Uso de nanopartículas lipídicas para la administración de ARNm modificado químicamente en células de mamíferos

Resumen

El protocolo presenta la transcripción in vitro (IVT) de ARNm modificado químicamente, la preparación de liposomas catiónicos y el análisis funcional de transfecciones de ARNm habilitadas para liposomas en células de mamíferos.

Resumen

En los últimos años, el ARN mensajero modificado químicamente (ARNm) se ha convertido en una potente molécula de ácido nucleico para desarrollar una amplia gama de aplicaciones terapéuticas, incluida una nueva clase de vacunas, terapias de reemplazo de proteínas y terapias inmunitarias. Entre los vectores de administración, se ha descubierto que las nanopartículas lipídicas son más seguras y eficaces para administrar moléculas de ARN (por ejemplo, siRNA, miRNA, mRNA) y algunos productos ya están en uso clínico. Para demostrar la entrega de ARNm mediada por nanopartículas lipídicas, presentamos un protocolo optimizado para la síntesis de ARNm eGFP modificado con me1Ψ-UTP funcional, la preparación de liposomas catiónicos, la formación de complejos electrostáticos de ARNm con liposomas catiónicos y la evaluación de la eficiencia de la transfección en células de mamíferos. Los resultados demuestran que estas modificaciones mejoraron eficientemente la estabilidad del ARNm cuando se administró con liposomas catiónicos y aumentaron la eficiencia de traducción del ARNm de eGFP y la estabilidad en células de mamíferos. Este protocolo se puede utilizar para sintetizar el ARNm deseado y transfectarlo con liposomas catiónicos para la expresión génica diana en células de mamíferos.

Introducción

Como molécula terapéutica, el ARNm ofrece varias ventajas debido a su naturaleza no integrativa y su capacidad para transfectar células no mitóticas en comparación con el ADN plasmídico (ADNp)¹. Aunque la administración de ARNm se demostró a principios de la década de 1990, las aplicaciones terapéuticas fueron limitadas debido a su falta de estabilidad, su falta de activación inmune y su escasa eficiencia traslacional². Las modificaciones químicas recientemente identificadas, como la pseudouridina 5'-trifosfato (Ψ-UTP) y la metilpseudouridina 5'-trifosfato (me1Ψ-UTP) en el ARNm, ayudaron a superar estas limitaciones, revolucionaron la investigación del ARNm y, a su vez, convirtieron al ARNm en una herramienta prometedora tanto en la investigación básica como en la aplicada. La gama de aplicaciones abarca desde la generación de iPSCs hasta la vacunación y la terapia génica ^3,4.

Paralelamente a los avances en la tecnología de ARNm, los avances significativos en los sistemas de administración no viral hicieron que la administración de ARNm fuera efectiva, lo que hace que esta tecnología sea factible para múltiples aplicaciones terapéuticas⁵. Entre los vectores no virales, se ha descubierto que las nanopartículas lipídicas son efectivas en la entrega de ácidos nucleicos ^6,7. Recientemente, Alnylam ha recibido la aprobación de la FDA de fármacos siRNA basados en lípidos para el tratamiento de enfermedades hepáticas, incluyendo Patisiran para la amiloidosis hereditaria mediada por transtiretina (amiloidosis hATTR) y Givosiran para las porfirias hepáticas agudas (AHP)⁸. Durante la pandemia de COVID19, las vacunas basadas en ARNm encapsuladas en lípidos de Pfizer-BioNtech y Moderna demostraron su eficacia y recibieron las aprobaciones de la FDA ^9,10. Por lo tanto, la administración de ARNm habilitada por lípidos tiene un gran potencial terapéutico.

Aquí, describimos un protocolo detallado para la producción de ARNm eGFP transcrito in vitro modificado químicamente, preparación de liposomas catiónicos, optimización del complejo ARNm-lípidos y transfecciones en células de mamíferos (Figura 1).

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Protocolo

1. Producción de ARNm modificado con me1 Ψ-UTP

1. Preparación de plantillas de ADN con transcripción in vitro (IVT)
   NOTA: Para la preparación de la plantilla de ADN IVT (promotor T7-marco de lectura abierto (ORF) del gen), diseñe un conjunto de cebadores específicos del gen para el gen de interés. Agregue la secuencia del promotor T7 (5'-NNNNNNTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3') antes del cebador directo específico del gen.
   1. Prepare la mezcla de reacción de PCR como se describe en la Tabla 1.
      NOTA: Ejecute al menos cuatro reacciones de PCR para aumentar la concentración y la calidad de la plantilla de ADN de IVT para IVT.
   2. Mezcle completamente la mezcla de reacción con una micropipeta y centrifuga con un microfuge.
   3. Ejecute el protocolo de ciclo de PCR que se indica en la Tabla 2 en un termociclador.
2. Purificación de la plantilla de ADN IVT por extracción orgánica/precipitación de etanol
   1. Ajuste la mezcla de reacción de PCR amplificada a 200 μL en total utilizando agua tratada con DEPC en un tubo de microfuga de 1,5 mL (sin nucleasa).
   2. Añadir 200 μL de fenol/cloroformo saturado de TE, pH 8,0. Vórtice vigorosamente durante 10 segundos.
   3. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos para separar las fases y transferir la fase superior acuosa (aproximadamente 200 μL) a un nuevo tubo de microfuga de 1,5 mL.
   4. Agregue 1/10⁽ 20 μL) de volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5,5 y dos volúmenes (400 μL) de etanol al 99-100%. Mezclar bien e incubar durante al menos 30 minutos a -20 °C.
   5. Granular la plantilla de ADN por centrifugación a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C.
   6. Retire completamente el sobrenadante sin alterar el pellet con una micropipeta.
   7. Agregue 0,5 mL de etanol al 75% al pellet e invierta de 5 a 10 veces.
   8. Centrifugar durante 2 minutos a 12.000 x g a 4 °C. A continuación, retire el etanol por completo con una pipeta sin alterar el DNApellet.
   9. Deje que el pellet se seque a temperatura ambiente hasta que el pellet se vuelva un poco translúcido.
   10. Añadir 20 μL de agua sin nucleasas y volver a suspender durante unos segundos.
3. Control de calidad para la plantilla de ADN IVT purificada
   1. Cuantificación
      1. Mida la concentración y la calidad de la plantilla de ADN IVT purificado utilizando un microespectrofotómetro.
         NOTA: La concentración de ADN esperada será de alrededor de 300-600 ng/μL. Almacene la plantilla de ADN IVT a -20 °C a largo plazo.
   2. Electroforesis en gel de ADN agarosa
      NOTA: Este experimento es para verificar si la plantilla de ADN IVT purificada tiene el tamaño correcto y está desprovista de contaminación no específica del producto.
      1. Para preparar un gel de agarosa al 1%, añadir 0,5 g de agarosa y 50 mL de 1x TAE en un matraz cónico. Calienta en el microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo. Enfriar la agarosa a temperatura ambiente durante 5 minutos.
      2. Agregue 1 μL de tinción de ácido nucleico (tinte SafeView) para obtener una solución de agarosa de 50 mL.
      3. Vierta la solución de agarosa en una bandeja de fundición de gel con un peine y déjela hasta que el gel se solidifique.
      4. Saque el peine del gel y guarde el gel en el tanque tamponado 1x TAE.
      5. Mezcle 10 μL de escalera de ADN de 100-10000 pb y 100-200 ng de producto plantilla purificado por PCR con 2 μL de tampón de carga de ADN 6x hasta un volumen total de 12 μL.
      6. Cargue cada muestra en los pocillos respectivos y hágala funcionar a 100 V durante al menos 45-60 minutos.
      7. Visualice las bandas de ADN en un instrumento de documentación en gel (Figura 2).
4. Síntesis de ARN modificado con me1Ψ-UTP
   NOTA: Antes de comenzar este experimento, el área de trabajo (flujo de aire laminar) debe limpiarse con etanol al 70% en agua tratada con DEPC. Utilice tubos estériles de baja retención y tubos de baja retención libres de nucleasas y endotoxinas. Aplique con frecuencia etanol al 70% en las manos enguantadas.
   1. Prepare la mezcla de reacción IVT como se indica en la Tabla 3 a temperatura ambiente en un tubo de 0,2 ml y mezcle bien con una micropipeta.
   2. Gira el tubo durante 10 segundos en un microfuge.
   3. Incubar a 37 °C durante 3 horas en un termociclador.
5. Degradación de la plantilla de ADN IVT mediante el tratamiento con DNasa 1
   1. Añada 1 μL de 1 U/μL de DNasa 1 (libre de ARNasa) a la mezcla de reacción IVT e incube a 37 °C durante 30 minutos.
6. Purificación de ARN por extracción orgánica/precipitación de acetato de amonio
   1. Ajuste el volumen de la mezcla de reacción IVT a 200 μL con 179 μL de agua tratada con DEPC.
   2. Añadir 200 μL de fenol/cloroformo saturado con TE pH 8,0. Vórtice durante 10 segundos.
   3. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos a 25 °C para separar las dos fases.
   4. Transfiera la fase superior acuosa (200 μL) a un tubo de 1,5 mL y agregue 200 μL de acetato de amonio 5 M. Mezclar bien y luego incubar durante 15 minutos en hielo para precipitar el ARN.
   5. Granular el ARN precipitado por centrifugación a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C y eliminar completamente el sobrenadante con una micropipeta.
   6. Lave el pellet de ARN con etanol al 70% e invierta de 5 a 10 veces. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos a 4 °C.
   7. Retire completamente el sobrenadante con una micropipeta sin alterar la pastilla de ARN.
   8. Deje que el pellet se seque a temperatura ambiente hasta que el pellet se vuelva semitranslúcido. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 60-75 μL de agua libre de RNasa.
7. Control de calidad para ARN purificado
   1. Cuantificación
      1. Mida la concentración y la calidad del ARN purificado con un microespectrofotómetro.
         NOTA: El rendimiento esperado de ARN será de 140-180 μg para el ARN no modificado y de 100-150 μg para el ARN modificado me1Ψ-UTP por reacción, dependiendo del tamaño del gen de interés y la calidad de la plantilla de ADN IVT. La calidad óptima debe ser una relación OD₂₆₀/OD₂₈₀ en torno a 1,9-2,0 y una relación OD₂₆₀/OD₂₃₀ >2,0. Almacene el ARN a -20 °C durante un breve periodo de tiempo.
   2. Electroforesis en gel de ARN y agarosa desnaturalizante
      NOTA: Este experimento se realiza para verificar si el ARN sintetizado tiene la longitud correcta y está desprovisto de contaminación por subproductos IVT.
      1. Para preparar un gel de agarosa al 1%, añadir 0,5 g de agarosa y 50 mL de 1x TAE en un matraz cónico. Calienta la solución en el microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo. Mantenga la solución de agarosa a temperatura ambiente durante 5 minutos para que se enfríe.
      2. Añadir 1 μL de tinción de ácido nucleico por 50 mL de solución de agarosa al 1%.
      3. Vierta la solución de agarosa en la bandeja de fundición en gel con un peine y déjela hasta que el gel se solidifique.
      4. Saque el peine del gel y guarde el gel en el tanque tamponado 1x TAE.
      5. Prepare la muestra de colorante de carga de ARN como se describe en la Tabla 4.
      6. Calentar las muestras a 65 °C durante 10 minutos y, a continuación, mantener las muestras en hielo.
      7. Cargue cada muestra en los pocillos respectivos y hágalo funcionar a 100 V durante al menos 45-60 minutos.
      8. Visualice las bandas de ARN en un instrumento de documentación de gel (Figura 3).
8. Síntesis de ARNm modificado con me1Ψ-UTP mediante taponamiento enzimático y relaves de poli-A
   NOTA: La eficiencia de taponamiento del ARN IVT utilizando el método enzimático es del 100%. Por lo tanto, utilizamos el taponamiento enzimático de Cap-1 en la síntesis de ARNm en este protocolo. Añadimos colas de poli-A a una longitud de >150 bases A por molécula para mejorar la eficiencia traduccional del ARNm.
   1. Agregue 55-60 μg de ARN IVT purificado y aumente hasta 72 μL con el agua libre de RNasa en un tubo de 1,5 mL.
   2. Desnaturalice el ARN a 65 °C durante 10 minutos en un termomezclador y luego coloque inmediatamente el tubo en hielo durante 5 minutos.
   3. Mientras tanto, prepare la mezcla de reacción de taponado como se muestra en la Tabla 5.
   4. Añadir la mezcla de la reacción de taponado y 4 μL de enzima de taponamiento al ARN desnaturalizado y mezclar bien con una micropipeta. Gira el tubo durante 10 segundos en un microfuge.
   5. Incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 2 horas.
   6. Después de 2 horas, mantenga el tubo en hielo y prepare la mezcla maestra de relaves Poly A como se indica en la Tabla 6.
   7. Agregue la mezcla maestra de relaves Poly A a la solución de ARN tapada y mezcle bien con una micropipeta. Gira el tubo durante 10 segundos en un microfuge.
   8. Incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 2 horas.
      NOTA: el ARNm puede someterse a una purificación inmediata, o el ARNm crudo puede almacenarse a -20 °C durante la noche.
9. Purificación de ARNm IVT
   1. Purifique el ARNm por extracción orgánica/precipitación de acetato de amonio como se indica en la sección 1.6 del protocolo.
   2. Vuelva a suspender el pellet de ARNm con 60 μL de agua libre de ARNasa.
10. Control de calidad para el ARNm purificado
    1. Siga el protocolo de control de calidad como se describe en la sección 1.7 del protocolo.
       NOTA: La banda de ARNm debe aparecer por encima de la banda de ARN debido a la adición de cola de Poly-A en la electroforesis en gel de ARN agarosa desnaturalizante (Figura 3). Además, la cola de Poly-A aumenta el rendimiento de ARNm (debe ser > concentración de ARN). Después de la cuantificación, coloque múltiples alícuotas de ARNm a una concentración de 1 μg/μL y almacene inmediatamente a -80 °C. Evite los múltiples ciclos de congelación y descongelación del ARN para evitar la degradación del ARNm sintetizado.

2. Preparación de liposomas catiónicos y evaluación de las propiedades de transfección de ARNm in vitro

1. Preparación de liposomas
   1. Para la preparación de liposoma catiónico de 1 mM, utilice lípidos catiónicos: DOPE: colesterol en la proporción molar de 1:1:0,5.
   2. Disuelva las proporciones molares apropiadas de lípidos catiónicos, colesterol y DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina) en cloroformo (200 μL) en un vial de vidrio.
   3. Utilice un flujo fino de gas nitrógeno sin humedad para eliminar el disolvente.
   4. Mantenga los lípidos secos a alto vacío para su posterior secado durante 2 horas.
   5. Agregue 1 ml de agua desionizada estéril a los lípidos secos después del secado al vacío y deje que la mezcla se hinche durante la noche.
   6. Agite el vial a temperatura ambiente para hacer vesículas multiunilaminares (MUV).
   7. Utilice la sonicación en baño seguida de la sonicación con sonda a 25 W de potencia para fabricar pequeñas vesículas unilamelares (SUV) a partir de vesículas multiunilaminares (MUV).
      NOTA: Los SUV deben verse como una solución de liposomas translúcidos. De lo contrario, aumente el número de pulsos de 30 segundos de encendido y apagado con un intervalo de 1 minuto. Los diámetros hidrodinámicos y los potenciales superficiales se miden (Figura 4) en un analizador de tamaño de partícula.
2. Formación de complejos de ARNm/liposomas y ensayo de retardo en gel
   1. Para la preparación de diferentes relaciones de carga de lípidos-ARN de 1:1 a 8:1, diluya el ARNm y el liposoma catiónico en agua desionizada por separado, como se indica en la Tabla 7.
   2. Mezcle el ARNm diluido en una solución de liposomas como se indica en la Tabla 7 e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente para la formación de lipoplex.
   3. Agregue 20 μL de colorante de carga de ARN 2x en el complejo y cárguelo en el pocillo. El ARNm por sí solo sirve como control.
   4. Cargue las muestras en un gel de agarosa al 1% en 1x tampón TAE y ejecute a 100 V durante 45 minutos.
   5. Visualice las bandas de ARN en un instrumento de documentación de gel (Figura 5).
3. Transfección de ARNm in vitro
   1. Siembre 45.000 células de mamíferos por pocillo de placas de 48 pocillos en medio completo y luego incube a 37 °C durante 16 a 20 horas de transfección.
   2. Después de 16 a 20 horas, verifique la densidad de celdas. En el momento de la transfección, la confluencia celular debe ser de alrededor del 80%.
   3. A los tubos de 0,5 mL, agregue 150 ng de complejo de ARNm codificante de proteínas GFP con una relación de carga de 1:1 de liposomas catiónicos y ARNm en medio DMEM sin suero. El volumen total es de hasta 20 μL.
   4. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
   5. Añadir lipoplex en las células e incubar durante 4 horas en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ .
   6. Retire el medio sin alterar las celdas. Agregue 250 μL de medio completo con 10% de FBS (Tabla 8) en cada pocillo.
   7. Después de 72 horas de la transfección, observe la expresión de GFP bajo un microscopio fluorescente (Figura 6, 7).
   8. Para cuantificar la expresión de GFP, procese las celdas para el análisis de citómetro de flujo.
   9. Retire el medio y lave con 1x PBS dos veces. Tripsinice las células y procese las células para cuantificar el porcentaje de células GFP positivas en un citómetro de flujo.
   10. Adquiera las celdas en un citómetro de flujo utilizando Laser 488. Conecte la población viva a partir de ella y analice el porcentaje de células GFP positivas. Cuantificar la intensidad fluorescente media (MFI) (Figura 6, 7).

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Resultados

Optimizamos el protocolo para la producción de ARNm modificado con me1Ψ-UTP, la preparación de liposomas y los experimentos de transfección de ARNm con liposomas catiónicos en múltiples células de mamíferos (Figura 1). Para sintetizar el ARNm, el molde de eGFP IVT optimizado para codones de mamíferos se amplificó a partir del vector de expresión de mamíferos mEGFP-N1 y se purificó mediante el método de extracción orgánica/precipitación de et...

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Discusión

Las aplicaciones terapéuticas de los ARNm no modificados han sido limitadas debido a su vida media más corta y su capacidad para activar respuestas inmunitarias innatas intracelulares, que a su vez conducen a una mala expresión de proteínas^{en las células} transfectadas. Katalin et al. demostraron que los nucleósidos modificados que contienen ARN, como m5C, m6A, ΨU y me1Ψ-UTP podrían evitar la activación de TLR¹². Más importante a?...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Lonza	50004
Bath sonicator	DNMANM Industries	USC-100
Cationic lipid	Synthesized in the lab
Chlorofrom	MP biomedicals	67-66-3	"Caution"
Cholesterol	Himedia	GRM335
DEPC water	SRL BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA Ladder	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA sodium salt	MP biomedicals	194822
Ethanol	Hayman	F204325	"Caution"
Fetal bovine serum	Gibco	10270
Flow cytometry	BD	FACS Celesta
Fluroscence Microscope	Leica	MI6000B
Gel documentation system	Cell Biosciences	Flurochem E
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	85801	"Caution"
mEGFP-N1, Mammalian expression vector	Addgene	54767
N1-Methylpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Phenol:chloroform:isoamyl alchol (25:24:1), pH 8.0	SRL BioLit	136112-00-0	"Caution"
Phosphate Buffer Saline (PBS), pH 7.4	CellClone	CC3041
Probe sonicator	Sonics Vibra Cells	VCX130
RNA ladder	NEB	N0362S
RNase inhibitor	Thermo Scientific	N8080119
SafeView dye	abm	G108
Sodium acetate	Sigma	S7545
Thermocycler	Applied biosystems	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Tris buffer	SRL BioLit	71033
Trypsin	Gibco	25200056