Utilisation de nanoparticules lipidiques pour l’administration d’ARNm chimiquement modifiés dans des cellules de mammifères

Résumé

Le protocole présente la transcription in vitro (IVT) d’ARNm chimiquement modifié, la préparation de liposomes cationiques et l’analyse fonctionnelle des transfections d’ARNm activées par les liposomes dans des cellules de mammifères.

Résumé

Au cours des dernières années, l’ARN messager chimiquement modifié (ARNm) est apparu comme une puissante molécule d’acide nucléique pour le développement d’un large éventail d’applications thérapeutiques, y compris une nouvelle classe de vaccins, des thérapies de remplacement des protéines et des thérapies immunitaires. Parmi les vecteurs d’administration, les nanoparticules lipidiques se sont avérées plus sûres et plus efficaces pour délivrer des molécules d’ARN (par exemple, siRNA, miARN, mRNA) et quelques produits sont déjà utilisés en clinique. Pour démontrer l’administration d’ARNm médiée par des nanoparticules lipidiques, nous présentons un protocole optimisé pour la synthèse d’ARNm eGFP fonctionnels modifiés par me1Ψ-UTP, la préparation de liposomes cationiques, la formation de complexes électrostatiques d’ARNm avec des liposomes cationiques et l’évaluation de l’efficacité de la transfection dans les cellules de mammifères. Les résultats démontrent que ces modifications améliorent efficacement la stabilité de l’ARNm lorsqu’il est administré avec des liposomes cationiques et augmentent l’efficacité et la stabilité de la traduction de l’ARNm eGFP dans les cellules de mammifères. Ce protocole peut être utilisé pour synthétiser l’ARNm souhaité et le transfecter avec des liposomes cationiques pour l’expression des gènes cibles dans les cellules de mammifères.

Introduction

En tant que molécule thérapeutique, l’ARNm offre plusieurs avantages en raison de sa nature non intégrative et de sa capacité à transfecter des cellules non mitotiques par rapport à l’ADN plasmidique (ADNp⁾¹. Bien que l’administration d’ARNm ait été démontrée au début des années 1990, les applications thérapeutiques étaient limitées en raison de son manque de stabilité, de son manque d’activation immunitaire et de sa faible efficacité translationnelle². Des modifications chimiques récemment identifiées, telles que la pseudouridine 5'-triphosphate (Ψ-UTP) et la méthyl pseudouridine 5'-triphosphate (me1Ψ-UTP) sur l’ARNm, ont aidé à surmonter ces limitations, révolutionné la recherche sur l’ARNm et, à son tour, a fait de l’ARNm un outil prometteur dans la recherche fondamentale et appliquée. La gamme d’applications couvre la génération d’iPSC à la vaccination et à la thérapie génique ^3,4.

Parallèlement aux progrès de la technologie de l’ARNm, des progrès significatifs dans les systèmes d’administration non viraux ont rendu l’administration de l’ARNm efficace, rendant cette technologie réalisable pour de multiples applications thérapeutiques⁵. Parmi les vecteurs non viraux, les nanoparticules lipidiques se sont avérées efficaces pour délivrer des acides nucléiques ^6,7. Récemment, Alnylam a reçu l’approbation de la FDA pour des médicaments à ARNi à base de lipides pour le traitement des maladies du foie, notamment le Patisiran pour l’amylose héréditaire médiée par la transthyrétine (amylose hATTR) et le Givosiran pour les porphyries hépatiques aiguës (AHP)⁸. Au cours de la pandémie de COVID19, les vaccins à base d’ARNm encapsulés dans des lipides de Pfizer-BioNtech et de Moderna ont démontré leur efficacité et ont reçu les approbations de la FDA ^9,10. Ainsi, l’administration d’ARNm activée par les lipides a un grand potentiel thérapeutique.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la production d’ARNm eGFP chimiquement modifié, transcrit in vitro, la préparation de liposomes cationiques, l’optimisation du complexe ARNm-lipide et les transfections dans des cellules de mammifères (Figure 1).

Protocole

1. Production d’ARNm modifié par me1 Ψ-UTP

1. Préparation de matrice d’ADN de transcription in vitro (IVT)
   REMARQUE : Pour la préparation d’un modèle d’ADN IVT (promoteur T7 - cadre de lecture ouvert (ORF) du gène), concevez un ensemble d’amorces spécifiques au gène pour le gène d’intérêt. Ajouter la séquence du promoteur T7 (5'-NNNNNNNTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3') avant l’amorce directe spécifique au gène.
   1. Préparez le mélange réactionnel PCR comme décrit dans le tableau 1.
      REMARQUE : Exécutez au moins quatre réactions PCR pour augmenter la concentration et la qualité de la matrice d’ADN IVT.
   2. Mélangez complètement le mélange réactionnel à l’aide d’une micropipette et faites-le tourner à l’aide d’un microfuge.
   3. Exécutez le protocole de cyclage PCR indiqué dans le tableau 2 sur un thermocycleur.
2. Purification de la matrice d’ADN IVT par extraction organique/précipitation à l’éthanol
   1. Ajuster le mélange réactionnel PCR amplifié à 200 μL au total en utilisant de l’eau traitée au DEPC dans un tube microfuge de 1,5 mL (sans nucléase).
   2. Ajouter 200 μL de phénol/chloroforme saturé en TE, pH 8,0. Vortex vigoureusement pendant 10 secondes.
   3. Centrifuger à 12 000 x g pendant 5 minutes pour séparer les phases et transférer la phase supérieure aqueuse (environ 200 μL) dans un nouveau tube de microfuge de 1,5 mL.
   4. Ajouter 1/10^e (20 μL) d’acétate de sodium 3 M, pH 5,5 et deux volumes (400 μL) d’éthanol à 99-100 %. Bien mélanger puis incuber pendant au moins 30 minutes à -20 °C.
   5. Granulez la matrice d’ADN par centrifugation à 12 000 x g pendant 15 minutes à 4 °C.
   6. Retirez complètement le surnageant sans déranger la pastille à l’aide d’une micropipette.
   7. Ajoutez 0,5 ml d’éthanol à 75 % dans la pastille et retournez-la 5 à 10 fois.
   8. Centrifuger pendant 2 minutes à 12 000 x g à 4 °C. Ensuite, retirez complètement l’éthanol à l’aide d’une pipette sans déranger la pastille d’ADN.
   9. Laissez sécher le granulé à température ambiante jusqu’à ce qu’il devienne un peu translucide.
   10. Ajoutez 20 μL d’eau sans nucléase et remettez complètement en suspension pendant quelques secondes.
3. Contrôle de la qualité de la matrice d’ADN IVT purifié
   1. Quantification
      1. Mesurez la concentration et la qualité de l’ADN IVT purifié à l’aide d’un micro-spectrophotomètre.
         REMARQUE : La concentration d’ADN attendue sera d’environ 300-600 ng/μL. Conservez la matrice d’ADN IVT à -20 °C à long terme.
   2. Électrophorèse sur gel d’agarose à ADN
      REMARQUE : Cette expérience vise à vérifier si la matrice d’ADN IVT purifiée est de la bonne taille et exempte de contamination non spécifique du produit.
      1. Pour préparer un gel d’agarose à 1 %, ajoutez 0,5 g d’agarose et 50 ml de 1x TAE dans une fiole conique. Passez au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement. Refroidissez l’agarose à température ambiante pendant 5 minutes.
      2. Ajouter 1 μL de colorant d’acide nucléique (colorant SafeView) pour une solution d’agarose de 50 ml.
      3. Versez la solution d’agarose dans un plateau de coulée de gel à l’aide d’un peigne et laissez-la jusqu’à ce que le gel se solidifie.
      4. Retirez le peigne du gel et conservez le gel dans le réservoir tamponné 1x TAE.
      5. Mélangez 10 μL d’échelle d’ADN de 100 à 10000 pb et 100 à 200 ng de produit de matrice purifié PCR avec 2 μL de tampon de charge d’ADN 6x pour un volume total de 12 μL.
      6. Chargez chaque échantillon sur les puits respectifs et faites-le fonctionner à 100 V pendant au moins 45 à 60 minutes.
      7. Visualisez les bandes d’ADN sur un instrument de documentation sur gel (Figure 2).
4. Synthèse de l’ARN modifié me1Ψ-UTP
   REMARQUE : Avant de commencer cette expérience, la zone de travail (flux d’air laminaire) doit être nettoyée avec de l’éthanol à 70 % dans de l’eau traitée au DEPC. Utilisez des tubes stériles à faible rétention sans nucléases ni endotoxines et des embouts de barrière filtrante. Appliquez fréquemment de l’éthanol à 70 % sur les mains gantées.
   1. Préparez le mélange réactionnel IVT comme indiqué dans le tableau 3 à température ambiante dans un tube de 0,2 mL et mélangez-le soigneusement à l’aide d’une micropipette.
   2. Faites tourner le tube pendant 10 secondes dans un microfuge.
   3. Incuber à 37 °C pendant 3 heures dans un thermocycleur.
5. Dégradation de la matrice d’ADN IVT par traitement DNase 1
   1. Ajouter 1 μL de DNase 1 U/μL (sans RNase) dans le mélange réactionnel IVT et incuber à 37 °C pendant 30 minutes.
6. Purification de l’ARN par extraction organique/précipitation de l’acétate d’ammonium
   1. Ajustez le volume du mélange réactionnel IVT à 200 μL avec 179 μL d’eau traitée au DEPC.
   2. Ajouter 200 μL de phénol/chloroforme saturé en TE pH 8,0. Vortex pendant 10 secondes.
   3. Centrifuger à 12 000 x g pendant 5 minutes à 25 °C pour séparer les deux phases.
   4. Transférez la phase supérieure aqueuse (200 μL) dans un tube de 1,5 mL et ajoutez 200 μL d’acétate d’ammonium 5 M. Bien mélanger puis incuber 15 minutes sur de la glace pour précipiter l’ARN.
   5. Granulez l’ARN précipité par centrifugation à 12 000 x g pendant 15 minutes à 4 °C et retirez complètement le surnageant à l’aide d’une micropipette.
   6. Lavez la pastille d’ARN en utilisant de l’éthanol à 70 % et retournez-la 5 à 10 fois. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C.
   7. Retirez complètement le surnageant à l’aide d’une micropipette sans déranger la pastille d’ARN.
   8. Laissez sécher le granulé à température ambiante jusqu’à ce qu’il devienne semi-translucide. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 60-75 μL d’eau sans RNase.
7. Contrôle de la qualité de l’ARN purifié
   1. Quantification
      1. Mesurez la concentration et la qualité de l’ARN purifié à l’aide d’un micro-spectrophotomètre.
         REMARQUE : Le rendement attendu en ARN sera de 140 à 180 μg pour l’ARN non modifié et de 100 à 150 μg pour l’ARN modifié me1Ψ-UTP par réaction, en fonction de la taille du gène d’intérêt et de la qualité de la matrice d’ADN IVT. La qualité optimale doit être un rapport OD₂₆₀/OD₂₈₀ d’environ 1,9-2,0 et un rapport OD₂₆₀/OD₂₃₀ >2,0. Stockez l’ARN à -20 °C pendant une courte période.
   2. Électrophorèse sur gel d’agarose à ARN dénaturant
      REMARQUE : Cette expérience est réalisée pour vérifier si l’ARN synthétisé est de la bonne longueur et exempt de contamination par les sous-produits de l’IVT.
      1. Pour préparer un gel d’agarose à 1 %, ajoutez 0,5 g d’agarose et 50 ml de 1x TAE dans une fiole conique. Passez la solution au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute. Conservez la solution d’agarose à température ambiante pendant 5 minutes pour qu’elle refroidisse.
      2. Ajouter 1 μL de colorant d’acide nucléique pour 50 ml de solution d’agarose à 1 %.
      3. Versez la solution d’agarose dans le plateau de coulée de gel à l’aide d’un peigne et laissez-la jusqu’à ce que le gel se solidifie.
      4. Retirez le peigne du gel et conservez le gel dans le réservoir tamponné 1x TAE.
      5. Préparez l’échantillon de colorant de charge d’ARN comme décrit dans le tableau 4.
      6. Chauffer les échantillons à 65 °C pendant 10 minutes, puis les conserver sur de la glace.
      7. Chargez chaque échantillon sur les puits respectifs et faites-le fonctionner à 100 V pendant au moins 45 à 60 minutes.
      8. Visualiser les bandes d’ARN sur un instrument de documentation sur gel (Figure 3).
8. Synthèse d’ARNm modifié par me1Ψ-UTP par coiffage enzymatique et résidus poly-A
   REMARQUE : L’efficacité de plafonnement de l’ARN IVT à l’aide de la méthode enzymatique est de 100 %. Par conséquent, nous avons utilisé la coiffe enzymatique de Cap-1 dans la synthèse de l’ARNm dans ce protocole. Nous avons ajouté des queues poly-A à une longueur de >150 bases A par molécule pour améliorer l’efficacité translationnelle de l’ARNm.
   1. Ajoutez 55 à 60 μg d’ARN IVT purifié et augmentez jusqu’à 72 μL avec de l’eau libre de RNase dans un tube de 1,5 ml.
   2. Dénaturez l’ARN à 65 °C pendant 10 minutes dans un thermomixeur, puis placez immédiatement le tube sur de la glace pendant 5 minutes.
   3. Pendant ce temps, préparez le mélange de réaction de bouchage comme indiqué dans le tableau 5.
   4. Ajouter le mélange de réaction de coiffage et 4 μL d’enzyme de coiffage à l’ARN dénaturé et bien mélanger à l’aide d’une micropipette. Faites tourner le tube pendant 10 secondes dans un microfuge.
   5. Incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 2 heures.
   6. Après 2 heures, gardez le tube sur de la glace et préparez le mélange maître de résidus Poly A comme indiqué dans le tableau 6.
   7. Ajouter le mélange maître de résidus Poly A à la solution d’ARN bouché et bien mélanger à l’aide d’une micropipette. Faites tourner le tube pendant 10 secondes dans un microfuge.
   8. Incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 2 heures.
      REMARQUE : L’ARNm peut être soumis à une purification immédiate, ou l’ARNm brut peut être stocké à -20 °C pendant la nuit.
9. Purification de l’ARNm IVT
   1. Purifier l’ARNm par extraction organique/précipitation d’acétate d’ammonium comme indiqué dans la section 1.6 du protocole.
   2. Remettez la pastille d’ARNm en suspension avec 60 μL d’eau sans RNase.
10. Contrôle de la qualité de l’ARNm purifié
    1. Suivez le protocole de contrôle de la qualité décrit à la section 1.7 du protocole.
       REMARQUE : La bande d’ARNm doit apparaître au-dessus de la bande d’ARN en raison de l’ajout de résidus Poly-A dans l’électrophorèse sur gel d’agarose d’ARN dénaturant (Figure 3). De plus, les résidus Poly-A augmentent le rendement en ARNm (devrait être > concentration d’ARN). Après la quantification, mettre plusieurs aliquotes d’ARNm à une concentration de 1 μg/μL et les stocker immédiatement à -80 °C. Évitez les multiples cycles de congélation et de décongélation de l’ARN pour éviter la dégradation de l’ARNm synthétisé.

2. Préparation de liposomes cationiques et évaluation des propriétés de transfection in vitro de l’ARNm

1. Préparation des liposomes
   1. Pour la préparation de 1 mM de liposome cationique, utilisez un lipide cationique : DOPE : cholestérol dans le rapport molaire de 1:1:0,5.
   2. Dissoudre les rapports molaires appropriés du lipide cationique, du cholestérol et de la DOPE (1,2-dioléoyl-sn-glycérol-3-phosphoéthanolamine) dans le chloroforme (200 μL) dans un flacon en verre.
   3. Utilisez un faible flux d’azote gazeux sans humidité pour l’élimination des solvants.
   4. Conservez les lipides séchés sous vide poussé pour un séchage supplémentaire pendant 2 heures.
   5. Ajoutez 1 ml d’eau déminéralisée stérile aux lipides séchés après le séchage sous vide et laissez le mélange gonfler pendant la nuit.
   6. Vortex le flacon à température ambiante pour former des vésicules multi-unilamellaires (MUV).
   7. Utilisez la sonication par bain suivie d’une sonication par sonde à une puissance de 25 W pour fabriquer de petites vésicules unilamellaires (SUV) à partir de vésicules unilamellaires multiples (MUV).
      REMARQUE : Les SUV doivent ressembler à une solution de liposome translucide. Si ce n’est pas le cas, augmentez le nombre d’impulsions de 30 secondes avec un intervalle de 1 min. Les diamètres hydrodynamiques et les potentiels de surface sont mesurés (Figure 4) dans un analyseur de taille de particules.
2. Formation de complexes ARNm/liposomes et test de retard sur gel
   1. Pour la préparation de différents rapports de charge lipide-ARN de 1:1 à 8:1, diluer l’ARNm et le liposome cationique dans de l’eau désionisée séparément, comme indiqué dans le tableau 7.
   2. Mélangez l’ARNm dilué à la solution de liposomes comme indiqué dans le tableau 7 et incubez-le pendant 10 minutes à température ambiante pour la formation de lipoplex.
   3. Ajoutez 20 μL de colorant de charge 2x ARN dans le complexe et chargez dans le puits. L’ARNm seul sert de contrôle.
   4. Chargez les échantillons sur un gel d’agarose à 1 % dans 1 tampon TAE et faites-le fonctionner à 100 V pendant 45 minutes.
   5. Visualisez les bandes d’ARN sur un instrument de documentation sur gel (Figure 5).
3. Transfection in vitro de l’ARNm
   1. Ensemencer 45 000 cellules de mammifères par puits de 48 plaques de puits dans un milieu complet, puis incuber à 37 °C pendant 16 à 20 heures de transfection.
   2. Après 16 à 20 heures, vérifiez la densité cellulaire. Au moment de la transfection, la confluence cellulaire doit être d’environ 80 %.
   3. Dans des tubes de 0,5 ml, ajoutez 150 ng de complexe d’ARNm codant pour la protéine GFP avec un rapport de charge de 1:1 de liposomes cationiques et d’ARNm dans un milieu DMEM sans sérum. Le volume total peut atteindre 20 μL.
   4. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes.
   5. Ajoutez du lipoplex dans les cellules et incubez-le pendant 4 heures dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ .
   6. Retirez le support sans déranger les cellules. Ajouter 250 μL de milieu complet avec 10 % de FBS (tableau 8) dans chaque puits.
   7. Après 72 heures de transfection, observez l’expression de la GFP au microscope fluorescent (Figure 6, 7).
   8. Pour quantifier l’expression de la GFP, traitez les cellules pour l’analyse par cytomètre en flux.
   9. Retirez le support et lavez-le deux fois avec 1x PBS. Trypsinisez les cellules et traitez-les pour quantifier le pourcentage de cellules GFP positives dans un cytomètre en flux.
   10. Acquérez les cellules dans un cytomètre en flux à l’aide du laser 488. Contrôlez la population vivante à partir de cela et analysez le pourcentage de cellules positives à la GFP. Quantifier l’intensité moyenne de la fluorescence (MFI) (figures 6, 7).

Résultats

Nous avons optimisé le protocole pour les expériences de production d’ARNm modifiés, de préparation de liposomes et de transfection d’ARNm avec des liposomes cationiques dans plusieurs cellules de mammifères (Figure 1). Pour synthétiser l’ARNm, la matrice eGFP IVT optimisée par le codon de mammifère a été amplifiée à partir du vecteur d’expression de mammifère mEGFP-N1 et purifiée par la méthode d’extraction organique/précipitation ...

Discussion

Les applications thérapeutiques des ARNm non modifiés ont été limitées en raison de leur demi-vie plus courte et de leur capacité à activer les réponses immunitaires innées intracellulaires, ce qui entraîne à son tour une faible expression des protéines dans les cellules transfectées¹¹. Katalin et al. ont démontré qu’un ARN contenant des nucléosides modifiés tels que m5C, m6A, ΨU et me1Ψ-UTP pouvait empêcher l’activation de TLR

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Lonza	50004
Bath sonicator	DNMANM Industries	USC-100
Cationic lipid	Synthesized in the lab
Chlorofrom	MP biomedicals	67-66-3	"Caution"
Cholesterol	Himedia	GRM335
DEPC water	SRL BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA Ladder	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA sodium salt	MP biomedicals	194822
Ethanol	Hayman	F204325	"Caution"
Fetal bovine serum	Gibco	10270
Flow cytometry	BD	FACS Celesta
Fluroscence Microscope	Leica	MI6000B
Gel documentation system	Cell Biosciences	Flurochem E
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	85801	"Caution"
mEGFP-N1, Mammalian expression vector	Addgene	54767
N1-Methylpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Phenol:chloroform:isoamyl alchol (25:24:1), pH 8.0	SRL BioLit	136112-00-0	"Caution"
Phosphate Buffer Saline (PBS), pH 7.4	CellClone	CC3041
Probe sonicator	Sonics Vibra Cells	VCX130
RNA ladder	NEB	N0362S
RNase inhibitor	Thermo Scientific	N8080119
SafeView dye	abm	G108
Sodium acetate	Sigma	S7545
Thermocycler	Applied biosystems	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Tris buffer	SRL BioLit	71033
Trypsin	Gibco	25200056