CcCIPK14 Genfunktionsanalyse zur Aufklärung des effizienten wurzeltransgenen Systems

Zusammenfassung

Hier wird ein effizientes und stabiles Transformationssystem für die funktionelle Analyse des CcCIPK14-Gens als Beispiel vorgestellt, das eine technische Grundlage für die Untersuchung des Metabolismus von Nicht-Modellpflanzen bietet.

Zusammenfassung

Ein effizientes und stabiles Transformationssystem ist von grundlegender Bedeutung für die Erforschung der Genfunktion und die molekulare Züchtung von Pflanzen. Hier beschreiben wir die Verwendung eines Agrobacterium rhizogenes-vermittelten Transformationssystems auf Taubenerbsen. Der Stängel ist mit A. rhizogenes infiziert, die einen binären Vektor tragen, der nach 7 Tagen Kallus und 14 Tage später Adventivwurzeln induzierte. Die erzeugte transgene Haarwurzel wurde durch morphologische Analyse und ein GFP-Reportergen identifiziert. Um den Anwendungsbereich dieses Systems weiter zu veranschaulichen, wurde CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) mit dieser Transformationsmethode in Taubenerbse transformiert. Die transgenen Pflanzen wurden mit Jasmonsäure (JA) bzw. Abscisinsäure (ABA) behandelt, um zu testen, ob CcCIPK14 auf diese Hormone anspricht. Die Ergebnisse zeigten, dass (1) exogene Hormone das Expressionsniveauvon CcCIPK14 signifikant hochregulieren können, insbesondere in Pflanzen mit CcCIPK14-Überexpression (OE); (2) der Gehalt an Genistein in den CcCIPK14-OE-Linien war signifikant höher als bei der Kontrolle; (3) Das Expressionsniveau von zwei nachgeschalteten Schlüsselgenen der Flavonoidsynthase, CcHIDH1 und CcHIDH2, wurde in den CcCIPK14-OE-Linien hochreguliert; und (4) das transgene System der Haarwurzel kann verwendet werden, um metabolisch funktionelle Gene in Nicht-Modellpflanzen zu untersuchen.

Einleitung

Die Transformation ist ein grundlegendes Instrument, um die Expression exogener Gene zu bewerten ^1,2. Viele biologische Aspekte von Ressourcenpflanzen sind allen Pflanzen gemeinsam; daher können funktionelle Studien bestimmter Gene an Modellpflanzen (wie z.B. Arabidopsis) durchgeführt ^werden3. Dennoch sind viele Gene in Pflanzen in ihren Funktions- und Expressionsmustern einzigartig und erfordern Studien an ihren eigenen oder eng verwandten Arten, insbesondere für Ressourcenpflanzen ^3,4. Pflanzenzellen können verschiedene Signale wahrnehmen, die es Pflanzen ermöglichen, spezifische Veränderungen der Genexpression, des Stoffwechsels und der Physiologie als Reaktion auf unterschiedliche Umweltstressbedingungen zu zeigen ^5,6,7. Flavonoide spielen eine entscheidende Rolle im Signalprozess von Pflanzen, der auf Umweltbelastungen reagiert ^5,8,9. Darüber hinaus ist der Flavonoidgehalt in Gartenbau- und Heilpflanzen auch ein wichtiger Indikator für die Qualitätsbewertung¹⁰. Die Identifizierung von Genen, die an der Regulation der Flavonoidsynthese als Reaktion auf externe Signale beteiligt sind, ist entscheidend für das Verständnis des Mechanismus der Flavonoidsynthese in Pflanzen. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Anwendung von exogenen Hormonen die Akkumulation von Flavonoiden fördern kann ^6,11. Ein stabiles Transformationssystem und eine Methode zur Validierung der Genfunktion sind unerlässlich, um die Funktion von Genen nachzuweisen und den Sekundärstoffwechsel in Pflanzen zu verstehen.

Die Agrobacterium-vermittelte Transformation wird häufig bei der DNA-Insertion eingesetzt ^5,8,9. Agrobacterium tumefacient kann Ringgene in die Chromosomen von Pflanzenzellen übertragen, und exogene Phytohormone induzieren einzelne oder wenige Wirtszellen, die Pflanzen regenerieren können, um stabile Transformanten zu erhalten 12,13,14. Agrobacterium tumefacient-vermittelte Transformationsmethoden sind eher für Pflanzenarten geeignet, die für eine In-vitro-Manipulation geeignet sind, während die meisten mehrjährigen Gehölze die Anwendung dieser Methode aufgrund ihrer Regenerationsschwierigkeit einschränken ^4,15. A. rhizogenes ist auch in der Lage, das Genom von Wirtszellen zu verändern¹⁶. In der vorliegenden Studie haben wir ein effizientes und stabiles A. rhizogenes-vermitteltes Transformationsverfahren entwickelt. A. rhizogenes enthält neben dem Ri-Plasmid ein zweites binäres Plasmid, das das nicht-natürliche Gen T-DNA trägt. Die Wirtspflanze wird infiziert, und es kann eine Korbblütlerin mit transgenen Haarwurzeln gewonnen werden, die aus dem Wildtyp-Spross hervorgehen^16,17. Die A. rhizogenes-vermittelten Transformationssysteme eignen sich aufgrund ihrer schnellen, kostengünstigen und nicht erforderlichen Pflanzenverjüngung für den Einsatz in der Gehölzforschung. Mehr als 160 Pflanzenarten haben erfolgreich behaarte Wurzeln hervorgerufen, und die meisten davon gehören zu den Nachtschattengewächsen, Compositae, Cruciferae, Winden, Doldenblütlern, Leguminosae, Caryophyllaceae und Polygonaceae^18,19. Im Vergleich zu A. tumefaciens zeigte A. rhizogenes eine höhere Effizienz bei der vermittelten Transformation von Taubenerbsen^17,20.

In dieser Studie wurde die Taubenerbse als Beispiel verwendet, um den durch A. rhizogenes vermittelten Transformationsprozess vorzustellen. Von der Inokulation bis zur Bewurzelung dauerten die Experimente 5 Wochen. Wir identifizierten die Transformation der Adventivwurzel durch die Morphologie und das GFP-Reportergen, und die Transformationseffizienz lag bei bis zu 75%. Außerdem behandelten wir die Composite-Pflanze mit JA und ABA sowie detektierten Transkripten und Sekundärmetaboliten mittels quantitativer Real-PCR und HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie). Es wurde bestätigt, dass das Expressionsniveau von CcCIPK14 nicht nur auf JA und ABA reagiert, sondern auch die Biosynthese von Flavonoiden beeinflusst. Dieses System ist ausreichend für die Untersuchung von Funktionsgenen, die mit dem Sekundärstoffwechsel assoziiert sind. Es bietet auch einen neuen Ansatz zur Untersuchung von Nicht-Modellpflanzen, die nicht über ein ausreichend stabiles Transformationssystem verfügen 17,21,22.

Protokoll

HINWEIS: Die Taubenerbse ist eine diploide Hülsenfrucht, die zur Familie der Fabaceae gehört. Die in diesem Experiment verwendeten Taubenerbsensamen stammen von der Northeast Forestry University in China und haben den Code 87119. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind in Abbildung 1A dargestellt. Die Inkubation des Sämlings wurde in einer Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit bei 25 °C unter Leuchtstofflampen bei 50 μmol Photonen pro ^{m-2 s-1} in einer 16-stündigen Photoperiode durchgeführt. A. rhizogenes Stämme K599 (NCPPB2659) wurden im Labor konserviert. Sie wurden in Hefe-Mannitol-Medium (YEP) mit 15% Glycerin bei -80 °C gelagert. Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll basiert auf dem Protokoll Meng et ^al.21.

ACHTUNG: Werfen Sie alle gentechnisch veränderten Bakterien und Pflanzen in den entsprechenden Abfallbehälter. Verwenden Sie alle gefährlichen Chemikalien in einem Abzug und entsorgen Sie sie im Sonderabfallbehälter.

1. Vorbereitung der Taubenerbsensetzlinge

1. Wählen Sie pralle und unbeschädigte Taubenerbsensamen (Abbildung 1A), die weniger als 1 Jahr gelagert wurden.
2. Weichen Sie die Samen 24 Stunden lang in destilliertem Wasser ein (Abbildung 1B). Füllen Sie die gequollenen Samen in eine Saatschale und stellen Sie sie in das Gewächshaus.
3. Die Samen beginnen nach 1-2 Tagen zu keimen. Wenn das Epikotyl 1,5 cm erreicht, pflanzen Sie die Sämlinge in 10 cm (Durchmesser) x 9 cm (Höhe) Töpfe um, die Erde und Sand in einem Volumenverhältnis von 3:1 enthalten.
   HINWEIS:Der Boden besteht aus einer Mischung aus nährstoffreicher Erde, Vermiculit und Perlit im Verhältnis 2:1:1.
4. Züchten Sie den Sämling in einem Gewächshaus.

2. Aktivierung von A. rhizogenes

HINWEIS: Der für die Umwandlung von A. rhizogenes verwendete Stamm war der bei -80 °C konservierte Stamm K599. Der binäre Vektor pROK2 (pBIN438; http://www.biovector.net/product/428388.html) enthält grün fluoreszierendes Protein (GFP) als Indikatorgen und ein Kanamycin-Resistenzgen als selektierbaren Marker zur Transformation von A. rhizogenes.

1. Tauen Sie A. rhizogenes auf Eis auf.
2. Tauchen Sie die Bakterien und verteilen Sie sie gleichmäßig auf Hefe-Mannitol-Medium (YEP), das mit 8 g/l Agar-Pulver, 25 mg/l Rifampicin und 25 mg/l Kanamycin (YRK, pH 7,0) ergänzt wird.
3. Bei 28 °C 16 h inkubieren.
4. Wählen Sie monoklonale Kolonien aus. Kultivieren Sie sie in einem 50-ml-Röhrchen mit 10 ml YEB-Medium, ergänzt mit 25 mg/l Rifampicin und 25 mg/l Kanamycin (YRK, pH 7,0). Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen für 16 h auf einen Schüttelinkubator mit einem Rotationsradius von 10 cm, bei 28 °C und 200 U/min.

3. Pflanzentransformation mit A. rhizogenes

HINWEIS: Wählen Sie gesunde Pflanzen aus, um A. rhizogenes mit dem folgenden Injektionsverfahren zu infizieren. Dieses Verfahren führt zu transformierten Haarwurzeln. Um die Genfunktion von CcCIPK14 zu analysieren, ist eine Kontrolle erforderlich. A. rhizogenes Lösungen mit leerem Vektor oder CcCIPK14-pROK2 Plasmiden wurden in Sämlinge injiziert, um behaarte Wurzeln zu induzieren.

1. A. rhizogenes impfen
   1. Wählen Sie Taubenerbsensetzlinge mit dem gleichen Wachstumsstatus.
   2. Entleeren Sie die Luft aus der 1-ml-Spritze und aspirieren Sie 0,3 mL Bakterienflüssigkeit. Drücken Sie langsam auf die Schubstange, um die Spritzennadel mit Bakterienflüssigkeit²¹ zu füllen.
   3. Fixieren Sie zuerst den Stiel des Taubenerbsensämlings mit einer Pinzette und stechen Sie dann die Spritzennadel in 1 cm Höhe in den Stiel.
   4. Tauchen Sie beim Herausziehen der Spritze die Nadelspitze vollständig in den Stiel ein. Schieben Sie die Schubstange langsam an, um die Bakterienflüssigkeit aus der eindringenden Wunde zu pumpen.
      HINWEIS: Das Anhaften von bakterieller Restflüssigkeit an der Wunde in Bakterientröpfchen kann die Infektions- und Transformationseffizienz verbessern.
2. Sämlings-Management
   HINWEIS: Hohe Temperaturen und Luftfeuchtigkeit können die Infektionseffizienz von A. rhizogenes verbessern.
   1. Legen Sie mit A. rhizogenes geimpfte Sämlinge in eine Schale (30 cm x 60 cm x 6 cm) mit 1 l Wasser. Verwenden Sie einen transparenten Kunststoffdeckel (30 cm x 60 cm x 30 cm) als Abdeckung, um die Temperatur und Luftfeuchtigkeit der Innenumgebung aufrechtzuerhalten.
   2. Entfernen Sie regelmäßig abgefallene Blätter und flockige Hyphen, die an den Blattspitzen und abgefallenen Blättern haften.
   3. Nach einer Woche beginnt die Hornhaut in der Wunde zu erscheinen. Halten Sie anschließend den Kunststoffdeckel halb geöffnet.
   4. Nach 4-5 Wochen differenzierte sich der größte Teil des Kallusgewebes in Adventivwurzeln. Entfernen Sie den Plastikdeckel.
   5. Geben Sie alle 3 Tage 1 l Wasser in die Schale, um die Erde feucht zu halten.
      HINWEIS: Die Taubenerbse ist eine trockenheitstolerante Pflanze; Zu viel Wasser kann das Pflanzenwachstum hemmen.

4. Identifizierung von transformierten Haarwurzeln

HINWEIS: Transformierte Haarwurzeln können anhand der Morphologie und des Genniveaus identifiziert werden. Dieses Verfahren konzentriert sich in erster Linie auf den Identifizierungsassay für Reportergene (GFP).

1. Sammeln Sie die Wurzelspitzen der behaarten Wurzel und markieren Sie den restlichen Teil.
2. Beurteilen Sie, ob unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop eine grüne Fluoreszenz vorhanden ist.
3. 0,1 g behaarte Wurzeln mit starkem Fluoreszenzsignal in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver verreiben.
4. Gemäß den Anweisungen des Herstellers des Pflanzengenom-DNA-Kits ist die genomische DNA von taubenerbsenunabhängigen transgenen Linien nach der Methode des modifizierten Cetyltrimethylammoniumbromids (CTAB) herzustellen²³.
5. Verwenden Sie 500 ng genomische DNA-Matrize und Primer für die PCR. Die Grundierungen sind in Tabelle 1 dargestellt.
6. Der folgende Amplifikationszyklus wird durchgeführt: Vordenaturierung bei 94 °C für 5 min, Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Glühen der Primer bei 55 °C für 30 s und Primerverlängerung bei 72 °C für 30 s. Nach 36 Zyklen und einer abschließenden Verlängerung von 10 min bei 72 °C analysieren Sie die amplifizierten Produkte auf einem 1%igen Agarose-Gel.
7. Färben Sie die Gele mit Nukleinsäurefärbung und visualisieren Sie sie unter UV-Licht.

5. Exogene Hormonbehandlung

HINWEIS: Die positiven Mischpflanzen wurden mit exogenen Hormonen behandelt, um die Wirkung von CcCIPK14 auf den Stoffwechsel zu untersuchen. Die durch A. rhizogenes induzierten Mischpflanzen wurden in drei Gruppen eingeteilt: JA-Behandlungsgruppe, ABA-Behandlungsgruppe und Kontrollgruppe (Abbildung 3A).

1. Reduzieren Sie die Bewässerung 3 Tage vor der exogenen Hormonbehandlung.
2. Bereiten Sie sowohl JA- als auch ABA-Lösungen in einer Konzentration von 5 mg/l vor.
   HINWEIS: Das JA- und ABA-Pulver wird zuerst in Ethylalkohol aufgelöst und dann bis zum Zielvolumen mit destilliertem Wasser gefüllt.
3. Sprühen Sie mit einer Sprühflasche JA- und ABA-Lösungen gleichmäßig auf die Blätter der Pflanzen. Behandeln Sie die Kontrollgruppe mit Wasser.
   HINWEIS: Auf jeden Sämling wurden durchschnittlich 10 ml Lösung gesprüht.
4. Sofort nach der Sprühbehandlung mit dem Kunststoffdeckel abdecken. Setzen Sie es wieder in das Gewächshaus mit künstlichem Klima ein.

6. Probenentnahme und -konservierung

HINWEIS: Nach 3 Stunden exogener Hormonbehandlung wurden Pflanzenmaterialien aus verschiedenen Behandlungsgruppen gesammelt.

1. Entfernen Sie gelbbraune und kontaminierte Haarwurzeln und wählen Sie solche mit weißem Aussehen. Sammeln Sie diese haarigen Wurzeln und trocknen Sie sie mit saugfähigem Papier ab.
2. Teile die behaarten Wurzeln, die du von jedem Sämling gesammelt hast, in zwei Teile. Legen Sie ein Teil in ein nummeriertes Reagenzglas und wickeln Sie es mit markierter Alufolie ein.
3. Lyophilisieren Sie die Alufolie in flüssigem Stickstoff und lagern Sie dann die gesamte geerntete Alufolie bei -80 °C für weitere Untersuchungen.

Ergebnisse

A. rhizogenes -vermittelte haarige Wurzeltransformation auf Taubenerbse
In dieser Studie wurden die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die genetische Transformation von Haarwurzeln beschrieben, die durch A. rhizogenes vermittelt wird, was im Bereich der Pflanzenmoleküle von Bedeutung ist. Es dauerte etwa 5 Wochen, bis aus den Wurzeln von Taubenerbsen, die mit A. rhizogenes infiziert waren, behaarte Wurzel...

Diskussion

Die schnelle Charakterisierung der Genfunktion ist das gemeinsame Ziel bei der Erforschung der meisten Arten und besonders wichtig für die Entwicklung von Ressourcenpflanzen. Die A. rhizogenes-vermittelte Transformation ist in der Haarwurzelkultur weit verbreitet. Die Haarwurzelkultur (HRC) spielt als einzigartige Quelle für die Metabolitenproduktion eine zentrale Rolle beim Metabolic Engineering^18,28. Die Anwendung d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mL qPCR 8-strip tube (with optical caps)	KIRGEN, Shanghai, China	KJ2541
ABA	Solarbio Life Science, Beijing, China	A8060
Agar powder	Solarbio Life Science, Beijing, China	A8190
Centrifuge	Osterode am Harz, Germany	d37520
CFX Connect TW Optics Module	Bio-rad, US	1855200
constant temperature incubator	Shanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, Shanghai,China	BPX-82
Diposable Petri dish	Corning, US
Dry Bath	Gingko Bioscience Company/Coyote bioscience, China	H2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50	Promega, Beijing, China	LS1030
Electronic balance	Tianjin, China	TD50020
Filter pape	Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, China
FiveEasy Plus	Mettler Toledo, Shanghai, China	30254105
Flowerpot 9*9	China
JA	Solarbio Life Science, Beijing, China	J8070
Kan	Solarbio Life Science, Beijing, China	K8020
MagicSYBR Mixture	CWBIO, Beijing, China	CW3008M
Mini Microcentrifuge	Scilogex, Beijing, China	S1010E
NaCl	Solarbio Life Science, Beijing, China	S8210
NanPhotometer N50 Touch	IMPLEN GMBH, Germany	T51082
Purelab untra
Rifampicin	Solarbio Life Science, Beijing, China	R8010
Seedling box 30*200	China
Thermal Cycler PCR	Bio-rad, US	T100
Thermostatic oscillator	Beijing donglian Har lnstrument Manufacture Co.,Ltd,China	DLHE-Q200
Tomy Autoclave	Tomy, Japan	SX-500
Tryptone	Solarbio Life Science, Beijing, China	LP0042
UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis( with dsDNase)	US Everbright INC, Jiangsu, China	R2028
Yeast Extract powder	Solarbio Life Science, Beijing, China	LP0021