeren düşük ekli 24 kuyu plakasının kuyularına aktarın. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
    10. Nöral indüksiyon ortamında 5 gün sonra, 200 μL uçlu boş bir uç tepsisinin üzerine 2 cm x 2 cm'lik bir parafilm kare katlayarak Matrigel'deki nöroepithelial agregaları gömün. Küçük ezikler yapmak için parmaklarınızı uç tepsislerindeki her deliğin üzerine eldivenli parmaklarla bastırın. Sterilize etmek için % 70 etanol ile parafilm temizleyin.
    11. Parafilm karesini 60 mm'lik bir çanağa aktarın. Nöroepithelial agregaları parafilmdeki eziklere aktarmak için kesme 200 μL uçları kullanın. Pipetleme ile fazla ortamı çıkarın.
    12. Nöroepithlial agregalara 30 μL çözünülmüş Matrigel ekleyin ve bir pipet ucu kullanarak agregayı Matrigel'in merkezine yerleştirin. Matrigel'in polimerize etmesi için 60 mm'lik kabı 20-30 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
    13. 1:1 DMEM-F12'den oluşan 5 mL serebral organoid farklılaşma ortamı ekleyin: Nörobakal ortam, %0,5 N2 takviyesi, 2,5 μg/mL insülin, 2 mM GlutaMAX takviyesi, 0,5 mM NEAA, %1 B27 takviyesi ve 2,5 mL penisilin-streptomisin.
    14. Steril bir kümes gücü kullanarak parafilm tabakasını ters çevirin ve Matrigel gömülü agregalar tabakadan ortama düşene kadar kabı çalkalayın. Gömülü agregaları 37 °C'de nemlendirilmiş bir CO2 inkübatörde 4 gün boyunca büyütün ve alternatif günlerde ortam değişiklikleri yaptı.
    15. 4 günlük statik kültürden sonra, 60 mm'lik tabakları 50 rpm'de sallanan inkübatörün içine monte edilmiş bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin. Organoidleri 3 ay boyunca kültüre edin ve her 3 günde bir serebral organoid farklılaşma ortamı ile tam medya değişiklikleri sağlar.

Sonuçlar

45XO karyotipli, kendiliğinden kürtaj yapılan bir fetüsten entegrasyonsuz iPSC'lerin üretimi
Turner sendromuna (TS) özgü 45XO karyotipli FCV'den fibroblastları izole ettik ve özellikle ilişkili nörolojik açıkların (Şekil 1a&b)aşağı akış modellemesi için kullanılabilecek TSiPSC'ler üretmek için epizomal yeniden programlama plazmidleri ile enfekte ettik. Transfection deneyleri için nonintegrating epizomal vektörler ve nükleofeksiy...

Tartışmalar

Sitogenetik olarak anormal fetal dokunun stabil hücresel modellerinin üretilmesi, kusurlu fenotipin sürekliliği için gereklidir. iPSC rotası, kusurlu özelliklerin sürekli korunması için hücre hazırlamanın en etkili yöntemidir20.

Pluripotent kök hücreler (PSC), erken bölünme embriyolarını andıran özel hücrelere kendini yenileme ve farklılaşma özelliklerini gösterir21. Bu nedenle, PSC'ler erken kürtaj yapılan fetüslerd...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yukarıdaki araştırma için mali destek Manipal Yükseköğretim Akademisi tarafından sağlanmıştır. Hattın karakterizasyonu kısmen NCBS'deki M.M. Panicker laboratuvarında gerçekleştirildi. Karyotyping konusunda yardım için Anand Tanı Laboratuvarı'ne teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15% trypsinThermo Fisher Scientific27250018G Banding
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindoleSigma AldrichD8417Immunocytochemistry
Activin ASigma AldrichSRP3003Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live StainThermo Fisher ScientificA14353AP staining
AMAXA Nucleofector IILonza-Nucleofection
AmnioMAX II complete mediaThermo Fisher Scientific, Gibco11269016Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
AmpicillinHiMediaTC021Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11059Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11034Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546InvitrogenA11035Immunocytochemistry
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific, Gibco15240096Contamination control
Anti-E-CadherinBD Biosciences610181Immunocytochemistry
Anti-NanogBD Biosciences560109Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4BD Biosciences611202Immunocytochemistry
Anti-SOX17BD Biosciences561590Immunocytochemistry
Anti-SOX2BD Biosciences561469Immunocytochemistry
Anti-SSEA4BD Biosciences560073Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81MilliporeMAB4381Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]Sigma AldrichF0291Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4Sigma AldrichSRP3016Differentiation assays
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3059Blocking
Collagen Human Type IVBD Biosciences354245Differentiation assays
Collagenase blendSigma AldrichC8051Digestion of foetal chorionic villi
DexamethasoneSigma AldrichD4902Differentiation assays
DMEM F12Thermo Fisher Scientific11320033Differentiation assays
FastDigest EcoR1Thermo ScientificFD0274Restriction digestion
FibronectinSigma AldrichF2518Differentiation assays
Giemsa StainHiMediaS011G Banding
Glacial Acetic AcidHiMediaAS001Fixative for karyotyping
GlucoseSigma AldrichG7528Differentiation assays
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodiumSigma AldrichH3149Differentiation assays
Insulin solution humanSigma AldrichI9278Differentiation assays
Insulin Transferrin SeleniteSigma AldrichI1884Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kitKapa BiosystemsKR0368OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX ColcemidThermo Fisher Scientific15210040Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEMThermo Fisher Scientific10829018Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agarHiMediaM1151FPlasmid purification
MatrigelBD Biosciences356234Differentiation assays
MEM Non-essential amino acidsThermo Fisher Scientific11140035Pluripotency and Embryoid body medium
MethanolHiMediaMB113Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/βMilliporeMAB1552Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector KitLonzaVAPD-1001Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)Sigma AldrichP6148Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-FAddgene27077Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSKAddgene27078Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hULAddgene27080Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin  Thermo Fisher Scientific, 15070063Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanateSigma AldrichP1951Immunocytochemistry
Phosphate buffered salineSigma AldrichP44171 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prepQIAGEN12143Plasmid purification
Potassium Chloride SolutionHiMediaMB043Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood KitQiagen51104Genomic DNA isolation
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093Hepatocyte differentiation medium
Sodium CitrateHiMediaRM255Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100HiMediaMB031Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, Gibco25300054Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20HiMediaMB067Preparation of PBST
β III tubulinSigma AldrichT8578Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochlorideSigma AldrichY0503Differentiation assays

Referanslar

  1. Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
  2. Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
  3. Biancotti, J. -. C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
  4. Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
  5. Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
  6. Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022 (2015).
  7. Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
  8. Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
  9. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  10. Soldner, F., et al. Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
  11. Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
  12. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  13. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
  15. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  16. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  17. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
  20. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  21. Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 178Yeniden Programlamansan kaynakl pluripotent k k h crelerAneuploidilerKonjenital MalformasyonlarSpontan Fetal l mTurner SendromuN rolojik Eksiklikler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır