Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di Turner (45XO) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome

Riepilogo

Questo protocollo descrive la generazione di iPSC libere da integrazione da fibroblasti del tessuto fetale attraverso la somministrazione di plasmidi episomiali mediante nucleofezione seguita dalla descrizione dei metodi utilizzati per la caratterizzazione iPSC e la differenziazione neuronale.

Abstract

Le aneuploidie cromosomiche causano gravi malformazioni congenite tra cui malformazioni del sistema nervoso centrale e morte fetale. Lo screening genetico prenatale è puramente diagnostico e non chiarisce il meccanismo della malattia. Sebbene le cellule dei feti aneuploidi siano preziose materie biologiche che portano l'aneuploidia cromosomica, queste cellule sono di breve durata, limitandone l'uso per esperimenti di ricerca a valle. La generazione di modelli di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) è un metodo efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua dei tratti aneuploidi. Si auto-rinnovano e si differenziano in cellule specializzate che ricordano lo sviluppo embrionale. Pertanto, le iPSC servono come strumenti eccellenti per studiare i primi eventi di sviluppo. La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara associata a un cromosoma X completamente o parzialmente mancante. La sindrome è caratterizzata da infertilità, bassa statura, disturbi endocrini, metabolici, autoimmuni e cardiovascolari e difetti neurocognitivi. Il seguente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di fibroblasti dal tessuto fetale TS (45XO), la generazione di TSiPSC libere da integrazione attraverso la somministrazione di plasmidi di riprogrammazione episomiale mediante nucleofezione seguita da caratterizzazione. Le TSiPSC di riprogrammazione sono state inizialmente sottoposte a screening mediante colorazione di fosfatasi alcalina a cellule vive, seguita da un'ampia indagine per i biomarcatori di pluripotenza. Colonie selezionate sono state sezionate meccanicamente, sono state attraversate più volte e cellule stabili auto-rinnovanti sono state utilizzate per ulteriori esperimenti. Le cellule hanno espresso fattori di trascrizione a pluripotenza OCT4, NANOG, SOX2, marcatori di superficie cellulare SSEA 4 e TRA1-81 tipici delle cellule staminali pluripotenti. Il cariotipo 45XO originale è stato mantenuto dopo la riprogrammazione. Le TSiPSC sono state in grado di formare corpi embrioidi e differenziarsi in cellule di endoderma, mesoderma ed ectoderma esprimendo biomarcatori specifici del lignaggio ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). I plasmidi episomiali esogeni sono stati persi spontaneamente e non rilevati dopo il passaggio 15 nelle cellule. Queste TSiPSC sono una preziosa risorsa cellulare per modellare il neurosviluppo molecolare e cellulare difettoso che causa deficit neurocognitivi associati alla sindrome di Turner.

Introduzione

Le aneuploidie portano a difetti alla nascita / malformazioni congenite e perdita di gravidanza negli esseri umani. ~ 50% -70% dei campioni da perdite di gravidanza mostrano anomalie citogenetiche. Gli embrioni aneuploidi persi all'inizio della gravidanza non possono essere facilmente ottenuti per l'analisi sperimentale, sollevando la necessità di sviluppare altri modelli che rappresentino da vicino l'embriogenesi umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da cellule con diagnosi di disturbi genetici sono state utilizzate per modellare le irregolarità genetiche rappresentative e le loro conseguenze sullo sviluppo fetale^1,2,3,4. Queste iPSC assomigliano alle cellule epiblastiche dell'embrione in via di sviluppo e possono ricapitolare i primi eventi di formazione dell'embrione. Consentono la comprensione e la caratterizzazione del programma di sviluppo dei lignaggi cellulari e il patterning nei primi embrioni di mammiferi. iPSC derivate in precedenza da fibroblasti cutanei e amniociti da test diagnostici prenatali di sindromi aneuploidiche come la monosomia X (sindrome di Turner), la trisomia 8 (sindrome di Warkany 2), la trisomia 13 (sindrome di Patau) e la trisomia parziale 11; 22 (sindrome di Emanuel) hanno fornito preziose informazioni sullo sviluppo fallito⁴.

La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara caratterizzata da infertilità femminile, bassa statura, disturbi endocrini e metabolici, aumento del rischio di malattie autoimmuni e predisposizione alle malattie cardiovascolari⁵. Sebbene sia l'unica sindrome da monosomia sopravvissuta, è anche letale per l'embrione in via di sviluppo causando aborti spontanei⁶. Gli individui sopravvissuti con TS presentano gradi di alterazione del materiale cromosomico X nelle loro cellule. I cariotipi vanno dalla perdita completa di un cromosoma X (45,XO) a mosaici come 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la presenza di cromosomi ad anello, la presenza di materiale cromosomico Y, ecc^5.

La diagnosi della sindrome viene generalmente effettuata mediante cariotipizzazione del sangue di individui sintomatici e campionamento dei villi coriali (CVS) per rilevare le sindromi da aneuploidia precoce. Poiché le sindromi aneuploidiche rappresentano circa il 30% degli aborti spontanei, è di routine cariotipizzare il prodotto del concepimento (POC) su un aborto spontaneo. Queste cellule fetali tra cui i villi coriali che possiedono l'anomalia citogenetica e le iPSC da esse derivate forniscono una preziosa fonte di materiale biologico per studiare le sindromi da aneuploidia^4,6. Le iPSC TS sono state precedentemente stabilite da amniociti tramite riprogrammazione retrovirale⁴, fibroblasti di villi coriali (ottenuti attraverso diagnosi prenatale) tramite riprogrammazione retrovirale⁶, da cellule mononucleate del sangue⁷ tramite riprogrammazione del virus Sendai e da fibroblasti cutanei di individui TS tramite riprogrammazione lentivirale⁴ . Poiché l'obiettivo principale del nostro laboratorio è comprendere il fallimento dello sviluppo, abbiamo generato iPSC TS da POC, in particolare la componente villi corionica di un aborto spontaneo⁸. Tutte le cellule isolate da questo tessuto fetale avevano un cariotipo 45XO e producevano iPSC con lo stesso cariotipo. Queste iPSC sono uniche in quanto sono le prime ad essere generate da un feto abortito e forniscono una risorsa preziosa per studiare i fallimenti della gravidanza legati all'aneuploidia. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata della generazione di iPSC da questa fonte cellulare unica tramite riprogrammazione episomiale.

I primi metodi di generazione di iPSC utilizzavano la trasduzione virale e i trasposoni per fornire i fattori di riprogrammazione. I metodi per indurre le cellule alla pluripotenza si sono evoluti dall'uso di vettori retrovirali^{integranti 9,}vettori lentivirali escissibili^10,11 e metodi basati su trasposoni¹² a vettori adenovirali non integranti¹³ e vettori basati sul virus Sendai¹⁴. La riprogrammazione retrovirale e lentivirale, sebbene efficiente, comporta l'integrazione dei fattori di riprogrammazione nei cromosomi dell'ospite, causando mutazioni di inserzione che hanno effetti imprevisti nelle iPSC. Inoltre, la riprogrammazione virale impedisce l'applicazione traslazionale delle iPSC. Sono stati esplorati i sistemi basati sull'RNA¹⁵ e il rilascio diretto di proteine¹⁶ per eliminare completamente i potenziali rischi associati all'uso di virus e trasfezioni di DNA. Tuttavia, questi metodi si sono dimostrati inefficienti.

Nel 2011, Okita et al. hanno riportato una migliore efficienza di riprogrammazione da parte dei plasmidi episomiali aumentata con la soppressione di TP53 tramite shRNA. Hanno anche sostituito cMYC con LMYC non trasformante (MYC associato al carcinoma polmonare a piccole cellule) per migliorare la sicurezza delle hiPSC. Questi plasmidi episomiali esprimono 5 fattori di riprogrammazione: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC e shRNA per TP53^17,18. Questi vettori vengono mantenuti extra-cromosomicamente e persi dalle cellule riprogrammate su coltura continua, rendendo così le linee prive di transgeni entro 10-15 passaggi. La nucleofezione è una forma specializzata di elettroporazione che fornisce acidi nucleici direttamente nel nucleo delle cellule ospiti. È un metodo efficiente per la consegna dei plasmidi di riprogrammazione in vari tipi di cellule. I plasmidi episomiali sono convenienti e compensano gli alti costi della nucleofezione. Questo metodo è efficiente e riproducibile in condizioni ottimizzate producendo iPSC stabili da una varietà di cellule somatiche. In questo protocollo, descriviamo il metodo per la generazione di iPSC da fibroblasti isolati dal tessuto fetale mediante nucleofezione di plasmidi di riprogrammazione episomiale. Ecco i protocolli dettagliati per l'isolamento dei fibroblasti dai villi corionici fetali, la purificazione dei plasmidi, la nucleofezione, il prelievo di colonie dalla piastra di riprogrammazione e la creazione di iPSC stabili.

È essenziale confermare la presenza di tratti di pluripotenza nelle iPSC appena generate. Ciò include la dimostrazione di fattori correlati alla pluripotenza (ad esempio, espressione di fosfatasi alcalina, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-caderina; di solito mostrata con saggi di immunofluorescenza o espressione genica), identificazione dei tre strati germinali mediante saggi di differenziazione in vitro per convalidare i loro potenziali di differenziazione, cariotipizzazione per determinare il contenuto cromosomico, tipizzazione STR per stabilire l'identità con le cellule genitrici, verificare la perdita di geni esogeni, e saggi in vivo più rigorosi come la formazione di teratomi e la complementazione tetraploide. Qui descriviamo i protocolli di caratterizzazione del cariotipo, la colorazione della fosfatasi alcalina delle cellule vive, il rilevamento di biomarcatori correlati alla pluripotenza mediante immunofluorescenza, saggi di differenziazione in vitro e metodo per dimostrare la perdita di geni esogeni¹⁹.

Protocollo

FCV sono stati ottenuti dal Manipal Hospital, Bengaluru, sotto l'approvazione del Comitato Etico degli Ospedali Manipal.

NOTA: vedere la Tabella 1 per la composizione di tutti i buffer e le soluzioni.

1. Isolamento dei fibroblasti dai villi corionici fetali (FCV)

1. Raccolta del campione e disintegrazione dei tessuti nella collagenasi
   1. Raccogliere FCV in condizioni sterili in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e trasportare (a temperatura ambiente) all'impianto di coltura cellulare.
   2. Trasferire i villi in una capsula di Petri da 60 mm e lavare più volte (minimo 4 volte) in PBS contenente 1x soluzione antibiotica antimicotica (PBS-AA). Rimuovere completamente PBS-AA mediante pipettaggio.
   3. Trattare i villi corionici con 1 mL di miscela di collagenasi (5 mg/mL) per 5 minuti a 37 °C.
   4. Neutralizzare con terreno di coltura cellulare contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), trasferire il digest in un tubo da 15 ml e centrifugare a 225 x g per 5 minuti per raccogliere i villi disintegrati e le cellule rilasciate come pellet.
2. Sottocultura ed espansione delle scorte
   1. Villi disintegrati a piastra insieme a cellule rilasciate in un pallone di coltura T25 contenente 5 ml di mezzi completi (ad esempio, AmnioMAX) e crescono fino a ottenere una coltura di fibroblasti confluenti.
   2. Espandere i fibroblasti in coltura per preparare le scorte per l'uso in successivi esperimenti di trasfezione e caratterizzazione come segue:
      1. Aggiungere 2 ml di tripsina allo 0,05% al matraccio T25 contenente fibroblasti FCV e incubare a 37 °C per 3-5 minuti per dissociare le cellule.
      2. Dopo l'incubazione, neutralizzare la tripsina aggiungendo FBS (allo stesso volume della tripsina).
         NOTA: il terreno di coltura contenente FBS può anche essere utilizzato per neutralizzare la tripsina, se aggiunto a un rapporto tripsina: media 1:3.
      3. Raccogliere le cellule dissociate in un tubo da 15 ml e centrifugare a 225 x g per 5 minuti per ottenere pellet cellulare.
      4. Decantante surnatante e pellet cellulare riconsoso in 1 mL di mezzo completo.
      5. Trasferire 500 μL ciascuno a piatti trattati con coltura tissutale da 60 mm e portare il volume a 5 mL. Questo rapporto di divisione di 1:2, è stato utilizzato anche per i passaggi successivi.
3. Crioconservazione
   1. Eseguire la dissociazione enzimatica utilizzando lo 0,05% di tripsina come descritto nei passaggi 1.2.2.1 - 1.2.2.3 e ottenere pellet cellulare.
   2. Scartare il surnatante e risospendare il pellet cellulare in 1 mL di miscela di congelamento, comprendente 1:9 dimetilsolfossido (DMSO): FBS.
   3. Trasferire il contenuto in un crioviale sterile e posizionare il flaconcino in un contenitore di congelamento.
   4. Congelare durante la notte a -80 °C e quindi trasferire i flaconcini in azoto liquido (-196 °C) il giorno successivo.

2. Isolamento e verifica del DNA dei plasmidi

1. Preparazione delle cellule batteriche
   1. Streak glycerol stocks di E. coli contenenti i tre singoli plasmidi pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK e pCXLE-hUL (da Addgene) su piastre separate di Agar Luria Bertani-ampicillina.
   2. Inoculare singole colonie in colture starter da 5 ml di terreno Luria Bertani-ampicillina. Incubare per 8 ore a 37 °C con agitazione (10 x g).
   3. Inoculare 200 μL di questa coltura di avviamento in 100 mL di terreno di luria Bertani-ampicillina. Incubare durante la notte a 37 °C con agitazione.
   4. Raccogliere la coltura batterica durante la notte mediante centrifugazione a 6000 x g per 15 minuti a 4 °C.
2. Isolamento plasmidi con kit di purificazione Midi Plasmid
   1. Resuspend pellet batterico in tampone di risuspensione da 4 mL.
   2. Aggiungere 4 mL di tampone di lisi e mescolare accuratamente invertendo vigorosamente 4-6 volte e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
   3. Aggiungere 4 mL di tampone di neutralizzazione pre-refrigerato e invertire il tubo 4-6 volte per mescolare accuratamente. Incubare su ghiaccio per 15 min.
   4. Centrifugare a ≥20.000 x g per 30 min a 4 °C. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco e ricentrizzare a ≥20.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
   5. Equilibrare la colonna applicando 4 mL di tampone di equilibrio.
   6. Applicare il surnatante alla colonna.
   7. Lavare la colonna due volte con 10 ml di tampone di lavaggio.
   8. DNA eluto con 5 mL di tampone di eluizione caldo (65 °C).
   9. Precipitare il DNA aggiungendo 3,5 ml di isopropanolo al DNA eluito. Mescolare bene. Centrifugare a ≥15.000 x g per 30 min a 4 °C. Decantante surnatante con attenzione.
   10. Lavare il pellet di DNA con 2 ml di etanolo al 70% e centrifugare a ≥15.000 x g per 10 minuti. Decantante surnatante con attenzione.
   11. Pellet essiccato all'aria per 5-10 min e sciogliere il DNA in un volume adeguato di acqua di grado PCR per ottenere una concentrazione finale di 1 μg/mL.
       NOTA: Non sciogliere il DNA in tamponi in quanto non è adatto per l'elettroporazione. La vecchia preparazione del DNA plasmidico non produce colonie riprogrammate.
3. Verifica del plasmide mediante digestione di restrizione EcoRI
   1. Combinare 15 μL di acqua priva di nucleasi, 2 μL di tampone 10x, 1 μg di DNA plasmidico e 1 μL di enzima EcoRI. Mescolare delicatamente.
   2. Incubare la miscela a 37 °C per 15 minuti in un blocco di calore.
   3. Mescolare i campioni di plasmide digeriti con 6x colorante di carico di gel di DNA ed elettroforese su gel di agarose all'1% in 1 tampone TAE con 0,5 μg / mL di bromuro di etidio. Includi la scala del DNA standard. Immagina il gel dopo che il DNA si è risolto in modo appropriato. Le dimensioni previste della banda EcoRI di pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F sono 6.834 bp, 3.758 bp e 1.108 bp; pCXLE-hUL sono 10.200 bp e 1.900 bp; pCXLE-hSK sono 10.200 bp e 2.500 bp.

3. Nucleofezione

1. Pellettizzazione delle celle
   1. Coltivare i fibroblasti dei villi corionici fetali isolati in pallone T25 in 5 ml di mezzo completo fino all'80-90% di confluenza.
   2. Lavare le cellule due volte con PBS e tripsinizzare come descritto nei passaggi 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
   3. Rimuovere il pellet surnatante e riconsosciato in 5 ml di mezzi sierici ridotti (ad esempio, Opti-MEM). Conta le cellule con l'emocitometro e prendi 10⁶ cellule per la nucleofezione. Centrifuga a 225 x g per 5 min. Rimuovere completamente il surnatante.
2. Preparazione del reagente e nucleofezione
   1. Preparare il reagente nucleofettivo mescolando 0,5 mL di integratore e 2,25 mL di soluzione nucleofettrice (entrambi forniti nel kit).
   2. Aggiungere 100 μL di soluzione nucleofettrice in un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 1μg ciascuno di pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK e pCXLE-hUL al tubo. Risusegnare delicatamente 10⁶ celle (dal punto 3.1.2) in questa miscela.
   3. Trasferire la sospensione di DNA cellulare in cuvetta, assicurandosi che il campione copra il fondo della cuvetta (fornita nel kit) senza bolle d'aria. Tappare la cuvetta e inserirla nel supporto. Selezionare il nucleofettore Programma U-23 (per un'alta efficienza) e applicare.
   4. Rimuovere la cuvetta dal supporto e aggiungere 1 mL di supporto completo. Trasferire delicatamente il contenuto in una capsula di Petri trattata con coltura tissutale da 60 mm riempita con 4 mL di terreno completo (per un totale di 5 mL di terreno). Incubare le cellule in un incubatore a CO₂ umidificato a 37 °C.
   5. Dopo 24 ore, controllare se le celle si sono attaccate. Sostituire completamente il supporto.
      NOTA: Il tasso di morte cellulare è elevato in nucleofezione lasciando poche cellule vitali che si attaccano.
   6. Mantenere le cellule in supporti completi per 10 giorni e passare a supporti a pluripotenza per i prossimi 20 giorni.
      NOTA: Visualizzare regolarmente le cellule per seguire i cambiamenti morfologici che si verificano nelle cellule di riprogrammazione (come la morfologia epiteliale e la formazione di colonie compatte) per confermare se l'esperimento sta funzionando. Circa 25 colonie di iPSC possono essere viste dopo 20 giorni di coltura in mezzi di pluripotenza.

4. Raccolta e propagazione delle colonie di iPSC

1. Raccolta della colonia dalla piastra di riprogrammazione
   1. Sezionare manualmente le colonie embrionali simili a cellule staminali formate nel piatto di riprogrammazione utilizzando pipette di vetro tirate o aghi per siringa da 1 mL e trasferirle su una piastra precedentemente preparata con alimentatori di fibroblasti embrionali di topo inattivati con mezzo di pluripotenza o stabilire colture prive di alimentatore su piastre rivestite di Matrigel con mezzo mTESR.
      NOTA: I fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono stati derivati utilizzando l'isolamento enzimatico da embrioni di topo (sezionati da topi femmina gravidi di 13-14 giorni) e sono stati mitoticamente inattivati dal trattamento con mitomicina C. Stabilire popolazioni di singoli cloni facendo crescere singole colonie dalla piastra di riprogrammazione in piatti separati o popolazioni di cloni misti trasferendo molte colonie dalla piastra di riprogrammazione a un singolo piatto.
2. Trasferimento meccanico delle colonie emergenti agli alimentatori freschi e al passaggio per stabilire iPSC stabili
   1. Propagare le iPSC in mezzo di pluripotenza nutrendosi ogni due giorni e dividere 1:3 ogni 5-7 giorni. Preparare le scorte crioconservando in un mix di congelamento di KnockOut Serum Replacement e DMSO nel rapporto 9:1.
      NOTA: KnockOut Serum Replacement viene utilizzato nella miscela di congelamento per la crioconservazione di iPSC invece di FBS in quanto i componenti dell'FBS potrebbero indurre la differenziazione delle cellule pluripotenti durante la conservazione a lungo termine.

5. Caratterizzazione delle iPSC

NOTA: Gli studi di caratterizzazione, tra cui PCR e immunostaining per biomarcatori di pluripotenza, sono stati effettuati dopo il numero di quinto passaggio. Il cariotipo è stato eseguito in un numero di passaggio successivo.

1. Cariotipo
   1. Trattare una capsula di Petri confluente da 60 mm di iPSC con colcemide per 45 minuti in incubatore a CO₂ umidificato a 37 °C.
   2. Raccolta con trattamento con tripsina 0,05% e centrifuga. Rimuovere il surnatante e pipettare le tracce rimanenti di mezzo per allentare il pellet cellulare.
   3. Aggiungere 5 ml di soluzione ipotonica. Mescolare invertendo il tubo e incubare per 20 minuti a 37 °C. Centrifuga a 225 x g per 5 min.
      NOTA: Il pellet ottenuto dovrebbe apparire soffice.
   4. Aggiungere lentamente 2,5 ml di soluzione fissativa di Carnoy, picchiettando per allentare il pellet.
   5. Preparare gli spread per il cariotipo facendo cadere la sospensione cellulare su vetrini puliti.
   6. Trattare i vetrini con tripsina allo 0,15% per 1 minuto e lavare una volta con PBS. Quindi colorare con la soluzione giemsa per 4 minuti e terminare con un lavaggio ad acqua distillata. Acquisire ed elaborare con software appropriato.
2. Dimostrazione dello stato di transgene free
   1. Isolamento del DNA genomico
      1. Pipettare 20 μL di proteasi nel fondo di un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
      2. Aggiungere 200 μL di TSiPSC spese in PBS al tubo microcentrifuga.
      3. Aggiungere 200 μL di Buffer AL al campione e mescolare per 15 s mediante vortice di impulsi.
      4. Incubare per 10 minuti a 56 °C.
      5. Centrifugare brevemente il tubo microcentrifuga per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio.
      6. Aggiungere 200 μL di etanolo (96-100%) al campione e mescolare di nuovo per 15 s mediante vortice di impulsi. Dopo la miscelazione, centrifugare brevemente il tubo per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio.
      7. Applicare con attenzione la miscela del passaggio precedente alla colonna mini spin (in un tubo di raccolta da 2 ml) senza bagnare il cerchio. Chiudere il tappo e centrifugare a 6000 x g per 1 min. Scartare il tubo contenente il filtrato e posizionare la mini colonna di centrifuga in un tubo di raccolta pulito da 2 ml.
      8. Aprire con attenzione la mini colonna di rotazione e senza bagnare il cerchio, aggiungere 500 μL di Buffer AW1. Chiudere il tappo e la centrifuga a 6000 x g per 1 min. Posizionare la colonna mini spin in un tubo di raccolta pulito da 2 ml ed eliminare il tubo di raccolta contenente il filtrato.
      9. Aprire con attenzione la mini colonna di rotazione e aggiungere 500 μL di Buffer AW2 senza bagnare il cerchio. Chiudere il tappo e centrifugare a piena velocità (20.000 x g) per 3 min.
      10. Posizionare la mini colonna di centrifuga in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml e scartare il vecchio tubo di raccolta con il filtrato. Centrifugare a piena velocità per 1 minuto per eliminare la possibilità di un possibile riporto del Buffer AW2.
      11. Posizionare la colonna mini spin in un tubo microcentrifuga pulito da 1,5 mL ed eliminare il tubo di raccolta contenente il filtrato. Aprire con attenzione la mini colonna di rotazione e aggiungere 200 μL di Tampone AE o acqua distillata. Incubare a temperatura ambiente (15-25 °C) per 5 min, quindi centrifugare a 6000 x g per 1 min.
   2. Transgene-Free Status PCR (utilizzando KAPA HiFi PCR Kit KR0368)
      1. Assicurarsi che tutti i reagenti siano adeguatamente scongelati e miscelati.
      2. Preparare una miscela master PCR contenente il volume appropriato di tutti i componenti della reazione in base alla Tabella 2 (impostare le reazioni sul ghiaccio).
      3. Trasferire i volumi appropriati di mix master PCR, modello e primer ai singoli tubi PCR.
      4. Tappare le singole reazioni, mescolare e centrifugare brevemente.
      5. Eseguire la PCR seguendo la Tabella 3.
3. Identificazione di biomarcatori di pluripotenza
   1. Colorazione alcalina della fosfatasi (AP)
      1. Preparare una soluzione di lavoro con macchie vive 1x AP diluendo 3 μL di soluzione stock 500x in 1,5 mL DMEM/F-12 per ogni 10 cm² di area di coltura.
      2. Rimuovere il mezzo dal piatto di coltura iPSC. Lavare la coltura con DMEM/F-12 una volta. Aggiungere la soluzione di colorazione viva 1x AP sulle iPSC. Incubare a 37 °C per 45 min.
      3. Rimuovere la macchia AP e lavare due volte con DMEM/F-12. Aggiungi DMEM/F-12 fresco e immagine al microscopio fluorescente utilizzando un filtro FITC standard entro 30-90 minuti dalla colorazione.
   2. Immunostaining per biomarcatori di pluripotenza
      1. Fissare colture confluenti di iPSC con il 4% di paraformaldeide durante la notte a 4 °C. Lavare tre volte con PBS Tween 20 (PBST), ogni lavaggio per 5 min.
      2. Permeabilizzare le cellule con 0,3% Triton X-100 in PBST per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare tre volte con PBST.
         NOTA: La permeabilizzazione deve essere eseguita solo per gli antigeni intracellulari.
      3. Blocca le cellule con il 3% di albumina sierica bovina (BSA) in PBST per 30 minuti a temperatura ambiente. Macchiare le cellule con anticorpi primari (diluiti 1:1000 in 1% BSA) durante la notte. Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, lavare tre volte con PBST.
      4. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario (diluito 1:1000 in 1% BSA) per 5 ore a temperatura ambiente. Lavare tre volte con PBST.
      5. Etichettare i nuclei con 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 1 minuto. Lavare le cellule una volta con PBST.
      6. Cattura immagini al microscopio fluorescente.

6. Saggi di differenziazionein vitro

1. Differenziazione del corpo embrioide (EB)
   1. Tagliare le colonie di iPSC in piccoli pezzi, raccogliere e placcare in piastre di Petri a basso attacco in mezzo corporeo embrionale. Far crescere le cellule per 15 giorni sostituendo il mezzo ogni 3 giorni.
      NOTA: Gli EB del giorno 15 possono essere utilizzati direttamente per il rilevamento dei tre biomarcatori dello strato germinale. In alternativa, specifici lignaggi cellulari possono essere indotti con fattori di crescita, seguiti dal rilevamento di biomarcatori.
2. Differenziazione dell'endoderma (epatociti)
   1. Coltiva le iPSC in colture monostrato in mezzo di pluripotenza.
   2. Una volta confluente, passare a supporti RPMI 1640 con 1x insulina transferrina selenito e 100 ng / mL activina A per 2 giorni, seguito da una crescita dei mezzi RPMI 1640 con 30 ng / mL bFGF e 20 ng / mL BMP4 per 9 giorni. Sostituire il mezzo ogni 2 giorni.
   3. Dal giorno 10 in poi, integrare i media con desametasone da 0,1 μM. Terminare l'esperimento il giorno 20.
3. Differenziazione del mesoderma (cardiomiociti)
   1. Piastra giorno 8 EBs su piastre rivestite di Matrigel allo 0,5% in mezzo corporeo embrioide. Consentire agli EB di attaccarsi e comprimere.
   2. Integrare i supporti con 20 ng / mL BMP4 e crescere per 20 giorni. Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni. Terminare l'esperimento il giorno 20.
4. Differenziazione dell'ectoderma (neuronale)
   1. Piastra giorno 4 EBs su 2 μg/cm² piastre rivestite di collagene di tipo IV in mezzo corporeo embrioide. Consentire agli EB di attaccarsi e comprimere.
   2. Il giorno successivo, passare al DMEM F-12 con 2 mg / mL di glucosio, 1x insulina transferrina selenito e 2,5 μg / mL di fibronectina. Terminare l'esperimento il giorno 15.
5. Formazione di organoidi cerebrali
   1. Coltiva TSiPSC in un piatto di coltura tissutale da 35 mm su MEF fino al 70-80% di confluente. Tagliare le colonie e raccoglierle in un tubo da 15 ml. Centrifugare le celle a 225 x g per 5 min. Scartare il surnatante.
   2. Lavare i pezzi di colonie riconsociendo in 2 ml di PBS e centrifugare per rimuovere il surnatante.
   3. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,05% e toccare il tubo per rimuovere le cellule. Incubare il tubo a 37 °C per 3-4 minuti per dissociare i pezzi della colonia in una sospensione a cellula singola.
   4. Neutralizzare la tripsina per diluizione con 4 mL di mezzo di pluripotenza contenente 10 μg/mL di inibitore della proteina chinasi rho-associata (ROCK) Y-27632 dicloridrato (ROCKi) per prevenire la morte cellulare indotta dalla dissociazione.
   5. Centrifuga per ottenere un pellet. Scartare il surnatante e risusemere le cellule in un mezzo corporeo embrioide da 2 ml contenente 10 μg/mL di ROCKi.
   6. Rimuovere 10 μL di sospensione cellulare per il conteggio cellulare. Aggiungere 10 μL di blu trypan per rilevare le cellule morte. Contare le cellule usando un emocitometro.
   7. Aggiungere un volume appropriato di mezzo corporeo embrioide con ROCKi alla sospensione cellulare per ottenere 9.000 cellule vive per 150 μL.
   8. Piastra da 150 μL in ogni pozzetti di una piastra a 96 pozzetti a basso attacco e incubare in un incubatore a CO2 umidificato a 37 °C. Controllare le piastre per l'aggregazione dopo 24 ore. Il giorno 2 rimuovere delicatamente il mezzo e sostituirlo con un mezzo embrionale fresco senza ROCKi.
   9. Il giorno 6, trasferire gli EB ai pozzetti di una piastra a 24 pozzetti a attacco basso contenente 500 μL di mezzo di induzione neurale composto da DMEM-F12 con supplemento N2 all'1%, supplemento GlutaMAX da 2 mM e 1 mM di aminoacidi non essenziali e 1 μg/mL di eparina. Cambia il mezzo ogni 2 giorni.
   10. Dopo 5 giorni nel mezzo di induzione neurale incorporare gli aggregati neuroepiteliali in Matrigel stratificando un quadrato di parafilm di 2 cm x 2 cm su un vassoio di punta vuoto di punte da 200 μL. Premere parafilm con le dita guantate su ciascun foro nel vassoio della punta per fare piccole ammaccature. Pulire il parafilm con il 70% di etanolo per sterilizzare.
   11. Trasferire il quadrato del parafilm in una parabola da 60 mm. Utilizzare punte tagliate da 200 μL per trasferire gli aggregati neuroepiteliali sulle ammaccature nel parafilm. Rimuovere il mezzo in eccesso mediante pipettaggio.
   12. Aggiungere 30 μL di Matrigel scongelato sugli aggregati neuroepithliali e posizionare l'aggregato al centro del Matrigel usando una punta di pipetta. Posizionare il piatto da 60 mm per 20-30 minuti in un incubatore a 37 °C per la polimerizzazione del Matrigel.
   13. Aggiungere 5 mL di mezzo di differenziazione organoide cerebrale composto da 1:1 DMEM-F12: mezzo neurobasale, integratore N2 0,5%, 2,5 μg/mL di insulina, integratore GlutaMAX da 2 mM, 0,5 mM NEAA, supplemento B27 all'1% e 2,5 ml di penicillina-streptomicina.
   14. Usando una pinica sterile capovolgere il foglio di parafilm e agitare il piatto fino a quando gli aggregati incorporati in Matrigel cadono dal foglio nel mezzo. Coltivare gli aggregati incorporati in un incubatore a CO₂ umidificato a 37 °C per 4 giorni, dando cambiamenti di supporto a giorni alterni.
   15. Dopo 4 giorni di coltura statica posizionare le parabole da 60 mm su uno shaker orbitale installato all'interno dell'incubatore scuotendo a 50 giri/min. Colturare gli organoidi per 3 mesi dando cambiamenti completi dei media con mezzo di differenziazione organoide cerebrale ogni 3 giorni.

Risultati

Generazione di iPSC senza integrazione da un feto abortito spontaneamente con cariotipo 45XO
Abbiamo isolato fibroblasti da FCV con un cariotipo 45XO specifico per la sindrome di Turner (TS) e li abbiamo nucleoatizzati con plasmidi di riprogrammazione episomiale per generare TSiPSC che possono essere utilizzate per la modellazione a valle della sindrome, in particolare i deficit neurologici associati (Figura 1a&b). Abbiamo usato vettori episomiali non ing...

Discussione

La generazione di modelli cellulari stabili di tessuto fetale citogeneticamente anormale è necessaria per perpetuare il fenotipo difettoso. La via iPSC è il metodo più efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua delle proprietà difettose²⁰.

Le cellule staminali pluripotenti (PSC) mostrano proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione in cellule specializzate che ricordano gli embrioni di scissione precoce²¹. Quindi, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% trypsin	Thermo Fisher Scientific	27250018	G Banding
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023	Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D8417	Immunocytochemistry
Activin A	Sigma Aldrich	SRP3003	Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353	AP staining
AMAXA Nucleofector II	Lonza	-	Nucleofection
AmnioMAX II complete media	Thermo Fisher Scientific, Gibco	11269016	Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin	HiMedia	TC021	Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11059	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15240096	Contamination control
Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Immunocytochemistry
Anti-Nanog	BD Biosciences	560109	Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4	BD Biosciences	611202	Immunocytochemistry
Anti-SOX17	BD Biosciences	561590	Immunocytochemistry
Anti-SOX2	BD Biosciences	561469	Immunocytochemistry
Anti-SSEA4	BD Biosciences	560073	Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81	Millipore	MAB4381	Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]	Sigma Aldrich	F0291	Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4	Sigma Aldrich	SRP3016	Differentiation assays
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3059	Blocking
Collagen Human Type IV	BD Biosciences	354245	Differentiation assays
Collagenase blend	Sigma Aldrich	C8051	Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	Differentiation assays
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	11320033	Differentiation assays
FastDigest EcoR1	Thermo Scientific	FD0274	Restriction digestion
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2518	Differentiation assays
Giemsa Stain	HiMedia	S011	G Banding
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS001	Fixative for karyotyping
Glucose	Sigma Aldrich	G7528	Differentiation assays
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium	Sigma Aldrich	H3149	Differentiation assays
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278	Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite	Sigma Aldrich	I1884	Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit	Kapa Biosystems	KR0368	OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid	Thermo Fisher Scientific	15210040	Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	10829018	Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar	HiMedia	M1151F	Plasmid purification
Matrigel	BD Biosciences	356234	Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140035	Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol	HiMedia	MB113	Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β	Millipore	MAB1552	Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit	Lonza	VAPD-1001	Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F	Addgene	27077	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK	Addgene	27078	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL	Addgene	27080	Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific,	15070063	Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma Aldrich	P1951	Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep	QIAGEN	12143	Plasmid purification
Potassium Chloride Solution	HiMedia	MB043	Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit	Qiagen	51104	Genomic DNA isolation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875093	Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate	HiMedia	RM255	Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100	HiMedia	MB031	Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermo Fisher Scientific, Gibco	25300054	Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20	HiMedia	MB067	Preparation of PBST
β III tubulin	Sigma Aldrich	T8578	Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride	Sigma Aldrich	Y0503	Differentiation assays