Usando nanopartículas lipídicas para a entrega de mRNA quimicamente modificado em células de mamíferos

Resumo

O protocolo apresenta transcrição in vitro (IVT) de mRNA quimicamente modificado, preparação de lipossomas catiônicos e análise funcional de transfecções de mRNA habilitadas para lipossomas em células de mamíferos.

Resumo

Nos últimos anos, o RNA mensageiro quimicamente modificado (mRNA) emergiu como uma potente molécula de ácido nucleico para o desenvolvimento de uma ampla gama de aplicações terapêuticas, incluindo uma nova classe de vacinas, terapias de reposição de proteínas e imunoterapias. Entre os vetores de entrega, as nanopartículas lipídicas são consideradas mais seguras e eficazes na entrega de moléculas de RNA (por exemplo, siRNA, miRNA, mRNA) e alguns produtos já estão em uso clínico. Para demonstrar a entrega de mRNA mediada por nanopartículas lipídicas, apresentamos um protocolo otimizado para a síntese de mRNA eGFP modificado por me1Ψ-UTP funcional, a preparação de lipossomas catiônicos, a formação de complexos eletrostáticos de mRNA com lipossomas catiônicos e a avaliação das eficiências de transfecção em células de mamíferos. Os resultados demonstram que essas modificações melhoraram eficientemente a estabilidade do mRNA quando entregues com lipossomas catiônicos e aumentaram a eficiência e a estabilidade da tradução do mRNA do eGFP em células de mamíferos. Este protocolo pode ser usado para sintetizar o mRNA desejado e transfectar com lipossomas catiônicos para expressão gênica alvo em células de mamíferos.

Introdução

Como molécula terapêutica, o mRNA oferece várias vantagens devido à sua natureza não integrativa e sua capacidade de transfectar células não mitóticas quando comparado ao DNA plasmidial (pDNA)¹. Embora a entrega de mRNA tenha sido demonstrada no início da década de 1990, as aplicações terapêuticas foram limitadas devido à sua falta de estabilidade, falta de ativação imunológica e baixa eficiência translacional². Modificações químicas recentemente identificadas, como pseudouridina 5'-trifosfato (Ψ-UTP) e metil pseudouridina 5'-trifosfato (me1Ψ-UTP) no mRNA, ajudaram a superar essas limitações, revolucionaram a pesquisa de mRNA e, por sua vez, tornaram o mRNA uma ferramenta promissora tanto na pesquisa básica quanto na aplicada. A gama de aplicações abrange a geração de iPSCs para vacinação e terapia gênica ^3,4.

Paralelamente ao avanço da tecnologia de mRNA, avanços significativos nos sistemas de entrega não virais tornaram a entrega de mRNA eficaz, tornando essa tecnologia viável para múltiplas aplicações terapêuticas⁵. Dentre os vetores não virais, as nanopartículas lipídicas mostraram-se eficazes na liberação de ácidos nucléicos ^6,7. Recentemente, a Alnylam recebeu a aprovação da FDA de medicamentos siRNA à base de lipídios para o tratamento de doenças hepáticas, incluindo Patisiran para amiloidose hereditária mediada por transtirretina (amiloidose hATTR) e Givosiran para porfirias hepáticas agudas (AHP)⁸. Durante a pandemia de COVID19, as vacinas baseadas em mRNA encapsuladas em lipídios da Pfizer-BioNtech e Moderna demonstraram sua eficácia e receberam aprovações da FDA ^9,10. Assim, a entrega de mRNA habilitada por lipídios tem um grande potencial terapêutico.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção de mRNA de eGFP modificado quimicamente, in vitro transcrito, preparação de lipossomas catiônicos, otimização de complexo mRNA-lipídio e transfecções em células de mamíferos (Figura 1).

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Protocolo

1. Produção de mRNA modificado me1 Ψ-UTP

1. Preparação do molde de DNA de transcrição in vitro (IVT)
   NOTA: Para a preparação do molde de DNA IVT (promotor T7 - quadro de leitura aberto (ORF) do gene), projete um conjunto de primers específicos do gene para o gene de interesse. Adicione a sequência do promotor T7 (5'-NNNNNNTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3') antes do primer direto específico do gene.
   1. Prepare a mistura de reação de PCR conforme descrito na Tabela 1.
      NOTA: Execute pelo menos quatro reações de PCR para aumentar a concentração e a qualidade do modelo de DNA IVT para IVT.
   2. Misture completamente a mistura de reação com uma micropipeta e gire para baixo usando uma microcentrífuga.
   3. Execute o protocolo de ciclagem de PCR fornecido na Tabela 2 em um termociclador.
2. Purificação do molde de ADN IVT por extração orgânica/precipitação de etanol
   1. Ajuste a mistura de reação de PCR amplificada para 200 μL no total usando água tratada com DEPC em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (sem nuclease).
   2. Adicione 200 μL de fenol/clorofórmio saturado com TE, pH 8,0. Vortex vigorosamente por 10 segundos.
   3. Centrifugue a 12.000 x g por 5 minutos para separar as fases e transferir a fase superior aquosa (aproximadamente 200 μL) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   4. Adicione 1/10^th (20 μL) do volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,5 e dois volumes (400 μL) de etanol 99-100%. Misturar bem e incubar durante pelo menos 30 minutos a -20 °C.
   5. Pulverizar o molde de ADN por centrifugação a 12 000 x g durante 15 minutos a 4 °C.
   6. Remova o sobrenadante completamente sem perturbar o pellet usando uma micropipeta.
   7. Adicione 0,5 mL de etanol a 75% ao pellet e inverta 5 a 10 vezes.
   8. Centrifugue por 2 minutos a 12.000 x g a 4 °C. Em seguida, remova o etanol completamente com uma pipeta sem perturbar o DNApellet.
   9. Deixe o pellet secar à temperatura ambiente até que o pellet fique um pouco translúcido.
   10. Adicione 20 μL de água livre de nuclease e ressuspenda completamente por alguns segundos.
3. Controle de qualidade para o modelo de DNA IVT purificado
   1. Quantificação
      1. Meça a concentração e a qualidade do molde de DNA IVT purificado usando um microespectrofotômetro.
         NOTA: A concentração de DNA esperada será de cerca de 300-600 ng/μL. Armazene o molde de DNA IVT a -20 °C a longo prazo.
   2. Eletroforese em gel de agarose de DNA
      NOTA: Este experimento é para verificar se o molde de DNA IVT purificado tem o tamanho correto e é desprovido de contaminação não específica do produto.
      1. Para preparar um gel de agarose a 1%, adicione 0,5 g de agarose e 50 mL de 1x TAE em um frasco cônico. Microondas até que a agarose se dissolva completamente. Deixe esfriar a agarose em temperatura ambiente por 5 minutos.
      2. Adicione 1 μL de corante de ácido nucleico (corante SafeView) para uma solução de agarose de 50 mL.
      3. Despeje a solução de agarose em uma bandeja de fundição de gel com um pente e deixe até que o gel se solidifique.
      4. Retire o pente do gel e mantenha o gel no tanque tamponado 1x TAE.
      5. Misture 10 μL de escada de DNA de 100-10000 pb e 100-200 ng de produto molde purificado por PCR com 2 μL de tampão de carga de DNA 6x para um volume total de 12 μL.
      6. Carregue cada amostra nos respectivos poços e opere a 100 V por pelo menos 45-60 minutos.
      7. Visualize as bandas de DNA em um instrumento de documentação de gel (Figura 2).
4. Síntese de RNA modificado me1Ψ-UTP
   NOTA: Antes de iniciar este experimento, a área de trabalho (fluxo de ar laminar) deve ser limpa com etanol 70% em água tratada com DEPC. Use tubos estéreis livres de nuclease e endotoxinas, de baixa retenção e pontas de barreira de filtro. Aplique frequentemente etanol 70% nas mãos enluvadas.
   1. Prepare a mistura de reação IVT conforme indicado na Tabela 3 à temperatura ambiente em um tubo de 0,2 mL e misture bem usando uma micropipeta.
   2. Gire o tubo por 10 segundos em uma microcentrífuga.
   3. Incubar a 37 °C durante 3 horas num termociclador.
5. Degradação do molde de DNA IVT pelo tratamento com DNase 1
   1. Adicionar 1 μL de 1 U/μL DNase 1 (sem RNase) à mistura de reação IVT e incubar a 37 °C durante 30 minutos.
6. Purificação de RNA por extração orgânica/precipitação de acetato de amônio
   1. Ajuste o volume da mistura de reação IVT para 200 μL com 179 μL de água tratada com DEPC.
   2. Adicione 200 μL de fenol/clorofórmio saturado com TE pH 8,0. Vortex por 10 segundos.
   3. Centrifugue a 12.000 x g por 5 minutos a 25 °C para separar as duas fases.
   4. Transferir a fase superior aquosa (200 μL) para um tubo de 1,5 ml e adicionar 200 μL de acetato de amónio 5 M. Misture bem e incube por 15 minutos no gelo para precipitar o RNA.
   5. Granular o RNA precipitado por centrifugação a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C e remover completamente o sobrenadante com uma micropipeta.
   6. Lave o pellet de RNA usando etanol a 70% e inverta 5 a 10 vezes. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos a 4 °C.
   7. Remova o sobrenadante completamente com uma micropipeta sem perturbar o pellet de RNA.
   8. Deixe o pellet secar à temperatura ambiente até que se torne semi-translúcido. Em seguida, ressuspenda o pellet em 60-75 μL de água livre de RNase.
7. Controle de qualidade para RNA purificado
   1. Quantificação
      1. Medir a concentração e a qualidade do RNA purificado utilizando um microespectrofotómetro.
         NOTA: O rendimento esperado de RNA será de 140-180 μg para RNA não modificado e 100-150 μg para RNA modificado me1Ψ-UTP por reação, dependendo do tamanho do gene de interesse e da qualidade do molde de DNA IVT. A qualidade ideal deve ser uma relação OD₂₆₀ / OD₂₈₀ em torno de 1,9-2,0 e uma relação OD₂₆₀ / OD₂₃₀ >2,0. Armazene o RNA a -20 °C por um curto período de tempo.
   2. Eletroforese em gel de agarose de RNA desnaturante
      NOTA: Este experimento é realizado para verificar se o RNA sintetizado tem o comprimento correto e é desprovido de contaminação por subproduto IVT.
      1. Para preparar um gel de agarose a 1%, adicione 0,5 g de agarose e 50 mL de 1x TAE em um frasco cônico. Microondas a solução até que a agarose se dissolva completamente. Mantenha a solução de agarose em temperatura ambiente por 5 minutos para esfriar.
      2. Adicione 1 μL de corante de ácido nucleico para 50 mL de solução de agarose a 1%.
      3. Despeje a solução de agarose na bandeja de fundição de gel com um pente e deixe até que o gel se solidifique.
      4. Retire o pente do gel e mantenha o gel no tanque tamponado 1x TAE.
      5. Prepare a amostra de corante de carga de RNA conforme descrito na Tabela 4.
      6. Aquecer as amostras a 65 °C durante 10 minutos e depois mantê-las congeladas.
      7. Carregue cada amostra nos respectivos poços e opere a 100 V por pelo menos 45-60 minutos.
      8. Visualize as bandas de RNA em um instrumento de documentação de gel (Figura 3).
8. Síntese de mRNA modificado por me1Ψ-UTP por capeamento baseado em enzima e cauda de poli-A
   NOTA: A eficiência de nivelamento do RNA IVT usando o método enzimático é de 100%. Portanto, usamos capeamento enzimático de Cap-1 na síntese de mRNA neste protocolo. Adicionamos caudas poli-A com um comprimento de >150 A bases por molécula para melhorar a eficiência translacional do mRNA.
   1. Adicione 55-60 μg de RNA IVT purificado e aumente para 72 μL com a água livre de RNase em um tubo de 1,5 mL.
   2. Desnature o RNA a 65 °C por 10 minutos em um termomixer e, em seguida, coloque imediatamente o tubo no gelo por 5 minutos.
   3. Enquanto isso, prepare a mistura de reação de nivelamento conforme mostrado na Tabela 5.
   4. Adicione a mistura de reação de capeamento e 4 μL de enzima de capeamento ao RNA desnaturado e misture bem com micropipeta. Gire o tubo por 10 segundos em uma microcentrífuga.
   5. Incubar a mistura de reação a 37 °C durante 2 horas.
   6. Após 2 horas, mantenha o tubo no gelo e prepare a mistura principal de rejeitos Poly A conforme indicado na Tabela 6.
   7. Adicione a mistura principal de rejeitos Poly A à solução de RNA tampada e misture bem com micropipeta. Gire o tubo por 10 segundos em uma microcentrífuga.
   8. Incubar a mistura de reação a 37 °C durante 2 horas.
      NOTA: o mRNA pode ser submetido a purificação imediatamente, ou o mRNA bruto pode ser armazenado a -20 °C durante a noite.
9. Purificação de mRNA IVT
   1. Purificar o ARNm por extracção orgânica/precipitação de acetato de amónio, conforme indicado na secção 1.6 do protocolo.
   2. Ressuspenda o pellet de mRNA com 60 μL de água livre de RNase.
10. Controle de qualidade para o mRNA purificado
    1. Siga o protocolo de controle de qualidade conforme descrito na seção 1.7 do protocolo.
       NOTA: A banda de mRNA deve aparecer acima da banda de RNA devido à adição de rejeito de Poly-A na eletroforese em gel de agarose de RNA desnaturante (Figura 3). Além disso, o rejeito Poly-A aumenta o rendimento do mRNA (deve ser > concentração de RNA). Após a quantificação, colocar várias alíquotas de mRNA na concentração de 1 μg/μL e conservá-las imediatamente a -80 °C. Evite vários ciclos de congelamento e descongelamento de RNA para evitar a degradação do mRNA sintetizado.

2. Preparação de lipossomas catiônicos e avaliação das propriedades de transfecção de mRNA in vitro

1. Preparação de lipossomas
   1. Para a preparação de lipossomas catiônicos 1 mM, use lipídios catiônicos: DOPE: colesterol na proporção molar de 1:1:0,5.
   2. Dissolva as proporções molares apropriadas do lipídio catiônico, colesterol e DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina) em clorofórmio (200 μL) em um frasco de vidro.
   3. Use um fluxo fino de gás nitrogênio livre de umidade para remoção de solventes.
   4. Mantenha os lipídios secos sob alto vácuo para secagem adicional por 2 horas.
   5. Adicione 1 mL de água deionizada estéril aos lipídios secos após a secagem a vácuo e deixe a mistura inchar durante a noite.
   6. Vortex o frasco à temperatura ambiente para fazer vesículas multi-unilamelares (MUVs).
   7. Use sonicação de banho seguida de sonicação de sonda com potência de 25 W para fazer pequenas vesículas unilamelares (SUVs) a partir de vesículas multi unilamelares (MUVs).
      NOTA: Os SUVs devem se parecer com uma solução de lipossomas translúcidos. Caso contrário, aumente o número de pulsos de 30 segundos ligados e desligados com um intervalo de 1 min. Os diâmetros hidrodinâmicos e os potenciais de superfície são medidos (Figura 4) em um analisador de tamanho de partícula.
2. Formação de complexo de mRNA/lipossomas e ensaio de retardo de gel
   1. Para a preparação de diferentes relações de carga lipídico-RNA de 1:1 a 8:1, diluir o mRNA e o lipossomo catiônico em água deionizada separadamente, conforme indicado na Tabela 7.
   2. Misture o mRNA diluído em solução de lipossomas conforme indicado na Tabela 7 e incube-o por 10 minutos em temperatura ambiente para formação de lipoplex.
   3. Adicione 20 μL de corante de carga de RNA 2x no complexo e carregue no poço. O mRNA sozinho serve como controle.
   4. Carregue as amostras em um gel de agarose a 1% em tampão TAE 1x e execute a 100 V por 45 minutos.
   5. Visualize as bandas de RNA em um instrumento de documentação de gel (Figura 5).
3. Transfecção de mRNA in vitro
   1. Semeie 45.000 células de mamíferos por poço de placas de 48 poços em meio completo e depois incube a 37 ° C por 16 a 20 horas de transfecção.
   2. Após 16 a 20 horas, verifique a densidade celular. No momento da transfecção, a confluência celular deve estar em torno de 80%.
   3. Para tubos de 0,5 mL, adicione 150 ng de complexo de mRNA codificador de proteína GFP com uma proporção de carga de 1:1 de lipossomas catiônicos e mRNA em meio DMEM sem soro. O volume total chega a 20 μL.
   4. Incube em temperatura ambiente por 10 minutos.
   5. Adicione o lipoplex nas células e incube-o por 4 horas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ .
   6. Remova a mídia sem perturbar as células. Adicione 250 μL de meio completo com 10% de FBS (Tabela 8) em cada poço.
   7. Após 72 horas de transfecção, visualize a expressão de GFP sob um microscópio fluorescente (Figura 6, 7).
   8. Para quantificar a expressão de GFP, processe as células para análise por citômetro de fluxo.
   9. Remova a mídia e lave com 1x PBS duas vezes. Tripsinize as células e processe as células para quantificar a porcentagem de células positivas para GFP em um citômetro de fluxo.
   10. Adquira as células em um citômetro de fluxo usando o Laser 488. Tire a população viva disso e analise a porcentagem de células positivas para GFP. Quantifique a intensidade fluorescente média (MFI) (Figura 6, 7).

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Resultados

Otimizamos o protocolo para produção de mRNA modificado por me1Ψ-UTP, preparação de lipossomas e experimentos de transfecção de mRNA com lipossomas catiônicos em várias células de mamíferos (Figura 1). Para sintetizar o mRNA, o modelo eGFP IVT otimizado para códons de mamíferos foi amplificado a partir do vetor de expressão de mamíferos mEGFP-N1 e purificado pelo método de extração orgânica / precipitação de etanol (...

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Discussão

As aplicações terapêuticas de mRNAs não modificados têm sido limitadas devido à sua meia-vida mais curta e sua capacidade de ativar respostas imunes inatas intracelulares, que por sua vez levam a uma baixa expressão de proteínas em células transfectadas¹¹. Katalin et al. demonstraram que o RNA contendo nucleosídeos modificados, como m5C, m6A, ΨU e me1Ψ-UTP, poderia evitar a ativação de TLR¹². Mais importante, a incorporação ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Lonza	50004
Bath sonicator	DNMANM Industries	USC-100
Cationic lipid	Synthesized in the lab
Chlorofrom	MP biomedicals	67-66-3	"Caution"
Cholesterol	Himedia	GRM335
DEPC water	SRL BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA Ladder	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA sodium salt	MP biomedicals	194822
Ethanol	Hayman	F204325	"Caution"
Fetal bovine serum	Gibco	10270
Flow cytometry	BD	FACS Celesta
Fluroscence Microscope	Leica	MI6000B
Gel documentation system	Cell Biosciences	Flurochem E
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	85801	"Caution"
mEGFP-N1, Mammalian expression vector	Addgene	54767
N1-Methylpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Phenol:chloroform:isoamyl alchol (25:24:1), pH 8.0	SRL BioLit	136112-00-0	"Caution"
Phosphate Buffer Saline (PBS), pH 7.4	CellClone	CC3041
Probe sonicator	Sonics Vibra Cells	VCX130
RNA ladder	NEB	N0362S
RNase inhibitor	Thermo Scientific	N8080119
SafeView dye	abm	G108
Sodium acetate	Sigma	S7545
Thermocycler	Applied biosystems	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Tris buffer	SRL BioLit	71033
Trypsin	Gibco	25200056