CcCIPK14 Análise da função gênica para iluminar o sistema transgênico radicular eficiente

Resumo

Aqui apresentamos um sistema de transformação eficiente e estável para a análise funcional do gene CcCIPK14 como exemplo, fornecendo uma base técnica para o estudo do metabolismo de plantas não-modelo.

Resumo

Um sistema de transformação eficiente e estável é fundamental para o estudo da função gênica e melhoramento molecular de plantas. Aqui, descrevemos o uso de um sistema de transformação mediado por Agrobacterium rhizogenes em guandu. O caule está infectado com A. rhizogenes carregando um vetor binário, que induziu calos após 7 dias e raízes adventícias 14 dias depois. A raiz pilosa transgênica gerada foi identificada por análise morfológica e um gene repórter GFP. Para ilustrar ainda mais a faixa de aplicação deste sistema, CcCIPK14 (proteínas quinases de interação com proteínas semelhantes à calcineurina B) foi transformado em feijão bóer usando este método de transformação. As plantas transgênicas foram tratadas com ácido jasmônico (JA) e ácido abscísico (ABA), respectivamente, com o objetivo de testar se o CcCIPK14 responde a esses hormônios. Os resultados demonstraram que (1) hormônios exógenos podem regular significativamente o nívelde expressão de CcCIPK14, especialmente em plantas de superexpressão (OE) de CcCIPK14 ; (2) o teor de genisteína nas linhagens CcCIPK14-OE foi significativamente maior do que o controle; (3) o nível de expressão de dois genes-chave da flavonóide sintase a jusante, CcHIDH1 e CcHIDH2, foi regulado positivamente nas linhagens CcCIPK14-OE; e (4) o sistema transgênico de raiz pilosa pode ser usado para estudar genes metabolicamente funcionais em plantas não modelo.

Introdução

A transformação é uma ferramenta básica para avaliar a expressão de genes exógenos ^1,2. Muitos aspectos biológicos das plantas de recursos são comuns a todas as plantas; portanto, estudos funcionais de certos genes podem ser realizados em plantas modelo (como Arabidopsis)³. No entanto, muitos genes em plantas são únicos em sua função e padrões de expressão, exigindo estudos em espécies próprias ou intimamente relacionadas, especialmente para plantas de recursos ^3,4. As células vegetais podem detectar vários sinais que permitem que as plantas mostrem mudanças específicas na expressão gênica, metabolismo e fisiologia em resposta a diferentes condições de estresse ambiental ^5,6,7. Os flavonóides são atores cruciais no processo de sinalização das plantas que responde a estresses ambientais ^5,8,9. Além disso, o teor de flavonóides em plantas hortícolas e medicinais também é um indicador importante para a avaliação da qualidade¹⁰. A identificação de genes envolvidos na regulação da síntese de flavonoides em resposta a sinais externos é crucial para a compreensão do mecanismo de síntese de flavonoides em plantas. Vários estudos têm revelado que a aplicação de hormônios exógenos pode promover o acúmulo de flavonoides ^6,11. Um sistema de transformação estável e um método de validação da função gênica são essenciais para demonstrar a função dos genes e entender o metabolismo secundário nas plantas.

A transformação mediada por agrobactérias é amplamente utilizada na inserção de DNA ^5,8,9. Agrobacterium tumefacient pode transferir genes de anel para os cromossomos das células vegetais, e os fitohormônios exógenos induzem uma ou poucas células hospedeiras que podem regenerar plantas para obter transformantes estáveis 12,13,14. Os métodos de transformação mediados por Agrobacterium tumefacient são mais aplicáveis a espécies vegetais adequadas para manipulação in vitro, enquanto a maioria das plantas lenhosas perenes limita a aplicação desse método devido à sua dificuldade de regeneração ^4,15. A. rhizogenes também é capaz de modificar o genoma das células hospedeiras¹⁶. No presente estudo, desenvolvemos um procedimento de transformação mediado por A. rhizogenes eficiente e estável. A. rhizogenes contém um segundo plasmídeo binário carregando o gene T-DNA não natural, além do plasmídeo Ri. A planta hospedeira está infectada e uma planta composta pode ser obtida com raízes peludas transgênicas emergindo do broto do tipo selvagem^16,17. Os sistemas de transformação mediados por A. rhizogenes são adequados para aplicação em pesquisas com plantas lenhosas devido à sua regeneração de plantas rápida, de baixo custo e não necessária. Mais de 160 tipos de plantas induziram com sucesso raízes peludas, e a maioria das quais está em Solanaceae, Compositae, Cruciferae, Convolvulaceae, Umbelliferae, Leguminosae, Caryophyllaceae e Polygonaceae^18,19. Em comparação com A. tumefaciens, A. rhizogenes apresentou maior eficiência na transformação mediada do guandu^17,20.

Neste estudo, o guandu foi utilizado como exemplo para introduzir o processo de transformação mediado por A. rhizogenes. Da inoculação ao enraizamento, os experimentos tiveram duração de 5 semanas. Identificamos a transformação da raiz adventícia por meio da morfologia e do gene repórter GFP, e a eficiência de transformação foi de até 75%. Além disso, tratamos a planta composta com JA e ABA, bem como detectamos transcritos e metabólitos secundários por PCR real quantitativo e HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência). Confirma-se que o nível de expressão de CcCIPK14 responde não apenas a JA e ABA, mas também afeta a biossíntese de flavonóides. Este sistema é adequado para estudar genes de função associados ao metabolismo secundário. Também fornece uma nova abordagem para estudar plantas não modelo na falta de um sistema de transformação estável suficiente 17,21,22.

Protocolo

NOTA: O feijão bóer é uma leguminosa diplóide que pertence à família Fabaceae. As sementes de feijão bóer usadas neste experimento são da Universidade Florestal do Nordeste da China e são codificadas como 87119. As etapas principais deste protocolo são ilustradas na Figura 1A. A incubação das mudas foi realizada em ambiente de alta umidade a 25 °C sob luz fluorescente a 50 μmol fótons por ^{m-2 s-1} em fotoperíodo de 16 h. As cepas K599 (NCPPB2659) de A. rhizogenes foram preservadas em laboratório. Eles foram armazenados em meio manitol de levedura (YEP) com glicerol a 15% a -80 °C. O protocolo descrito neste trabalho foi baseado no protocolo de Meng et ^al.21.

CUIDADO: Deposite todas as bactérias e plantas geneticamente modificadas no recipiente de lixo apropriado. Use todos os produtos químicos perigosos em uma capela e descarte-os no recipiente de resíduos perigosos.

1. Preparação de mudas de feijão bóer

1. Escolha sementes de feijão bóer rechonchudas e não danificadas (Figura 1A) que tenham sido armazenadas por menos de 1 ano.
2. Mergulhe as sementes em água destilada por 24 h (Figura 1B). Transfira as sementes inchadas para uma bandeja de sementes e coloque-as na estufa.
3. As sementes começam a germinar após 1-2 dias. Quando o epicótilo atingir 1,5 cm, transplante as mudas para vasos de 10 cm (diâmetro) x 9 cm (altura) contendo terra e areia em uma proporção de volume de 3:1.
   NOTA: O solo consiste em uma mistura de solo nutritivo, vermiculita e perlita na proporção de 2:1:1.
4. Cultive a muda em uma estufa.

2. Ativação de A. rhizogenes

NOTA: A cepa usada para a transformação de A. rhizogenes foi a K599 preservada a -80 ° C. O vetor binário pROK2 (pBIN438; http://www.biovector.net/product/428388.html) contém proteína fluorescente verde (GFP) como um gene indicador e um gene de resistência à canamicina como um marcador selecionável para transformar A. rhizogenes.

1. Descongele A. rhizogenes no gelo.
2. Mergulhe as bactérias e alinhe-as uniformemente em meio de manitol de levedura (YEP) suplementado com 8 g/L de ágar pó, 25 mg/L de rifampicina e 25 mg/L de canamicina (YRK, pH 7,0).
3. Incubar a 28 °C durante 16 h.
4. Selecione colônias monoclonais. Cultive-os em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de meio YEB suplementado com 25 mg/L de rifampicina e 25 mg/L de canamicina (YRK, pH 7,0). Colocar o tubo de centrifugação numa incubadora agitável com um raio de rotação de 10 cm, a 28 °C e 200 rpm durante 16 h.

3. Transformação de plantas usando A. rhizogenes

NOTA: Selecione plantas saudáveis para infectar A. rhizogenes usando o seguinte procedimento de injeção. Este procedimento resulta em raízes pilosas transformadas. Para analisar a função gênica do CcCIPK14, é necessário um controle. Soluções de A. rhizogenes com vetor vazio ou plasmídeos CcCIPK14-pROK2 foram injetadas em plântulas para induzir raízes pilosas.

1. Inocular A. rhizogenes
   1. Escolha mudas de feijão bóer com o mesmo status de crescimento.
   2. Esvazie o ar da seringa de 1 mL e aspire 0,3 mL de líquido bacteriano. Empurre lentamente a haste para encher a agulha da seringa com líquido bacteriano²¹.
   3. Primeiro fixe o caule da muda de feijão bóer com uma pinça e, em seguida, pique a agulha da seringa no caule a 1 cm.
   4. Ao retirar a seringa, mergulhe completamente a ponta da agulha na haste. Empurre lentamente a haste para bombear o líquido bacteriano para fora da ferida penetrante.
      NOTA: A fixação de líquido bacteriano residual à ferida em gotículas de bactérias pode melhorar a eficiência da infecção e da transformação.
2. Manejo de mudas
   NOTA: Alta temperatura e umidade podem melhorar a eficiência da infecção de A. rhizogenes.
   1. Coloque as mudas inoculadas com A. rhizogenes em uma bandeja (30 cm x 60 cm x 6 cm) com 1 L de água. Use uma tampa de plástico transparente (30 cm x 60 cm x 30 cm) como cobertura para manter a temperatura e a umidade do ambiente interno.
   2. Remova periodicamente as folhas caídas e hifas floculantes presas às pontas das folhas e folhas caídas.
   3. Depois de uma semana, o calo começa a aparecer na ferida. Em seguida, mantenha a tampa de plástico entreaberta.
   4. Após 4-5 semanas, a maior parte do tecido caloso se diferenciou em raízes adventícias. Remova a tampa de plástico.
   5. Adicione 1 L de água à bandeja a cada 3 dias para manter o solo úmido.
      NOTA: O feijão bóer é uma planta tolerante à seca; Muita água pode inibir o crescimento das plantas.

4. Identificação de raízes pilosas transformadas

NOTA: As raízes pilosas transformadas podem ser identificadas com base na morfologia e no nível do gene. Este procedimento se concentra principalmente no ensaio de identificação do gene repórter (GFP).

1. Colete as pontas da raiz peluda e marque a parte restante.
2. Avalie se há fluorescência verde sob um microscópio confocal de varredura a laser.
3. Triturar 0,1 g de raízes peludas com forte sinal de fluorescência em pó fino em nitrogênio líquido.
4. De acordo com as instruções do fabricante do kit de DNA genômico vegetal, prepare o DNA genômico de linhagens transgênicas independentes de feijão bóer pelo método de brometo de cetiltrimetilamônio modificado (CTAB)²³.
5. Use 500 ng de molde de DNA genômico e primers para PCR. Os primers são mostrados na Tabela 1.
6. Execute o seguinte ciclo de amplificação: pré-desnaturação a 94 ° C por 5 min, desnaturação a 94 ° C por 30 s, recozimento de primers a 55 ° C por 30 s e extensão do primer a 72 ° C por 30 s. Após 36 ciclos e uma extensão final de 10 min a 72 °C, analise os produtos amplificados em gel de agarose a 1%.
7. Pinte os géis com coloração de ácido nucleico e visualize-os sob luz ultravioleta.

5. Tratamento hormonal exógeno

NOTA: As plantas compostas positivas foram tratadas com hormônios exógenos para estudar o efeito do CcCIPK14 no metabolismo. As plantas compostas induzidas por A. rhizogenes foram divididas em três grupos: grupo de tratamento JA, grupo de tratamento ABA e grupo controle (Figura 3A).

1. Reduza a rega 3 dias antes do tratamento com hormônios exógenos.
2. Preparar as soluções JA e ABA a uma concentração de 5 mg/l.
   NOTA: O pó JA e ABA é primeiro dissolvido em álcool etílico e, em seguida, enchido até o volume alvo com água destilada.
3. Usando um borrifador, borrife as soluções JA e ABA uniformemente nas folhas das plantas. Trate o grupo de controle com água.
   NOTA: Uma média de 10 mL de solução foi pulverizada em cada muda.
4. Cubra com a tampa de plástico imediatamente após o tratamento de pulverização. Coloque-o de volta na estufa de clima artificial.

6. Coleta e preservação de amostras

NOTA: Após 3 h de tratamento com hormônio exógeno, foram coletados materiais vegetais de diferentes grupos de tratamento.

1. Remova as raízes peludas fulvas e contaminadas e selecione aquelas com aparência branca. Colete essas raízes peludas e seque-as com papel absorvente.
2. Divida as raízes peludas coletadas de cada muda em duas partes. Coloque uma peça em um tubo de ensaio numerado e embrulhe-o usando papel alumínio marcado.
3. Liofilize o papel alumínio em nitrogênio líquido e, em seguida, armazene todo o papel alumínio colhido a -80 °C para uma investigação mais aprofundada.

Resultados

Transformação de raiz peluda mediada por A. rhizogenes em guandu
Este estudo descreveu os protocolos passo a passo para a transformação genética de raízes pilosas mediadas por A. rhizogenes, que tem significado no campo das moléculas vegetais. Demorou cerca de 5 semanas para obter raízes peludas das raízes do feijão bóer infectado por A. rhizogenes. A Figura 1A mostr...

Discussão

A rápida caracterização da função gênica é o objetivo comum no estudo da maioria das espécies e é particularmente importante para o desenvolvimento de plantas de recursos. A transformação mediada por A. rhizogenes tem sido amplamente utilizada na cultura de raízes pilosas. A cultura de raízes pilosas (HRC), como fonte única de produção de metabólitos, desempenha um papel fundamental na engenharia metabólica^18,28

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mL qPCR 8-strip tube (with optical caps)	KIRGEN, Shanghai, China	KJ2541
ABA	Solarbio Life Science, Beijing, China	A8060
Agar powder	Solarbio Life Science, Beijing, China	A8190
Centrifuge	Osterode am Harz, Germany	d37520
CFX Connect TW Optics Module	Bio-rad, US	1855200
constant temperature incubator	Shanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, Shanghai,China	BPX-82
Diposable Petri dish	Corning, US
Dry Bath	Gingko Bioscience Company/Coyote bioscience, China	H2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50	Promega, Beijing, China	LS1030
Electronic balance	Tianjin, China	TD50020
Filter pape	Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, China
FiveEasy Plus	Mettler Toledo, Shanghai, China	30254105
Flowerpot 9*9	China
JA	Solarbio Life Science, Beijing, China	J8070
Kan	Solarbio Life Science, Beijing, China	K8020
MagicSYBR Mixture	CWBIO, Beijing, China	CW3008M
Mini Microcentrifuge	Scilogex, Beijing, China	S1010E
NaCl	Solarbio Life Science, Beijing, China	S8210
NanPhotometer N50 Touch	IMPLEN GMBH, Germany	T51082
Purelab untra
Rifampicin	Solarbio Life Science, Beijing, China	R8010
Seedling box 30*200	China
Thermal Cycler PCR	Bio-rad, US	T100
Thermostatic oscillator	Beijing donglian Har lnstrument Manufacture Co.,Ltd,China	DLHE-Q200
Tomy Autoclave	Tomy, Japan	SX-500
Tryptone	Solarbio Life Science, Beijing, China	LP0042
UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis( with dsDNase)	US Everbright INC, Jiangsu, China	R2028
Yeast Extract powder	Solarbio Life Science, Beijing, China	LP0021