Utilizzo di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione di mRNA chimicamente modificato nelle cellule di mammifero

Riepilogo

Il protocollo presenta la trascrizione in vitro (IVT) di mRNA chimicamente modificato, la preparazione cationica dei liposomi e l'analisi funzionale delle trasfezioni di mRNA abilitate dai liposomi nelle cellule di mammifero.

Abstract

Negli ultimi anni, l'RNA messaggero chimicamente modificato (mRNA) è emerso come una potente molecola di acido nucleico per lo sviluppo di un'ampia gamma di applicazioni terapeutiche, tra cui una nuova classe di vaccini, terapie sostitutive proteiche e terapie immunitarie. Tra i vettori di consegna, le nanoparticelle lipidiche sono risultate più sicure ed efficaci nel veicolare molecole di RNA (ad esempio, siRNA, miRNA, mRNA) e alcuni prodotti sono già in uso clinico. Per dimostrare la consegna dell'mRNA mediata da nanoparticelle lipidiche, presentiamo un protocollo ottimizzato per la sintesi di mRNA funzionale di eGFP modificato con me1Ψ-UTP, la preparazione di liposomi cationici, la formazione di complessi elettrostatici di mRNA con liposomi cationici e la valutazione dell'efficienza di trasfezione nelle cellule di mammifero. I risultati dimostrano che queste modifiche hanno migliorato in modo efficiente la stabilità dell'mRNA quando somministrato con liposomi cationici e hanno aumentato l'efficienza e la stabilità della traduzione dell'mRNA eGFP nelle cellule di mammifero. Questo protocollo può essere utilizzato per sintetizzare l'mRNA desiderato e trasfettare con liposomi cationici per l'espressione genica bersaglio nelle cellule di mammifero.

Introduzione

Come molecola terapeutica, l'mRNA offre diversi vantaggi grazie alla sua natura non integrativa e alla sua capacità di trasfettare le cellule non mitotiche rispetto al DNA plasmidico (pDNA)¹. Sebbene la consegna dell'mRNA sia stata dimostrata nei primi anni '90, le applicazioni terapeutiche erano limitate a causa della sua mancanza di stabilità, della sua mancanza di attivazione immunitaria e della scarsa efficienza traslazionale². Modifiche chimiche identificate di recente, come la pseudouridina 5'-trifosfato (Ψ-UTP) e la metilpseudouridina 5'-trifosfato (me1Ψ-UTP) sull'mRNA, hanno contribuito a superare queste limitazioni, hanno rivoluzionato la ricerca sull'mRNA e, a loro volta, hanno reso l'mRNA uno strumento promettente sia nella ricerca di base che in quella applicata. La gamma di applicazioni spazia dalla generazione di iPSC alla vaccinazione e alla terapia genica ^3,4.

Parallelamente al progresso della tecnologia dell'mRNA, progressi significativi nei sistemi di somministrazione non virale hanno reso efficace la somministrazione dell'mRNA, rendendo questa tecnologia fattibile per molteplici applicazioni terapeutiche⁵. Tra i vettori non virali, le nanoparticelle lipidiche si sono dimostrate efficaci nel veicolare acidi nucleici ^6,7. Recentemente, Alnylam ha ricevuto l'approvazione da parte della FDA di farmaci siRNA a base lipidica per il trattamento delle malattie epatiche, tra cui Patisiran per l'amiloidosi ereditaria mediata da transtiretina (amiloidosi hATTR) e Givosiran per le porfirie epatiche acute (AHP)⁸. Durante la pandemia di COVID19, i vaccini a base di mRNA incapsulati lipidici di Pfizer-BioNtech e Moderna hanno dimostrato la loro efficacia e hanno ricevuto l'approvazione della FDA ^9,10. Pertanto, la somministrazione di mRNA abilitata dai lipidi ha un grande potenziale terapeutico.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la produzione di mRNA eGFP chimicamente modificato e trascritto in vitro, preparazione di liposomi cationici, ottimizzazione del complesso mRNA-lipidi e trasfezioni in cellule di mammifero (Figura 1).

Protocollo

1. Produzione di mRNA modificato me1 Ψ-UTP

1. Preparazione del modello di DNA per trascrizione in vitro (IVT)
   NOTA: Per la preparazione del modello di DNA IVT (promotore T7 - cornice di lettura aperta (ORF) del gene), progettare un set di primer specifico per il gene di interesse. Aggiungere la sequenza del promotore T7 (5'-NNNNNNTACGACTCACTATAGGGNNNNNNN-3') prima del primer in avanti specifico del gene.
   1. Preparare la miscela di reazione PCR come descritto nella Tabella 1.
      NOTA: Eseguire almeno quattro reazioni PCR per aumentare la concentrazione e la qualità del modello di DNA IVT per IVT.
   2. Mescolare completamente la miscela di reazione con una micropipetta e centrifugare con una microfuge.
   3. Eseguire il protocollo di ciclo PCR indicato nella Tabella 2 su un termociclatore.
2. Purificazione del modello di DNA IVT mediante estrazione organica/precipitazione con etanolo
   1. Regolare la miscela di reazione PCR amplificata a 200 μl totali utilizzando acqua trattata con DEPC in una provetta microfusa da 1,5 mL (priva di nucleasi).
   2. Aggiungere 200 μl di fenolo/cloroformio saturo di TE, pH 8,0. Agitare energicamente per 10 secondi.
   3. Centrifugare a 12.000 x g per 5 minuti per separare le fasi e trasferire la fase superiore acquosa (circa 200 μL) in una nuova provetta microfusa da 1,5 mL.
   4. Aggiungere 1/10^di volume (20 μL) di acetato di sodio 3 M, pH 5,5 e due volumi (400 μL) di etanolo al 99-100%. Mescolare bene e poi incubare per almeno 30 minuti a -20 °C.
   5. Pellettare il modello di DNA mediante centrifugazione a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
   6. Rimuovere completamente il surnatante senza disturbare il pellet utilizzando una micropipetta.
   7. Aggiungere 0,5 ml di etanolo al 75% al pellet e capovolgere 5-10 volte.
   8. Centrifugare per 2 minuti a 12.000 x g a 4 °C. Quindi rimuovere completamente l'etanolo con una pipetta senza disturbare il DNApellet.
   9. Lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente fino a quando il pellet diventa un po' traslucido.
   10. Aggiungere 20 μL di acqua priva di nucleasi e risospendere accuratamente per alcuni secondi.
3. Controllo di qualità per il modello di DNA IVT purificato
   1. Quantificazione
      1. Misura la concentrazione e la qualità del modello di DNA IVT purificato utilizzando un microspettrofotometro.
         NOTA: La concentrazione di DNA prevista sarà di circa 300-600 ng/μL. Conservare il modello di DNA IVT a -20 °C a lungo termine.
   2. Elettroforesi su gel di DNA agarosio
      NOTA: Questo esperimento serve a verificare se il modello di DNA IVT purificato è della dimensione corretta e privo di contaminazione non specifica del prodotto.
      1. Per preparare un gel di agarosio all'1%, aggiungere 0,5 g di agarosio e 50 ml di 1x TAE in un pallone conico. Cuocetelo nel microonde fino a quando l'agarosio non si scioglie completamente. Raffreddare l'agarosio a temperatura ambiente per 5 minuti.
      2. Aggiungere 1 μL di colorante per acido nucleico (colorante SafeView) per una soluzione di agarosio da 50 mL.
      3. Versare la soluzione di agarosio in un vassoio di colata di gel con un pettine e lasciarla fino a quando il gel non si sarà solidificato.
      4. Estrarre il pettine dal gel e conservare il gel nel serbatoio tampone 1x TAE.
      5. Miscelare 10 μl di scala di DNA da 100-10000 bp e 100-200 ng di prodotto modello purificato per PCR con 2 μl di tampone di caricamento del DNA 6x per un volume totale di 12 μl.
      6. Caricare ogni campione sui rispettivi pozzetti e farlo funzionare a 100 V per almeno 45-60 minuti.
      7. Visualizzare le bande di DNA su uno strumento di documentazione su gel (Figura 2).
4. Sintesi di RNA modificato me1Ψ-UTP
   NOTA: Prima di iniziare questo esperimento, l'area di lavoro (flusso d'aria laminare) deve essere pulita con etanolo al 70% in acqua trattata con DEPC. Utilizzare provette sterili prive di nucleasi ed endotossine, a bassa ritenzione e puntali barriera filtranti. Applicare frequentemente etanolo al 70% sulle mani guantate.
   1. Preparare la miscela di reazione IVT come indicato nella Tabella 3 a temperatura ambiente in una provetta da 0,2 mL e mescolarla accuratamente utilizzando una micropipetta.
   2. Far girare il tubo per 10 secondi in una microfuga.
   3. Incubare a 37 °C per 3 ore in termociclatore.
5. Degradazione del modello di DNA IVT mediante trattamento con DNasi 1
   1. Aggiungere 1 μL di 1 U/μL di DNasi 1 (priva di RNasi) nella miscela di reazione IVT e incubare a 37 °C per 30 minuti.
6. Purificazione dell'RNA mediante estrazione organica/precipitazione dell'acetato di ammonio
   1. Regolare il volume della miscela di reazione IVT a 200 μl con 179 μl di acqua trattata con DEPC.
   2. Aggiungere 200 μl di fenolo/cloroformio saturo di TE pH 8,0. Agitalo per 10 secondi.
   3. Centrifugare a 12.000 x g per 5 minuti a 25 °C per separare le due fasi.
   4. Trasferire la fase superiore acquosa (200 μl) in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 200 μl di acetato di ammonio 5 M. Mescolare bene e poi incubare per 15 minuti con ghiaccio per far precipitare l'RNA.
   5. Pellettare l'RNA precipitato mediante centrifugazione a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C e rimuovere completamente il surnatante con una micropipetta.
   6. Lavare il pellet di RNA utilizzando etanolo al 70% e capovolgere 5-10 volte. Centrifugare a 12.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
   7. Rimuovere completamente il surnatante con una micropipetta senza disturbare il pellet di RNA.
   8. Lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente fino a quando il pellet non diventa semitrasparente. Quindi risospendere il pellet in 60-75 μL di acqua priva di RNasi.
7. Controllo di qualità per RNA purificato
   1. Quantificazione
      1. Misurare la concentrazione e la qualità dell'RNA purificato utilizzando un microspettrofotometro.
         NOTA: La resa di RNA attesa sarà di 140-180 μg per l'RNA non modificato e di 100-150 μg per l'RNA modificato me1Ψ-UTP per reazione, a seconda delle dimensioni del gene di interesse e della qualità del modello di DNA IVT. La qualità ottimale dovrebbe essere un rapporto OD₂₆₀/OD₂₈₀ intorno a 1,9-2,0 e un rapporto OD₂₆₀/OD₂₃₀ >2,0. Conservare l'RNA a -20 °C per un breve periodo.
   2. Elettroforesi su gel di agarosio con RNA denaturante
      NOTA: Questo esperimento viene eseguito per verificare se l'RNA sintetizzato è della lunghezza corretta e privo di contaminazione da sottoprodotti IVT.
      1. Per preparare un gel di agarosio all'1%, aggiungere 0,5 g di agarosio e 50 ml di 1x TAE in un pallone conico. Microonde la soluzione fino a quando l'agarosio non si scioglie completamente. Conservare la soluzione di agarosio a temperatura ambiente per 5 minuti per farla raffreddare.
      2. Aggiungere 1 μL di colorante di acido nucleico per 50 mL di soluzione di agarosio all'1%.
      3. Versare la soluzione di agarosio nel vassoio di colata del gel con un pettine e lasciarla fino a quando il gel non si sarà solidificato.
      4. Estrarre il pettine dal gel e conservare il gel nel serbatoio tampone 1x TAE.
      5. Preparare il campione di colorante che carica l'RNA come descritto nella Tabella 4.
      6. Riscaldare i campioni a 65 °C per 10 minuti e quindi conservare i campioni in ghiaccio.
      7. Caricare ogni campione sui rispettivi pozzetti e farlo funzionare a 100 V per almeno 45-60 minuti.
      8. Visualizzare le bande di RNA su uno strumento di documentazione su gel (Figura 3).
8. Sintesi di mRNA modificato con me1Ψ-UTP mediante capping enzimatico e codinamento poli-A
   NOTA: L'efficienza di capping dell'RNA IVT utilizzando il metodo enzimatico è del 100%. Quindi, abbiamo utilizzato il capping enzimatico di Cap-1 nella sintesi dell'mRNA in questo protocollo. Abbiamo aggiunto code di poli-A a una lunghezza di >150 basi A per molecola per migliorare l'efficienza traduzionale dell'mRNA.
   1. Aggiungere 55-60 μg di RNA IVT purificato e portare fino a 72 μL con l'acqua priva di RNasi in una provetta da 1,5 mL.
   2. Denaturare l'RNA a 65 °C per 10 minuti in un termomiscelatore e poi posizionare immediatamente la provetta sul ghiaccio per 5 minuti.
   3. Nel frattempo, preparare la miscela di reazione di tappatura come mostrato nella Tabella 5.
   4. Aggiungere la miscela di reazione di tappatura e 4 μL di enzima di tappatura all'RNA denaturato e mescolare bene con la micropipetta. Far girare il tubo per 10 secondi in una microfuga.
   5. Incubare la miscela di reazione a 37 °C per 2 ore.
   6. Dopo 2 ore, tenere la provetta sul ghiaccio e preparare la miscela master di coda Poly A come indicato nella Tabella 6.
   7. Aggiungere la miscela master di coda Poly A alla soluzione di RNA tappata e mescolare bene con la micropipetta. Far girare il tubo per 10 secondi in una microfuga.
   8. Incubare la miscela di reazione a 37 °C per 2 ore.
      NOTA: l'mRNA può essere ulteriormente sottoposto a purificazione immediatamente, oppure l'mRNA grezzo può essere conservato a -20 °C durante la notte.
9. Purificazione dell'mRNA IVT
   1. Purificare l'mRNA mediante estrazione organica/precipitazione con acetato di ammonio come indicato nella sezione 1.6 del protocollo.
   2. Risospendere il pellet di mRNA con 60 μL di acqua priva di RNasi.
10. Controllo di qualità per l'mRNA purificato
    1. Seguire il protocollo di controllo qualità come descritto nella sezione 1.7 del protocollo.
       NOTA: La banda dell'mRNA dovrebbe apparire sopra la banda dell'RNA a causa dell'aggiunta di coda di Poly-A nell'elettroforesi su gel di agarosio dell'RNA denaturante (Figura 3). Inoltre, la coda di Poly-A aumenta la resa dell'mRNA (dovrebbe essere > concentrazione di RNA). Dopo la quantificazione, mettere più aliquote di mRNA a una concentrazione di 1 μg/μL e conservarle immediatamente a -80 °C. Evitare cicli multipli di congelamento e scongelamento dell'RNA per prevenire la degradazione dell'mRNA sintetizzato.

2. Preparazione di liposomi cationici e valutazione delle proprietà di trasfezione dell'mRNA in vitro

1. Preparazione dei liposomi
   1. Per la preparazione di 1 mM di liposoma cationico, utilizzare il lipide cationico: DOPE: colesterolo nel rapporto molare di 1:1:0,5.
   2. Sciogliere i rapporti molari appropriati del lipide cationico, del colesterolo e del DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicerolo-3-fosfoetanolammina) in cloroformio (200 μL) in una fiala di vetro.
   3. Utilizzare un flusso sottile di azoto gassoso privo di umidità per la rimozione del solvente.
   4. Conservare i lipidi essiccati sotto vuoto per un'ulteriore asciugatura per 2 ore.
   5. Aggiungere 1 ml di acqua deionizzata sterile ai lipidi essiccati dopo l'essiccazione sottovuoto e lasciare che la miscela si gonfi per una notte.
   6. Agitare la fiala a temperatura ambiente per creare vescicole multi-unilamellari (MUV).
   7. Utilizzare la sonicazione a bagno seguita dalla sonicazione della sonda a una potenza di 25 W per realizzare piccole vescicole unilamellari (SUV) da più vescicole unilamellari (MUV).
      NOTA: I SUV dovrebbero assomigliare a una soluzione liposomica traslucida. In caso contrario, aumentare il numero di impulsi di 30 secondi con un intervallo di 1 minuto. I diametri idrodinamici e i potenziali di superficie vengono misurati (Figura 4) in un analizzatore granulometrico.
2. Saggio di formazione di complessi mRNA/liposomi e ritardo su gel
   1. Per la preparazione di diversi rapporti di carica lipidico-RNA da 1:1 a 8:1, diluire separatamente l'mRNA e il liposoma cationico in acqua deionizzata come indicato nella Tabella 7.
   2. Miscelare l'mRNA diluito con la soluzione liposomica come indicato nella Tabella 7 e incubarlo per 10 minuti a temperatura ambiente per la formazione di lipoplex.
   3. Aggiungere 20 μl di colorante di caricamento dell'RNA 2x nel complesso e caricare sul pozzetto. L'mRNA da solo funge da controllo.
   4. Caricare i campioni su un gel di agarosio all'1% in 1x tampone TAE e farlo funzionare a 100 V per 45 minuti.
   5. Visualizzare le bande di RNA su uno strumento di documentazione su gel (Figura 5).
3. Trasfezione in vitro dell'mRNA
   1. Seminare 45.000 cellule di mammifero per pozzetto di piastre da 48 pozzetti in terreno completo e quindi incubare a 37 °C per 16-20 ore di trasfezione.
   2. Dopo 16-20 ore, controllare la densità cellulare. Al momento della trasfezione, la confluenza cellulare dovrebbe essere di circa l'80%.
   3. Alle provette da 0,5 mL, aggiungere 150 ng di complesso di mRNA codificante la proteina GFP con un rapporto di carica 1:1 di liposomi cationici e mRNA in terreno DMEM senza siero. Il volume totale arriva fino a 20 μl.
   4. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
   5. Aggiungere lipoplex nelle cellule e incubarlo per 4 ore in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ .
   6. Rimuovere il supporto senza disturbare le celle. Aggiungere 250 μl di terreno completo con il 10% di FBS (Tabella 8) in ciascun pozzetto.
   7. Dopo 72 ore di trasfezione, osservare l'espressione di GFP al microscopio a fluorescenza (Figura 6, 7).
   8. Per quantificare l'espressione della GFP, processare le cellule per l'analisi con citometro a flusso.
   9. Rimuovere il supporto e lavare due volte con 1x PBS. Tripsinizzare le cellule ed elaborare le cellule per quantificare la percentuale di cellule GFP positive in un citometro a flusso.
   10. Acquisire le cellule in un citometro a flusso utilizzando il laser 488. Estrai la popolazione viva da quella e analizza la percentuale di cellule GFP positive. Quantificare l'intensità media della fluorescenza (MFI) (Figura 6, 7).

Risultati

Abbiamo ottimizzato il protocollo per la produzione di mRNA modificato con me1Ψ-UTP, la preparazione dei liposomi e gli esperimenti di trasfezione dell'mRNA con liposomi cationici in più cellule di mammifero (Figura 1). Per sintetizzare l'mRNA, il modello IVT eGFP ottimizzato per il codone di mammifero è stato amplificato dal vettore di espressione di mammifero mEGFP-N1 e purificato con il metodo dell'estrazione organica/precipitazione dell'etanolo (

Discussione

Le applicazioni terapeutiche degli mRNA non modificati sono state limitate a causa della loro emivita più breve e della loro capacità di attivare le risposte immunitarie innate intracellulari, che a loro volta portano a una scarsa espressione proteica nelle cellule trasfettate¹¹. Katalin et al. hanno dimostrato che l'RNA contenente nucleosidi modificati come m5C, m6A, ΨU e me1Ψ-UTP potrebbe evitare l'attivazione dei TLR¹². Ancora più i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Lonza	50004
Bath sonicator	DNMANM Industries	USC-100
Cationic lipid	Synthesized in the lab
Chlorofrom	MP biomedicals	67-66-3	"Caution"
Cholesterol	Himedia	GRM335
DEPC water	SRL BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA Ladder	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA sodium salt	MP biomedicals	194822
Ethanol	Hayman	F204325	"Caution"
Fetal bovine serum	Gibco	10270
Flow cytometry	BD	FACS Celesta
Fluroscence Microscope	Leica	MI6000B
Gel documentation system	Cell Biosciences	Flurochem E
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	85801	"Caution"
mEGFP-N1, Mammalian expression vector	Addgene	54767
N1-Methylpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Phenol:chloroform:isoamyl alchol (25:24:1), pH 8.0	SRL BioLit	136112-00-0	"Caution"
Phosphate Buffer Saline (PBS), pH 7.4	CellClone	CC3041
Probe sonicator	Sonics Vibra Cells	VCX130
RNA ladder	NEB	N0362S
RNase inhibitor	Thermo Scientific	N8080119
SafeView dye	abm	G108
Sodium acetate	Sigma	S7545
Thermocycler	Applied biosystems	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Tris buffer	SRL BioLit	71033
Trypsin	Gibco	25200056