使用脂质纳米颗粒将化学修饰的 mRNA 递送到哺乳动物细胞中

摘要

该方案介绍了化学修饰的 mRNA 的体外转录 （IVT）、阳离子脂质体制备以及哺乳动物细胞中脂质体启用 mRNA 转染的功能分析。

摘要

近年来，化学修饰的信使 RNA （mRNA） 已成为一种有效的核酸分子，可用于开发广泛的治疗应用，包括一类新型疫苗、蛋白质替代疗法和免疫疗法。在递送载体中，发现脂质纳米颗粒在递送 RNA 分子（例如 siRNA、miRNA、mRNA）方面更安全、更有效，并且一些产品已经投入临床使用。为了证明脂质纳米颗粒介导的 mRNA 递送，我们提出了一种优化的方案，用于合成功能性 me1Ψ-UTP 修饰的 eGFP mRNA、阳离子脂质体的制备、mRNA 与阳离子脂质体的静电复合物形成以及哺乳动物细胞中转染效率的评估。结果表明，当与阳离子脂质体一起递送时，这些修饰有效地提高了 mRNA 的稳定性，并提高了哺乳动物细胞中 eGFP mRNA 的翻译效率和稳定性。该方案可用于合成所需的 mRNA 并转染阳离子脂质体，以便在哺乳动物细胞中表达靶基因。

引言

作为一种治疗性分子，mRNA 具有多种优势，因为它具有非整合性质，并且与质粒 DNA （pDNA） 相比，它能够转染非有丝分裂细胞¹。尽管 mRNA 递送在 1990 年代初期得到证实，但由于其缺乏稳定性、缺乏免疫激活和翻译效率差，治疗应用受到限制²。最近发现的化学修饰，例如 mRNA 上的假尿苷 5'-三磷酸 （Ψ-UTP） 和甲基假尿苷 5'-三磷酸 （me1Ψ-UTP），有助于克服这些限制，彻底改变 mRNA 研究，反过来，使 mRNA 成为基础和应用研究中有前途的工具。应用范围涵盖 iPSC 的产生、疫苗接种和基因治疗 ^3,4。

在 mRNA 技术进步的同时，非病毒递送系统的重大进步使 mRNA 的递送变得有效，使该技术可用于多种治疗应用⁵。在非病毒载体中，已发现脂质纳米颗粒可有效递送核酸 ^6,7。最近，Alnylam 已获得 FDA 批准用于治疗肝脏疾病的脂质 siRNA 药物，包括用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性（hATTR 淀粉样变性）的 Patisiran 和用于治疗急性肝卟啉病 （AHP） 的 Givosiran8。在 COVID19 大流行期间，辉瑞-BioNtech 和 Moderna 的脂质封装 mRNA 疫苗证明了其有效性并获得了 FDA 的批准 ^9,10。因此，脂质驱动的 mRNA 递送具有很大的治疗潜力。

在这里，我们描述了用于生产化学修饰的体外转录 eGFP mRNA、阳离子脂质体制备、mRNA-脂质复合物优化和转染到哺乳动物细胞中的详细方案（图 1）。

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研究方案

1. me1 Ψ-UTP 修饰的 mRNA 的产生

1. 体外转录 （IVT） DNA 模板制备
   注：对于 IVT DNA 模板（T7 启动子 - 基因的开放阅读框 （ORF））制备，为目的基因设计基因特异性引物组。在基因特异性正向引物之前添加 T7 启动子 （5'-NNNNNNTAATACGACTCACTAGGNNNNNN-3'） 序列。
   1. 如 表 1 所述制备 PCR 反应混合物。
      注：至少运行四个 PCR 反应以提高 IVT 的 IVT DNA 模板浓度和质量。
   2. 用微量移液管将反应混合物完全混合，并使用微量离心机旋转。
   3. 在热循环仪上运行 表 2 中给出的 PCR 循环方案。
2. 通过有机提取/乙醇沉淀纯化 IVT DNA 模板
   1. 在 1.5 mL 微量离心管（无核酸酶）中使用 DEPC 处理过的水，将扩增的 PCR 反应混合物调节至总共 200 μL。
   2. 加入 200 μL TE 饱和苯酚/氯仿，pH 值为 8.0。剧烈涡旋 10 秒。
   3. 以 12,000 x g 离心 5 分钟以分离相，并将上层水相（约 200 μL）转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
   4. 加入 1/10^{体积 （} 20 μL） 的 3 M 乙酸钠，pH 值为 5.5 和两体积 （400 μL） 的 99-100% 乙醇。充分混匀，然后在 -20 °C 下孵育至少 30 分钟。
   5. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟，沉淀 DNA 模板。
   6. 使用微量移液管完全去除上清液，不要干扰沉淀。
   7. 向沉淀中加入 0.5 mL 75% 乙醇，倒置 5-10 次。
   8. 在 4 °C 下以 12,000 x g 的离心力离心 2 分钟。 然后用移液管完全去除乙醇，不要干扰 DNA 沉淀。
   9. 让沉淀在室温下干燥，直到沉淀变得有点半透明。
   10. 加入 20 μL 不含核酸酶的水，然后彻底重悬几秒钟。
3. 纯化的 IVT DNA 模板的质量控制
   1. 量化
      1. 使用微量分光光度计测量纯化的 IVT DNA 模板浓度和质量。
         注：预期 DNA 浓度约为 300-600 ng/μL。将 IVT DNA 模板长期储存在 -20 °C。
   2. DNA 琼脂糖凝胶电泳
      注：本实验旨在验证纯化的 IVT DNA 模板大小是否正确且无非特异性产品污染。
      1. 要制备 1% 琼脂糖凝胶，请在锥形瓶中加入 0.5 g 琼脂糖和 50 mL 1x TAE。用微波炉加热直到琼脂糖完全溶解。在室温下冷却琼脂糖 5 分钟。
      2. 向 50 mL 琼脂糖溶液中加入 1 μL 核酸染色剂（SafeView 染料）。
      3. 将琼脂糖溶液倒入带有梳子的凝胶灌注盘中，直到凝胶凝固。
      4. 从凝胶中取出梳子，将凝胶保存在 1x TAE 缓冲槽中。
      5. 将 10 μL 的 100-10000 bp DNA 分子量标准和 100-200 ng 的 PCR 纯化模板产物与 2 μL 的 6x DNA 上样缓冲液混合，总体积为 12 μL。
      6. 将每个样品加载到相应的孔中，并在 100 V 下运行至少 45-60 分钟。
      7. 在凝胶成像仪器上可视化 DNA 条带（图 2）。
4. me1Ψ-UTP 修饰 RNA 的合成
   注意：在开始此实验之前，应在 DEPC 处理的水中用 70% 乙醇清洁工作区域（层流）。使用无菌核酸酶和无内毒素的低吸附管和过滤器屏障吸头。经常将 70% 乙醇涂抹在戴手套的手上。
   1. 在室温下在 0.2 mL 试管中制备 表 3 中给出的 IVT 反应混合物，并使用微量移液器充分混合。
   2. 在微量离心机中离心试管 10 秒钟。
   3. 在 37 °C 下在热循环仪中孵育 3 小时。
5. DNase 1 处理降解 IVT DNA 模板
   1. 向 IVT 反应混合物中加入 1 μL 1 U/μL DNase 1（不含 RNase），并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
6. 通过有机提取/乙酸铵沉淀纯化 RNA
   1. 用 179 μL DEPC 处理过的水将 IVT 反应混合物的体积调节至 200 μL。
   2. 加入 200 μL TE 饱和苯酚/氯仿 pH 8.0。涡旋 10 秒。
   3. 在 25 °C 下以 12,000 x g 离心 5 分钟，以分离两相。
   4. 将上层相水性 （200 μL） 转移至 1.5 mL 试管中，加入 200 μL 5 M 乙酸铵。充分混匀，然后在冰上孵育 15 分钟以沉淀 RNA。
   5. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟，沉淀的 RNA 沉淀，然后用微量移液器完全去除上清液。
   6. 使用 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀并倒置 5-10 次。在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 5 分钟。
   7. 用微量移液管完全去除上清液，不要干扰 RNA 沉淀。
   8. 让沉淀在室温下干燥，直到沉淀变成半透明。然后将沉淀重新悬浮在 60-75 μL 不含 RNase 的水中。
7. 纯化 RNA 的质量控制
   1. 量化
      1. 使用微量分光光度计测量纯化的 RNA 浓度和质量。
         注：每个反应未修饰的 RNA 的预期 RNA 产量为 140-180 μg，me1Ψ-UTP 修饰的 RNA 的预期产量为 100-150 μg，具体取决于目标基因的大小和 IVT DNA 模板的质量。最佳质量应为 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 比率约为 1.9-2.0 和 OD₂₆₀/OD₂₃₀ 比率 >2.0。将 RNA 在 -20 °C 下短时间储存。
   2. 变性 RNA 琼脂糖凝胶电泳
      注：进行该实验是为了验证合成的 RNA 是否具有正确的长度并且没有 IVT 副产物污染。
      1. 要制备 1% 琼脂糖凝胶，请在锥形瓶中加入 0.5 g 琼脂糖和 50 mL 1x TAE。用微波炉加热溶液，直到琼脂糖完全溶解。将琼脂糖溶液在室温下放置 5 分钟以冷却。
      2. 向 50 mL 1% 琼脂糖溶液中加入 1 μL 核酸染色剂。
      3. 用梳子将琼脂糖溶液倒入凝胶灌注盘中，放置直至凝胶凝固。
      4. 从凝胶中取出梳子，将凝胶保存在 1x TAE 缓冲槽中。
      5. 如 表 4 所述制备 RNA 上样染料样品。
      6. 将样品在 65 °C 下加热 10 分钟，然后将样品置于冰上。
      7. 将每个样品加载到相应的孔中，并在 100 V 下运行至少 45-60 分钟。
      8. 在凝胶成像仪器上可视化 RNA 条带（图 3）。
8. 通过酶基加帽和poly-A尾法合成me1Ψ-UTP修饰的mRNA
   注：使用酶法对 IVT RNA 的加帽效率为 100%。因此，我们在该方案中在 mRNA 合成中使用了 Cap-1 的酶加帽。我们添加了每个分子长度为 >150 A 碱基的 poly-A 尾部，以提高 mRNA 的翻译效率。
   1. 加入 55-60 μg 纯化的 IVT RNA，并在 1.5 mL 试管中用不含 RNase 的水使其定量至 72 μL。
   2. 在 65 °C 下，在热混合器中使 RNA 变性 10 分钟，然后立即将试管置于冰上 5 分钟。
   3. 同时，制备加帽反应混合物，如 表 5 所示。
   4. 将加帽反应混合物和 4 μL 加帽酶添加到变性的 RNA 中，并通过微量移液管充分混合。在微量离心机中离心试管 10 秒钟。
   5. 将反应混合物在 37 °C 下孵育 2 小时。
   6. 2 小时后，将试管放在冰上，并按照 表 6 中给出的 Poly A 尾矿预混液制备。
   7. 将 Poly A 尾矿预混液添加到加帽的 RNA 溶液中，并通过微量移液管充分混合。在微量离心机中离心试管 10 秒钟。
   8. 将反应混合物在 37 °C 下孵育 2 小时。
      注：mRNA 可以立即进一步纯化，或者粗 mRNA 可以在 -20 °C 下储存过夜。
9. IVT mRNA 纯化
   1. 如方案第 1.6 节所示，通过有机提取/乙酸铵沉淀纯化 mRNA。
   2. 用 60 μL 不含 RNase 的水重悬 mRNA 沉淀。
10. 纯化 mRNA 的质量控制
    1. 遵循协议第 1.7 节中描述的质量控制协议。
       注：由于在变性 RNA 琼脂糖凝胶电泳中添加了 Poly-A 拖尾，因此 mRNA 条带应出现在 RNA 条带上方（图 3）。此外，Poly-A 拖尾会增加 mRNA 产量（应> RNA 浓度）。定量后，将多个等分试样的 mRNA 以 1 μg/μL 的浓度放入，并立即储存在 -80 °C 下。 避免 RNA 的多次冻融循环，以防止合成的 mRNA 降解。

2. 阳离子脂质体的制备和体外 mRNA 转染特性的评价

1. 脂质体制备
   1. 对于制备 1 mM 阳离子脂质体，使用阳离子脂质：DOPE：胆固醇，摩尔比为 1：1：0.5。
   2. 将阳离子脂质、胆固醇和 DOPE（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺）的适当摩尔比溶解在玻璃瓶中的氯仿 （200 μL） 中。
   3. 使用细流的无水分氮气去除溶剂。
   4. 将干燥的脂质置于高真空下进一步干燥 2 小时。
   5. 真空干燥后，向干燥的脂质中加入 1 mL 无菌去离子水，让混合物膨胀过夜。
   6. 在室温下涡旋样品瓶以制备多单层囊泡 （MUV）。
   7. 使用浴超声处理，然后以 25 W 功率进行探针超声处理，从多个单层囊泡 （MUV） 制备小的单层囊泡 （SUV）。
      注意：SUV 应看起来像半透明的脂质体溶液。如果没有，请以 1 分钟的间隔增加打开和关闭 30 秒脉冲的数量。流体动力学直径和表面电位在粒度分析仪中测量（图 4）。
2. mRNA/脂质体复合物形成和凝胶阻滞测定
   1. 为了制备从 1：1 到 8：1 的不同脂质-RNA 电荷比，如 表 7 所示，分别在去离子水中稀释 mRNA 和阳离子脂质体。
   2. 如 表 7 所示，将稀释的 mRNA 与脂质体溶液混合，并在室温下孵育 10 分钟以形成脂质体。
   3. 将 20 μL 2x RNA 上样染料加入复合物中并加载到孔中。单独的 mRNA 用作对照。
   4. 将样品上样到溶于 1x TAE 缓冲液中的 1% 琼脂糖凝胶上，并在 100 V 下运行 45 分钟。
   5. 在凝胶成像仪器上可视化 RNA 条带（图 5）。
3. 体外 mRNA 转染
   1. 在 48 孔板的完全培养基中每孔接种 45,000 个哺乳动物细胞，然后在 37 °C 下孵育 16 至 20 小时的转染。
   2. 16 至 20 小时后，检查细胞密度。转染时，细胞汇合度应在 80% 左右。
   3. 向 0.5 mL 试管中，在不含血清的 DMEM 培养基中加入 150 ng 阳离子脂质体和 mRNA 电荷比为 1：1 的 GFP 蛋白编码 mRNA 复合物。总体积高达 20 μL。
   4. 在室温下孵育 10 分钟。
   5. 将脂质复合物加入细胞中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中孵育 4 小时。
   6. 在不干扰细胞的情况下去除培养基。向每个孔中加入 250 μL 含 10% FBS 的完全培养基（表 8）。
   7. 转染 72 小时后，在荧光显微镜下观察 GFP 表达（图 6、7）。
   8. 为了量化 GFP 表达，处理细胞以进行流式细胞仪分析。
   9. 取出培养基并用 1x PBS 洗涤两次。胰蛋白酶消化细胞并处理细胞，以定量流式细胞仪中 GFP 阳性细胞的百分比。
   10. 使用 Laser 488 在流式细胞仪中采集细胞。从中对活种群进行门控并分析 GFP 阳性细胞的百分比。量化平均荧光强度 （MFI）（图 6、7）。

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结果

我们优化了 me1Ψ-UTP 修饰的 mRNA 生产、脂质体制备和阳离子脂质体向多个哺乳动物细胞中进行 mRNA 转染实验的方案（图 1）。为了合成 mRNA，从 mEGFP-N1 哺乳动物表达载体中扩增哺乳动物密码子优化的 eGFP IVT 模板，并通过有机提取/乙醇沉淀法纯化（图 2）。后来，通过 IVT 过程产生 me1Ψ-UTP 修饰的 RNA 和 mRNA。变性 RNA 琼脂糖凝胶电...

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讨论

由于未修饰的 mRNA 的半衰期较短，并且能够激活细胞内先天免疫反应，这反过来又会导致转染细胞中的蛋白质表达不良，因此其治疗应用受到限制¹¹。Katalin 等人证明，含有修饰核苷（如 m5C、m6A、ΨU 和 me1Ψ-UTP）的 RNA 可以避免 TLR 激活¹²。更重要的是，在 IVT mRNA 中掺入 ΨU 或 me1Ψ-UTP 显示出靶蛋白的卓越翻译效率，提高了室温下的稳定性...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Lonza	50004
Bath sonicator	DNMANM Industries	USC-100
Cationic lipid	Synthesized in the lab
Chlorofrom	MP biomedicals	67-66-3	"Caution"
Cholesterol	Himedia	GRM335
DEPC water	SRL BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA Ladder	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA sodium salt	MP biomedicals	194822
Ethanol	Hayman	F204325	"Caution"
Fetal bovine serum	Gibco	10270
Flow cytometry	BD	FACS Celesta
Fluroscence Microscope	Leica	MI6000B
Gel documentation system	Cell Biosciences	Flurochem E
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	85801	"Caution"
mEGFP-N1, Mammalian expression vector	Addgene	54767
N1-Methylpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Phenol:chloroform:isoamyl alchol (25:24:1), pH 8.0	SRL BioLit	136112-00-0	"Caution"
Phosphate Buffer Saline (PBS), pH 7.4	CellClone	CC3041
Probe sonicator	Sonics Vibra Cells	VCX130
RNA ladder	NEB	N0362S
RNase inhibitor	Thermo Scientific	N8080119
SafeView dye	abm	G108
Sodium acetate	Sigma	S7545
Thermocycler	Applied biosystems	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Tris buffer	SRL BioLit	71033
Trypsin	Gibco	25200056