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要約

ここでは、CcCIPK14遺伝子の機能解析のための効率的で安定した形質転換システムを例に紹介し、非モデル植物の代謝を研究するための技術的基盤を提供します。

要約

効率的で安定した形質転換システムは、遺伝子機能研究や植物の分子育種の基本です。ここでは、ハトエンドウに対するAgrobacterium rhizogenes媒介形質転換システムの使用について説明します。茎は二元ベクトルを持つA.rhizogenesに感染しており、7日後にカルスを誘導し、14日後に不定根を誘導しました。生成されたトランスジェニック毛根は、形態学的解析とGFPレポーター遺伝子によって同定されました。このシステムの適用範囲をさらに示すために、この形質転換法を使用してCcCIPK14(カルシニューリンB様タンパク質相互作用プロテインキナーゼ)をピジョンピーに形質転換しました。トランスジェニック植物は、CcCIPK14がこれらのホルモンに反応するかどうかをテストする目的で、それぞれジャスモン酸(JA)とアブシジン酸(ABA)で処理されました。その結果、(1)外因性ホルモンは、特にCcCIPK14過剰発現(OE)植物において、CcCIPK14の発現レベルを大幅にアップレギュレートできることが示されました。(2)CcCIPK14-OE株のゲニステイン含有量は、対照群よりも有意に高かった。(3)2つの下流の主要なフラボノイド合成酵素遺伝子、CcHIDH1およびCcHIDH2の発現レベルは、CcCIPK14-OE系統でアップレギュレーションされました。(4)毛根トランスジェニックシステムを使用して、非モデル植物の代謝機能遺伝子を研究することができます。

概要

形質転換は、外因性遺伝子の発現を評価するための基本的なツールです1,2。資源植物の多くの生物学的側面は、すべての植物に共通しています。したがって、特定の遺伝子の機能研究は、モデル植物(シロイヌナズナなど)で実施できます3。しかし、植物の多くの遺伝子は、その機能と発現パターンが独特であり、特に資源植物については、それら自身または近縁種での研究が必要である3,4。植物細胞は、さまざまな環境ストレス条件に応答して、植物が遺伝子発現、代謝、および生理学の特定の変化を示すことを可能にするさまざまなシグナルを感知できます5,6,7。フラボノイドは、環境ストレス5,8,9に応答する植物のシグナル伝達プロセスにおいて重要なプレーヤーです。さらに、園芸用および薬用植物のフラボノイド含有量も品質評価の重要な指標です10。外部シグナルに応答したフラボノイド合成の制御に関与する遺伝子の同定は、植物におけるフラボノイド合成のメカニズムを理解するために重要です。いくつかの研究は、外因性ホルモンの適用がフラボノイドの蓄積を促進することができることを明らかにしました6,11。植物の遺伝子の機能を実証し、二次代謝を理解するためには、安定した形質転換システムと遺伝子機能検証法が不可欠です。

アグロバクテリウム媒介形質転換は、DNA挿入に広く使用されています5,8,9。Agrobacterium tumefacientは、リング遺伝子を植物細胞の染色体に導入することができ、外因性植物ホルモンは、植物を再生できる単一または少数の宿主細胞を誘導して、安定した形質転換体を得ることができる12,13,14。Agrobacterium tumefacientを介した形質転換法は、in vitro操作に適した植物種により適用可能ですが、ほとんどの多年生木本植物は、再生が困難であるため、この方法の適用を制限しています4,15。A. rhizogenesは、宿主細胞のゲノムを改変することもできる16。本研究では、効率的で安定したA. rhizogenesを介した形質転換手順を開発しました。A. rhizogenesは、Riプラスミドに加えて、非天然遺伝子T-DNAを運ぶ第2のバイナリプラスミドを含んでいます。宿主植物は感染しており、野生型シュート16,17から出現するトランスジェニック毛状根を有する複合植物を得ることができる。A. rhizogenes媒介形質転換システムは、その迅速で低コストで植物の再生が不要なため、木本植物研究への応用に適しています。160種類以上の植物が毛深い根を成功裏に誘発しており、そのほとんどはナス科、キク科、アブラナ科、コンボルブレー科、ウンベリフェラエ、マメ科、カリオフィラ科、およびタデ科18,19にあります。A. tumefaciensと比較して、A. rhizogenesはハトエンドウの媒介形質転換においてより高い効率を示した17,20。

本研究では、キマメを例に、A. rhizogenesが媒介する形質転換プロセスを紹介しました。接種から発根まで、実験は5週間続きました。形態学とGFPレポーター遺伝子を通じて外来根の形質転換を同定し、形質転換効率は75%と高かった。また、複合プラントをJAとABAで処理したほか、定量的リアルPCRとHPLC(高速液体クロマトグラフィー)により転写産物と二次代謝物を検出しました。CcCIPK14の発現レベルは、JAやABAだけでなく、フラボノイドの生合成にも影響を与えることが確認されています。このシステムは、二次代謝に関連する機能遺伝子の研究に適しています。また、十分な安定な形質転換システム17,21,22を欠く非モデル植物を研究するための新しいアプローチも提供する。

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プロトコル

注:ハトエンドウは、 マメ科に属する二倍体のマメ科作物です。この実験で使用されたハトマメの種子は、中国の東北林業大学のもので、コード化されています 87119。このプロトコルの主な手順を 図 1A に示します。苗のインキュベーションは、16時間の光周期でm-2 s-1 あたり50μmolの光子の蛍光灯の下で、25°Cの高湿度環境で行われました。 A. rhizogenes 株K599(NCPPB2659)は実験室で保存されました。それらは、-80°Cで15%グリセロールを含む酵母マンニトール培地(YEP)で保存されました。 この研究に記載されているプロトコルは、プロトコルMengら21に基づいていました。

注意: すべての遺伝子組み換え細菌と植物を適切な廃棄物容器に入れます。すべての有害化学物質をドラフトで使用し、有害廃棄物容器に廃棄してください。

1.キマメの苗の準備

  1. 1年未満で保存されているふっくらとした損傷のないキマメの種子(図1A)を選択してください。
  2. 種子を蒸留水に24時間浸します(図1B)。膨らんだ種子をシードトレイに移し、温室に置きます。
  3. 種子は1〜2日後に発芽し始めます。エピコチルが1.5 cmに達したら、苗を土と砂が入った10 cm(直径)x 9 cm(高さ)の鉢に3:1の体積比で移植します。
    注:土壌は、栄養価の高い土壌、バーミキュライト、パーライトを2:1:1の比率で混合したものです。
  4. 温室で苗を育てます。

2. A. rhizogenesの活性化

注:A. rhizogenes形質転換に使用した菌株は、-80°Cで保存されたK599でした。 バイナリベクトルpROK2(pBIN438;http://www.biovector.net/product/428388.html)は、指示遺伝子として緑色蛍光タンパク質(GFP)を含み、A. rhizogenesを形質転換するための選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含んでいます。

  1. 氷の上で A.rhizogenesを 解凍します。
  2. 細菌を浸し、8 g / Lの寒天粉末、25 mg / Lのリファンピシン、および25 mg / Lのカナマイシン(YRK、pH 7.0)を補充した酵母マンニトール培地(YEP)に均等に並べます。.
  3. 28°Cで16時間インキュベートします。
  4. モノクローナルコロニーを選択します。10 mLのYESB培地に25 mg/Lのリファンピシンと25 mg/Lのカナマイシン(YRK、pH 7.0)を添加した50 mLチューブで培養します。遠心分離チューブを、回転半径10cm、28°C、200rpmで16時間、振とうするインキュベーターに置きます。

3. A. rhizogenesを用いた植物の形質転換

注:次の注射手順を使用して 、A.rhizogenes に感染する健康な植物を選択してください。この手順により、毛深い根が変形します。 CcCIPK14の遺伝子機能を解析するためには、コントロールが必要です。 A. rhizogenes 溶液とエンプティベクターまたはCcCIPK14-pROK2プラスミドを苗に注入し、毛根を誘導しました。

  1. A. rhizogenesに接種します
    1. 同じ成長状態のハトエンドウの苗を選んでください。
    2. 1 mLシリンジから空気を空にし、0.3 mLの細菌液を吸引します。.プッシュロッドをゆっくりと押して、シリンジ針に細菌液21を充填します。
    3. まず、ハトエンドウの苗の茎をピンセットで固定し、次にシリンジの針を茎に1cmで刺します。
    4. シリンジを引き抜くときは、針先をステムに完全に浸してください。プッシュロッドをゆっくりと押して、浸透した傷口から細菌の液体を送り出します。
      注:細菌飛沫の創傷に残留細菌液が付着すると、感染効率と形質転換効率が向上する可能性があります。
  2. 苗の管理
    注:高温多湿は 、A. rhizogenesの感染効率を向上させることができます。
    1. A. rhizogenesを接種した苗をトレイ(30 cm x 60 cm x 6 cm)に1 Lの水を入れます。透明なプラスチック製の蓋(30cm×60cm×30cm)をカバーとして使用し、内部環境の温度と湿度を維持します。
    2. 落ち葉や葉先や落ち葉に付着した凝集菌糸は定期的に取り除きます。
    3. 一週間後、カルスが傷口に現れ始めます。その後、プラスチック製の蓋を半分開いたままにします。
    4. 4〜5週間後、カルス組織の大部分が不定根に分化しました。プラスチック製の蓋を取り外します。
    5. 3日ごとにトレイに1Lの水を加えて、土壌を湿らせます。
      注:ハトエンドウは干ばつに強い植物です。水が多すぎると、植物の成長が阻害される可能性があります。

4. 形質転換した毛根の同定

注:形質転換された毛根は、形態と遺伝子レベルに基づいて識別できます。この手順は、主にレポーター遺伝子(GFP)同定アッセイに焦点を当てています。

  1. 毛深い根の根元を集め、残りの部分に印を付けます。
  2. 共焦点レーザー走査型顕微鏡で緑色蛍光があるかどうかを評価します。
  3. 強い蛍光シグナルを持つ毛むくじゃらの根0.1gを液体窒素中の微粉末に三倍します。
  4. 植物ゲノムDNAキットの製造者の指示に従って、改変臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)法23により、ハトエンドウ非依存性トランスジェニック系統のゲノムDNAを調製する。
  5. PCRには、500 ngのゲノムDNAテンプレートとプライマーを使用してください。プライマーを 表1に示します。
  6. 次の増幅サイクルを実行します:94°Cで5分間の予備変性、94°Cで30秒間の変性、55°Cで30秒間のプライマーのアニール、および72°Cで30秒間のプライマー伸長。36サイクル後、72°Cで10分間の最終延長後、増幅した生成物を1%アガロースゲルで分析します。
  7. 核酸染色でゲルを染色し、UV光下で可視化します。

5.外因性ホルモン治療

注:陽性の複合植物は、代謝に対するCcCIPK14の効果を研究するために外因性ホルモンで処理されました。 A. rhizogenes によって誘導された合成植物は、JA処理群、ABA処理群、および対照群の3つのグループに分けられました(図3A)。

  1. 外因性ホルモン治療の3日前に水やりを減らします。
  2. JA溶液とABA溶液の両方を5 mg / Lの濃度で調製します。
    注:JAおよびABA粉末は、最初にエチルアルコールに溶解され、次に蒸留水で目標容量まで充填されます。
  3. スプレーボトルを使用して、JA溶液とABA溶液を植物の葉に均一にスプレーします。対照群を水で処理します。
    注:平均10mLの溶液を各苗に噴霧しました。
  4. スプレー処理直後はプラスチックフタで覆います。人工気候温室に戻します。

6.サンプルの収集と保存

注:外因性ホルモン処理の3時間後、異なる処理群から植物材料が収集されました。

  1. 黄褐色で汚染された毛むくじゃらの根を取り除き、白い外観のものを選択します。これらの毛むくじゃらの根を集め、吸収紙で乾かします。
  2. 各苗から集めた毛むくじゃらの根を2つの部分に分けます。1つの部品を番号付きの試験管に入れ、マークされたティンフォイルで包みます。
  3. スズホイルを液体窒素で凍結乾燥し、収穫したすべてのスズホイルを-80°Cで保存して、さらに調査します。

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結果

A. rhizogenes -キマメの毛むくじゃらの根形質転換を媒介
この研究では、植物分子の分野で重要な意味を持つ、A. rhizogenesによって媒介される毛根の遺伝的形質転換のための段階的なプロトコルについて説明しました。 A. rhizogenesに感染したハトマメの根から毛むくじゃらの根を得るのに約5週間かかりました。...

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ディスカッション

遺伝子機能の迅速な特性評価は、ほとんどの種の研究における共通の目標であり、特に資源植物の開発にとって重要です。A. rhizogenesを介した形質転換は、毛根培養で広く使用されています。毛根培養(HRC)は、代謝産物産生のユニークな供給源として、代謝工学において極めて重要な役割を果たしています18,28。この?...

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開示事項

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある既知の競合する金銭的利益や個人的な関係がないことを宣言します。

謝辞

著者らは、中国国家自然科学基金会(31800509年、31922058年)、北京林業大学の優秀若手人材基金(2019JQ03009)、中央大学基礎研究基金(2021ZY16)、北京市自然科学基金会(6212023)、中国国家重点研究開発プログラム(2018YFD1000602,2019YFD1000605-1)、および分子設計による樹木育種のための北京先端イノベーションセンターからの財政的支援に感謝します。記事の執筆に当たって指導してくださったZhengyang Hou氏と、記事のアイデアについて指導してくださったMeng Dong教授に感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 mL qPCR 8-strip tube (with optical caps)KIRGEN, Shanghai, ChinaKJ2541
ABASolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8060
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
CentrifugeOsterode am Harz, Germanyd37520
CFX Connect TW Optics ModuleBio-rad, US1855200
constant temperature incubatorShanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, Shanghai,ChinaBPX-82
Diposable Petri dishCorning, US
Dry BathGingko Bioscience Company/Coyote bioscience, ChinaH2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50Promega, Beijing, ChinaLS1030
Electronic balanceTianjin, ChinaTD50020
Filter papeHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, China
FiveEasy PlusMettler Toledo, Shanghai, China30254105
Flowerpot 9*9China
JASolarbio Life Science, Beijing, ChinaJ8070
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020
MagicSYBR MixtureCWBIO, Beijing, ChinaCW3008M
Mini MicrocentrifugeScilogex, Beijing, ChinaS1010E
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
NanPhotometer N50 TouchIMPLEN GMBH, GermanyT51082
Purelab untra
RifampicinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010
Seedling box 30*200China
Thermal Cycler PCRBio-rad, UST100
Thermostatic oscillatorBeijing donglian Har lnstrument Manufacture Co.,Ltd,ChinaDLHE-Q200
Tomy AutoclaveTomy, JapanSX-500
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis( with dsDNase)US Everbright INC, Jiangsu, ChinaR2028
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

参考文献

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