CcCIPK14 Análisis de la función génica para iluminar el eficiente sistema transgénico de raíces

Resumen

Aquí presentamos un sistema de transformación eficiente y estable para el análisis funcional del gen CcCIPK14 como ejemplo, proporcionando una base técnica para estudiar el metabolismo de plantas no modelo.

Resumen

Un sistema de transformación eficiente y estable es fundamental para el estudio de la función génica y la mejora molecular de las plantas. Aquí, describimos el uso de un sistema de transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes en gandul. El tallo está infectado con A. rhizogenes portador de un vector binario, que induce callo a los 7 días y raíces adventicias a los 14 días. La raíz pilosa transgénica generada se identificó mediante análisis morfológico y un gen reportero de GFP. Para ilustrar aún más el rango de aplicación de este sistema, CcCIPK14 (proteínas quinasas que interactúan con proteínas similares a la calcineurina B) se transformó en gandul utilizando este método de transformación. Las plantas transgénicas fueron tratadas con ácido jasmónico (JA) y ácido abscísico (ABA), respectivamente, con el fin de probar si CcCIPK14 responde a esas hormonas. Los resultados demostraron que (1) las hormonas exógenas podrían aumentar significativamente el nivelde expresión de CcCIPK14, especialmente en plantas con sobreexpresión (OE) de CcCIPK14 ; (2) el contenido de genisteína en las líneas CcCIPK14-OE fue significativamente mayor que el control; (3) el nivel de expresión de dos genes de flavonoide sintasa clave aguas abajo, CcHIDH1 y CcHIDH2, se reguló al alza en las líneas CcCIPK14-OE; y (4) el sistema transgénico de la raíz pilosa se puede utilizar para estudiar genes metabólicamente funcionales en plantas no modelo.

Introducción

La transformación es una herramienta básica para evaluar la expresión de genes exógenos ^1,2. Muchos aspectos biológicos de las plantas de recursos son comunes a todas las plantas; por lo tanto, se pueden realizar estudios funcionales de ciertos genes en plantas modelo (como Arabidopsis)³. Sin embargo, muchos genes de las plantas son únicos en sus patrones de función y expresión, lo que requiere estudios en especies propias o estrechamente relacionadas, especialmente en el caso de las plantas de recursos ^3,4. Las células vegetales pueden detectar varias señales que permiten a las plantas mostrar cambios específicos en la expresión génica, el metabolismo y la fisiología en respuesta a diferentes condiciones de estrés ambiental ^5,6,7. Los flavonoides son actores cruciales en el proceso de señalización de las plantas que responden al estrés ambiental ^5,8,9. Además, el contenido de flavonoides en las plantas hortícolas y medicinales también es un indicador importante para la evaluación de la calidad¹⁰. La identificación de los genes implicados en la regulación de la síntesis de flavonoides en respuesta a señales externas es crucial para comprender el mecanismo de la síntesis de flavonoides en las plantas. Varios estudios han revelado que la aplicación de hormonas exógenas puede promover la acumulación de flavonoides ^6,11. Un sistema de transformación estable y un método de validación de la función génica son esenciales para demostrar la función de los genes y comprender el metabolismo secundario en las plantas.

La transformación mediada por agrobacterias es ampliamente utilizada en la inserción de ADN ^5,8,9. Agrobacterium tumefacient puede transferir genes de anillo a los cromosomas de las células vegetales, y las fitohormonas exógenas inducen una o pocas células huésped que pueden regenerar plantas para obtener transformantes estables 12,13,14. Los métodos de transformación mediados por Agrobacterium tumefacient son más aplicables a especies vegetales aptas para la manipulación in vitro, mientras que la mayoría de las plantas leñosas perennes limitan la aplicación de este método debido a su dificultad de regeneración ^4,15. A. rhizogenes también es capaz de modificar el genoma de las células huésped¹⁶. En el presente estudio, hemos desarrollado un procedimiento de transformación eficiente y estable mediado por A. rizogenes. A. rizogenes contiene un segundo plásmido binario portador de ADN T de gen no natural además del plásmido Ri. La planta huésped está infectada y se puede obtener una planta compuesta con raíces peludas transgénicas que emergen del brote de tipo silvestre ^16,17. Los sistemas de transformación mediados por A. rizogenes son adecuados para su aplicación en la investigación de plantas leñosas debido a su regeneración rápida, de bajo costo y no requerida para la planta. Más de 160 tipos de plantas han inducido con éxito raíces peludas, y la mayoría de las cuales se encuentran en Solanaceae, Compositae, Cruciferae, Convolvulaceae, Umbelliferae, Leguminosae, Caryophyllaceae y Polygonaceae^18,19. En comparación con A. tumefaciens, A. rhizogenes mostró mayor eficiencia en la transformación mediada del gandul^17,20.

En este estudio, se utilizó el gandul como ejemplo para introducir el proceso de transformación mediado por A. rhizogenes. Desde la inoculación hasta el enraizamiento, los experimentos duraron 5 semanas. Identificamos la transformación de la raíz adventicia a través de la morfología y el gen reportero GFP, y la eficiencia de transformación fue de hasta 75%. Además, tratamos la planta de composite con JA y ABA, así como detectamos transcripciones y metabolitos secundarios mediante PCR real cuantitativa y HPLC (cromatografía líquida de alta resolución). Se confirma que el nivel de expresión de CcCIPK14 responde no solo a JA y ABA, sino que también afecta a la biosíntesis de flavonoides. Este sistema es adecuado para estudiar la función de los genes asociados con el metabolismo secundario. También proporciona un nuevo enfoque para el estudio de plantas no modelo en falta de un sistema de transformación suficientemente estable 17,21,22.

Protocolo

NOTA: El gandul es un cultivo de leguminosas diploide que pertenece a la familia Fabaceae. Las semillas de gandul utilizadas en este experimento son de la Universidad Forestal del Noreste de China y están codificadas como 87119. Los pasos principales de este protocolo se ilustran en la Figura 1A. La incubación de las plántulas se realizó en un ambiente de alta humedad a 25 °C bajo luces fluorescentes a 50 μmol de fotones por ^{m-2 s-1} en un fotoperiodo de 16 h. Las cepas de A. rhizogenes K599 (NCPPB2659) se conservaron en el laboratorio. Se almacenaron en medio manitol de levadura (YEP) con glicerol al 15% a -80 °C. El protocolo descrito en este trabajo se basó en el protocolo de Meng et ^al.21.

ATENCIÓN: Deposite todas las bacterias y plantas modificadas genéticamente en el contenedor de residuos adecuado. Utilice todos los productos químicos peligrosos en una campana extractora y deséchelos en el contenedor de residuos peligrosos.

1. Preparación de plántulas de gandul.

1. Elija semillas de gandul regordetas y sin daños (Figura 1A) que se hayan almacenado durante menos de 1 año.
2. Remoje las semillas en agua destilada durante 24 h (Figura 1B). Transfiera las semillas hinchadas a una bandeja de semillas y colóquelas en el invernadero.
3. Las semillas comienzan a germinar después de 1-2 días. Cuando el epicótilo alcance 1,5 cm, trasplante las plántulas a macetas de 10 cm (diámetro) x 9 cm (altura) que contengan tierra y arena en una proporción de volumen de 3:1.
   NOTA: El suelo consiste en una mezcla de tierra nutritiva, vermiculita y perlita en una proporción de 2:1:1.
4. Cultiva la plántula en un invernadero.

2. Activación de A. rhizogenes

NOTA: La cepa utilizada para la transformación de A. rhizogenes fue la K599 conservada a -80 °C. El vector binario pROK2 (pBIN438; http://www.biovector.net/product/428388.html) contiene proteína verde fluorescente (GFP) como gen indicador y un gen de resistencia a la kanamicina como marcador seleccionable para transformar A. rhizogenes.

1. Descongele A. rhizogenes en hielo.
2. Sumerja las bacterias y cúbralas uniformemente sobre el medio de manitol de levadura (YEP) suplementado con 8 g/L de polvo de agar, 25 mg/L de rifampicina y 25 mg/L de kanamicina (YRK, pH 7.0).
3. Incubar a 28 °C durante 16 h.
4. Seleccionar colonias monoclonales. Cultivarlos en un tubo de 50 mL que contenga 10 mL de medio YEB suplementado con 25 mg/L de rifampicina y 25 mg/L de kanamicina (YRK, pH 7.0). Coloque el tubo de centrífuga en una incubadora agitadora con un radio de rotación de 10 cm, a 28 °C y 200 rpm durante 16 h.

3. Transformación de plantas con A. rhizogenes

NOTA: Seleccione plantas sanas para infectar A . rhizogenes utilizando el siguiente procedimiento de inyección. Este procedimiento da como resultado raíces pilosas transformadas. Para analizar la función génica de CcCIPK14, es necesario un control. Se inyectaron soluciones de A. rhizogenes con vector vacío o plásmidosCc CIPK14-pROK2 en plántulas para inducir raíces pilosas.

1. Inocular A. rhizogenes
   1. Elija plántulas de gandul con el mismo estado de crecimiento.
   2. Vacíe el aire de la jeringa de 1 mL y aspire 0,3 mL de líquido bacteriano. Empuje lentamente la varilla de empuje para llenar la aguja de la jeringa con líquido bacteriano²¹.
   3. Primero fije el tallo de la plántula de gandul con pinzas y luego pinche la aguja de la jeringa en el tallo a 1 cm.
   4. Al retirar la jeringa, sumerja completamente la punta de la aguja en el vástago. Empuje lentamente la varilla de empuje para bombear el líquido bacteriano fuera de la herida penetrante.
      NOTA: La unión del líquido bacteriano residual a la herida en gotitas de bacterias puede mejorar la infección y la eficiencia de la transformación.
2. Manejo de plántulas
   NOTA: Las altas temperaturas y humedad pueden mejorar la eficiencia de la infección de A. rhizogenes.
   1. Coloque las plántulas inoculadas con A. rhizogenes en una bandeja (30 cm x 60 cm x 6 cm) con 1 L de agua. Utilice una tapa de plástico transparente (30 cm x 60 cm x 30 cm) como cubierta para mantener la temperatura y la humedad del ambiente interno.
   2. Retire periódicamente las hojas caídas y las hifas floculantes adheridas a las puntas de las hojas y las hojas caídas.
   3. Después de una semana, el callo comienza a aparecer en la herida. Posteriormente, mantenga la tapa de plástico entreabierta.
   4. Después de 4-5 semanas, la mayor parte del tejido del callo se diferenció en raíces adventicias. Retire la tapa de plástico.
   5. Añade 1 L de agua a la bandeja cada 3 días para mantener la tierra húmeda.
      NOTA: El gandul es una planta tolerante a la sequía; Demasiada agua puede inhibir el crecimiento de las plantas.

4. Identificación de raíces pilosas transformadas

NOTA: Las raíces pilosas transformadas se pueden identificar en función de la morfología y el nivel genético. Este procedimiento se centra principalmente en el ensayo de identificación de genes reporteros (GFP).

1. Recoja las puntas de la raíz pilosa y marque la parte restante.
2. Evalúe si hay fluorescencia verde bajo un microscopio de escaneo láser confocal.
3. Triturar 0,1 g de raíces pilosas con una fuerte señal de fluorescencia hasta convertirlas en polvo fino en nitrógeno líquido.
4. De acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de ADN genómico de plantas, prepare el ADN genómico de líneas transgénicas independientes de gandules mediante el método de bromuro de cetiltrimetilamonio modificado (CTAB)²³.
5. Utilice 500 ng de plantilla de ADN genómico y cebadores para PCR. Los cebadores se muestran en la Tabla 1.
6. Realice el siguiente ciclo de amplificación: predesnaturalización a 94 °C durante 5 min, desnaturalización a 94 °C durante 30 s, recocido de cebadores a 55 °C durante 30 s y extensión del cebador a 72 °C durante 30 s. Después de 36 ciclos y una extensión final de 10 min a 72 °C, analice los productos amplificados en un gel de agarosa al 1%.
7. Tiñe los geles con tinción de ácido nucleico y visualízalos bajo luz ultravioleta.

5. Tratamiento hormonal exógeno

NOTA: Las plantas compuestas positivas se trataron con hormonas exógenas para estudiar el efecto de CcCIPK14 sobre el metabolismo. Las plantas compuestas inducidas por A. rhizogenes se dividieron en tres grupos: grupo de tratamiento con JA, grupo de tratamiento con ABA y grupo control (Figura 3A).

1. Reducir el riego 3 días antes del tratamiento hormonal exógeno.
2. Prepare las soluciones de JA y ABA a una concentración de 5 mg/L.
   NOTA: El polvo de JA y ABA se disuelve primero en alcohol etílico y luego se llena hasta el volumen objetivo con agua destilada.
3. Con una botella rociadora, rocíe soluciones de JA y ABA de manera uniforme sobre las hojas de las plantas. Trate el grupo de control con agua.
   NOTA: Se roció un promedio de 10 mL de solución en cada plántula.
4. Cubra con la tapa de plástico inmediatamente después del tratamiento de pulverización. Vuelva a colocarlo en el invernadero de clima artificial.

6. Recogida y conservación de muestras

NOTA: Después de 3 h de tratamiento hormonal exógeno, se recolectaron materiales vegetales de diferentes grupos de tratamiento.

1. Retire las raíces pilosas leonadas y contaminadas y seleccione aquellas con apariencia blanca. Recoge estas raíces peludas y sécalas con papel absorbente.
2. Divida las raíces peludas recolectadas de cada plántula en dos partes. Coloque una parte en un tubo de ensayo numerado y envuélvalo con papel de aluminio marcado.
3. Liofilizar el papel de aluminio en nitrógeno líquido y, a continuación, almacenar todo el papel de aluminio cosechado a -80 °C para su posterior investigación.

Resultados

Transformación de la raíz pilosa mediada por A. rhizogenes en el gandul
Este estudio describió los protocolos paso a paso para la transformación genética de raíces pilosas mediadas por A. rhizogenes, que tiene importancia en el campo de las moléculas vegetales. Se necesitaron unas 5 semanas para obtener raíces pilosas de las raíces de un gandul infectado por A. rhizogenes. La F...

Discusión

La caracterización rápida de la función génica es el objetivo común en el estudio de la mayoría de las especies, y es particularmente importante para el desarrollo de las plantas de recursos. La transformación mediada por A. rizogenes ha sido ampliamente utilizada en el cultivo de raíces pilosas. El cultivo de raíces pilosas (HRC), como fuente única de producción de metabolitos, desempeña un papel fundamental en la ingeniería metabólica^18,28

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mL qPCR 8-strip tube (with optical caps)	KIRGEN, Shanghai, China	KJ2541
ABA	Solarbio Life Science, Beijing, China	A8060
Agar powder	Solarbio Life Science, Beijing, China	A8190
Centrifuge	Osterode am Harz, Germany	d37520
CFX Connect TW Optics Module	Bio-rad, US	1855200
constant temperature incubator	Shanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, Shanghai,China	BPX-82
Diposable Petri dish	Corning, US
Dry Bath	Gingko Bioscience Company/Coyote bioscience, China	H2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50	Promega, Beijing, China	LS1030
Electronic balance	Tianjin, China	TD50020
Filter pape	Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, China
FiveEasy Plus	Mettler Toledo, Shanghai, China	30254105
Flowerpot 9*9	China
JA	Solarbio Life Science, Beijing, China	J8070
Kan	Solarbio Life Science, Beijing, China	K8020
MagicSYBR Mixture	CWBIO, Beijing, China	CW3008M
Mini Microcentrifuge	Scilogex, Beijing, China	S1010E
NaCl	Solarbio Life Science, Beijing, China	S8210
NanPhotometer N50 Touch	IMPLEN GMBH, Germany	T51082
Purelab untra
Rifampicin	Solarbio Life Science, Beijing, China	R8010
Seedling box 30*200	China
Thermal Cycler PCR	Bio-rad, US	T100
Thermostatic oscillator	Beijing donglian Har lnstrument Manufacture Co.,Ltd,China	DLHE-Q200
Tomy Autoclave	Tomy, Japan	SX-500
Tryptone	Solarbio Life Science, Beijing, China	LP0042
UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis( with dsDNase)	US Everbright INC, Jiangsu, China	R2028
Yeast Extract powder	Solarbio Life Science, Beijing, China	LP0021