JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מציג שעתוק במבחנה (IVT) של mRNA שעבר שינוי כימי, הכנת ליפוזום קטיוני וניתוח פונקציונלי של טרנספקציות mRNA המופעלות על ידי ליפוזום בתאי יונקים.

Abstract

בשנים האחרונות, RNA שליח מהונדס כימית (mRNA) התגלה כמולקולת חומצת גרעין חזקה לפיתוח מגוון רחב של יישומים טיפוליים, כולל סוג חדש של חיסונים, טיפולים בתחליפי חלבון וטיפולים חיסוניים. בקרב וקטורי המסירה, ננו-חלקיקי שומנים נמצאו בטוחים ויעילים יותר בהעברת מולקולות RNA (למשל, siRNA, miRNA, mRNA) וכמה מוצרים כבר נמצאים בשימוש קליני. כדי להדגים אספקת mRNA בתיווך ננו-חלקיקי שומנים, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי לסינתזה של mRNA eGFP מותאם me1Ψ-UTP פונקציונלי, הכנת ליפוזומים קטיוניים, היווצרות מורכבת אלקטרוסטטית של mRNA עם ליפוזומים קטיוניים, והערכת יעילות הטרנספקציה בתאי יונקים. התוצאות מדגימות כי שינויים אלה שיפרו ביעילות את יציבות ה-mRNA כאשר הם מועברים עם ליפוזומים קטיוניים והגדילו את יעילות ויציבות תרגום ה-mRNA של eGFP בתאי יונקים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסנתז את ה-mRNA הרצוי ולהעביר עם ליפוזומים קטיוניים לביטוי גן מטרה בתאי יונקים.

Introduction

כמולקולה טיפולית, mRNA מציע מספר יתרונות בשל אופיו הלא אינטגרטיבי ויכולתו להעביר תאים לא מיטוטיים בהשוואה ל-DNA פלסמיד (pDNA)1. למרות שהעברת mRNA הודגמה בתחילת שנות ה-90, היישומים הטיפוליים היו מוגבלים בשל חוסר היציבות שלו, היעדר הפעלה חיסונית ויעילות תרגומית ירודה2. שינויים כימיים שזוהו לאחרונה, כגון פסאודורידין 5'-טריפוספט (Ψ-UTP) ומתיל פסאודורידין 5'-טריפוספט (me1Ψ-UTP) ב-mRNA, עזרו להתגבר על מגבלות אלה, חוללו מהפכה במחקר ה-mRNA, ובתורם, הפכו את ה-mRNA לכלי מבטיח במחקר בסיסי ויישומי כאחד. מגוון היישומים מכסה את הייצור של iPSCs לחיסון וטיפול גנטי 3,4.

במקביל להתקדמות בטכנולוגיית ה-mRNA, התקדמות משמעותית במערכות אספקה לא ויראליות הפכה את אספקת ה-mRNA ליעילה, מה שהופך את הטכנולוגיה הזו לאפשרית עבור יישומים טיפוליים מרובים5. בין הווקטורים הלא ויראליים, ננו-חלקיקי שומנים נמצאו יעילים בהעברת חומצות גרעין 6,7. לאחרונה, Alnylam קיבלה את אישור ה-FDA לתרופות siRNA מבוססות שומנים לטיפול במחלות כבד, כולל Patisiran לעמילואידוזיס תורשתי בתיווך טרנסתירטין (hATTR amyloidosis) ו-Givosiran לפורפיריות כבד חריפות (AHP)8. במהלך מגיפת COVID19, חיסונים מבוססי mRNA עטופים בשומנים של פייזר-ביונטק ומודרנה הוכיחו את יעילותם וקיבלו אישורי FDA 9,10. לפיכך, לאספקת mRNA המופעלת על ידי ליפידים יש פוטנציאל טיפולי גדול.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לייצור mRNA eGFP מהונדס כימית, מתומלל במבחנה, הכנת ליפוזום קטיוני, אופטימיזציה של קומפלקס mRNA-ליפידים וטרנספקציות לתאי יונקים (איור 1).

Protocol

1. ייצור mRNA שונה me1 Ψ-UTP

  1. הכנת תבנית DNA של שעתוק במבחנה (IVT)
    הערה: להכנת תבנית IVT DNA (מקדם T7 - מסגרת קריאה פתוחה (ORF) של הגן), תכנן ערכת פריימר ספציפית לגן המעניין. הוסף את רצף מקדם T7 (5'-NNNNNNTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3') לפני פריימר קדימה ספציפי לגן.
    1. הכן תערובת תגובת PCR כמתואר בטבלה 1.
      הערה: הפעל לפחות ארבע תגובות PCR כדי להגדיל את ריכוז תבנית ה-DNA של IVT ואיכותו עבור IVT.
    2. מערבבים לחלוטין את תערובת התגובה עם מיקרופיפטה ומסובבים כלפי מטה בעזרת מיקרופוגה.
    3. הפעל את פרוטוקול הרכיבה PCR המופיע בטבלה 2 על מחזורי תרמית.
  2. טיהור תבנית DNA IVT על ידי מיצוי אורגני/משקעי אתנול
    1. התאם את תערובת תגובת ה-PCR המוגברת ל-200 מיקרוליטר בסך הכל באמצעות מים שטופלו ב-DEPC בצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל (ללא נוקלאז).
    2. יש להוסיף 200 מיקרוליטר פנול/כלורופורם רווי TE, pH 8.0. מערבולת נמרצת במשך 10 שניות.
    3. צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות כדי להפריד את השלבים ולהעביר את השלב העליון המימי (כ-200 מיקרוליטר) לצינור מיקרופוגה חדש של 1.5 מ"ל.
    4. הוסף נפח 1/10( 20 מיקרוליטר) של 3 M נתרן אצטט, pH 5.5 ושני נפחים (400 מיקרוליטר) של 99-100% אתנול. מערבבים היטב ואז דוגרים לפחות 30 דקות בחום של -20 מעלות צלזיוס.
    5. גלולה את תבנית ה-DNA על ידי צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    6. הסר את הסופרנטנט לחלוטין מבלי להפריע לגלולה באמצעות מיקרופיפטה.
    7. הוסף 0.5 מ"ל של 75% אתנול לגלולה והפוך 5-10 פעמים.
    8. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-12,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את האתנול לחלוטין בעזרת פיפטה מבלי להפריע ל- DNApellet.
    9. הניחו לגלולה להתייבש בטמפרטורת החדר עד שהגלולה הופכת מעט שקופה.
    10. הוסף 20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז והשהה מחדש היטב למשך מספר שניות.
  3. בקרת איכות לתבנית ה-IVT DNA המטוהרת
    1. כימות
      1. למדוד את הריכוז והאיכות של תבנית DNA IVT מטוהרת באמצעות מיקרו-ספקטרופוטומטר.
        הערה: ריכוז ה-DNA הצפוי יהיה בסביבות 300-600 ננוגרם/מיקרוליטר. אחסן את תבנית ה-IVT DNA ב-20 מעלות צלזיוס לטווח הארוך.
    2. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז DNA
      הערה: ניסוי זה נועד לוודא אם תבנית ה-IVT DNA המטוהרת היא בגודל הנכון ונטולת זיהום מוצר לא ספציפי.
      1. להכנת ג'ל אגרוז 1%, הוסיפו 0.5 גרם אגרוז ו -50 מ"ל של 1x TAE בבקבוק חרוטי. מיקרוגל אותו עד שהאגרוז נמס לחלוטין. מצננים את האגרוז בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      2. הוסף 1 מיקרוליטר של כתם חומצת גרעין (צבע SafeView) לתמיסת אגרוז של 50 מ"ל.
      3. יוצקים את תמיסת האגרוז למגש יציקת ג'ל בעזרת מסרק ומשאירים אותה עד שהג'ל מתמצק.
      4. הוציאו את המסרק מהג'ל ושמרו את הג'ל במיכל המאגר 1x TAE.
      5. מערבבים 10 מיקרוליטר של סולם DNA של 100-10000 bp ו-100-200 ננוגרם של מוצר תבנית מטוהר PCR עם 2 מיקרוליטר של מאגר טעינת DNA פי 6 לנפח כולל של 12 מיקרוליטר.
      6. טען כל דגימה על הבארות המתאימות והפעל ב-100 וולט למשך 45-60 דקות לפחות.
      7. דמיינו את רצועות הדנ"א על מכשיר תיעוד ג'ל (איור 2).
  4. סינתזה של RNA שונה me1Ψ-UTP
    הערה: לפני תחילת ניסוי זה, יש לנקות את אזור העבודה (זרימת אוויר למינרית) עם 70% אתנול במים שטופלו ב-DEPC. השתמש בצינורות סטריליים נטולי נוקלאז ואנדוטוקסין, עם אחיזה נמוכה וקצות מחסום מסנן. יש למרוח לעתים קרובות 70% אתנול על ידיים עטויות כפפות.
    1. הכן את תערובת תגובת ה- IVT כפי שמופיע בטבלה 3 בטמפרטורת החדר בצינור של 0.2 מ"ל וערבב אותה היטב באמצעות מיקרופיפטה.
    2. סובב את הצינור למשך 10 שניות במיקרופוגה.
    3. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות במחזור תרמי.
  5. פירוק תבנית ה-DNA IVT על ידי טיפול ב-DNase 1
    1. הוסף 1 מיקרוליטר של 1 U/μL DNase 1 (ללא RNase) לתערובת תגובת IVT ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  6. טיהור RNA על ידי מיצוי אורגני/משקעי אמוניום אצטט
    1. התאם את נפח תערובת תגובת IVT ל-200 מיקרוליטר עם 179 מיקרוליטר מים שטופלו ב-DEPC.
    2. יש להוסיף 200 מיקרוליטר של פנול/כלורופורם רווי TE pH 8.0. מערבל אותו למשך 10 שניות.
    3. צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס כדי להפריד בין שני השלבים.
    4. העבירו את השלב העליון המימי (200 מיקרוליטר) לצינור של 1.5 מ"ל והוסיפו 200 מיקרוליטר של אמוניום אצטט 5 M. מערבבים היטב ואז דוגרים במשך 15 דקות על קרח כדי לזרז את ה-RNA.
    5. גלולה את ה-RNA המשקע על ידי צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והסר את הסופרנטנט לחלוטין בעזרת מיקרופיפטה.
    6. שטפו את כדור ה-RNA באמצעות 70% אתנול והפכו 5-10 פעמים. צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    7. הסר את הסופרנטנט לחלוטין עם מיקרופיפטה מבלי להפריע לכדור ה-RNA.
    8. הניחו לגלולה להתייבש בטמפרטורת החדר עד שהגלולה הופכת שקופה למחצה. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-60-75 מיקרוליטר של מים נטולי RNase.
  7. בקרת איכות עבור RNA מטוהר
    1. כימות
      1. מדוד את ריכוז ואיכות ה-RNA המטוהר באמצעות מיקרו-ספקטרופוטומטר.
        הערה: תפוקת ה-RNA הצפויה תהיה 140-180 מיקרוגרם עבור RNA לא שונה ו-100-150 מיקרוגרם עבור RNA שונה me1Ψ-UTP לכל תגובה, בהתאם לגודל הגן המעניין ואיכות תבנית ה-IVT DNA. האיכות האופטימלית צריכה להיות יחס OD260/OD280 סביב 1.9-2.0 ויחס OD260/OD230 >2.0. אחסן את ה-RNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לזמן קצר.
    2. דנטור RNA אגרוז ג'ל אלקטרופורזה
      הערה: ניסוי זה מבוצע כדי לוודא אם ה-RNA המסונתז הוא באורך הנכון ונטול זיהום תוצרי לוואי של IVT.
      1. להכנת ג'ל אגרוז 1%, הוסיפו 0.5 גרם אגרוז ו -50 מ"ל של 1x TAE בבקבוק חרוטי. מיקרוגל את התמיסה עד שהאגרוז נמס לחלוטין. שמור את תמיסת האגרוז בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות להתקררות.
      2. הוסף 1 מיקרוליטר של כתם חומצת גרעין עבור 50 מ"ל של תמיסת אגרוז 1%.
      3. יוצקים את תמיסת האגרוז למגש יציקת הג'ל בעזרת מסרק ומשאירים אותה עד שהג'ל מתמצק.
      4. הוציאו את המסרק מהג'ל ושמרו את הג'ל במיכל המאגר 1x TAE.
      5. הכן את דגימת הצבע לטעינת RNA כמתואר בטבלה 4.
      6. מחממים את הדגימות בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן שומרים דגימות על קרח.
      7. טען כל דגימה על הבארות המתאימות והפעל ב-100 וולט למשך 45-60 דקות לפחות.
      8. דמיין את רצועות ה-RNA על מכשיר תיעוד ג'ל (איור 3).
  8. סינתזה של mRNA שונה me1Ψ-UTP על ידי מכסה מבוסס אנזימטי וזנב פולי-A
    הערה: יעילות המכסה של IVT RNA בשיטה האנזימטית היא 100%. לפיכך, השתמשנו במכסה אנזימטי של Cap-1 בסינתזה של mRNA בפרוטוקול זה. הוספנו זנבות פולי-A באורך של >150 בסיסי A למולקולה כדי לשפר את יעילות התרגום של mRNA.
    1. הוסף 55-60 מיקרוגרם של RNA IVT מטוהר והפוך אותו ל-72 מיקרוליטר עם המים ללא RNase בצינור של 1.5 מ"ל.
    2. דנטורציה של ה-RNA ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בתרמו-מיקסר ולאחר מכן הנח מיד את הצינור על קרח למשך 5 דקות.
    3. בינתיים, הכינו את תערובת תגובת המכסה כפי שמוצג בטבלה 5.
    4. מוסיפים את תערובת תגובת המכסה ו -4 מיקרוליטר של אנזים מכסה ל- RNA המפורק ומערבבים היטב על ידי מיקרופיפטה. סובב את הצינור למשך 10 שניות במיקרופוגה.
    5. דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
    6. לאחר שעתיים, שמור את הצינור על קרח והכן את תערובת מאסטר הזנב של Poly A כפי שמופיע בטבלה 6.
    7. הוסף את תערובת מאסטר הזנב של Poly A לתמיסת ה-RNA המכוסה וערבב היטב על ידי מיקרופיפטה. סובב את הצינור למשך 10 שניות במיקרופוגה.
    8. דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
      הערה: ניתן לטיהור נוסף של mRNA באופן מיידי, או לאחסן mRNA גולמי בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. טיהור mRNA IVT
    1. טהר את ה-mRNA על ידי מיצוי אורגני/משקעי אמוניום אצטט כמפורט בסעיף פרוטוקול 1.6.
    2. השעו מחדש את כדור ה-mRNA עם 60 מיקרוליטר של מים נטולי RNase.
  10. בקרת איכות ל-mRNA המטוהר
    1. עקוב אחר פרוטוקול בקרת האיכות כמתואר בסעיף פרוטוקול 1.7.
      הערה: פס ה-mRNA אמור להופיע מעל פס ה-RNA עקב תוספת של זנב Poly-A באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז RNA דנטור (איור 3). כמו כן, זנב Poly-A מגדיל את תפוקת ה-mRNA (צריך להיות > ריכוז RNA). לאחר הכמות, שים מספר נקודות של mRNA בריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר ואחסן מיד ב-80 מעלות צלזיוס. הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה מרובים של RNA כדי למנוע פירוק של mRNA מסונתז.

2. הכנת ליפוזומים קטיוניים והערכת תכונות טרנספקציה של mRNA במבחנה

  1. הכנת ליפוזום
    1. להכנת ליפוזום קטיוני של 1 מ"מ, השתמש בשומן קטיוני: DOPE: כולסטרול ביחס מולרי של 1:1:0.5.
    2. ממיסים יחסים מולאריים מתאימים של השומן הקטיוני, הכולסטרול וה-DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) בכלורופורם (200 מיקרוליטר) בבקבוקון זכוכית.
    3. השתמש בזרימה דקה של גז חנקן נטול לחות להסרת ממס.
    4. שמור שומנים יבשים בוואקום גבוה לייבוש נוסף למשך שעתיים.
    5. הוסיפו 1 מ"ל מים סטריליים נטולי יונים לשומנים מיובשים לאחר ייבוש בוואקום והניחו לתערובת להתנפח למשך הלילה.
    6. מערבל את הבקבוקון בטמפרטורת החדר כדי ליצור שלפוחיות רב-חד-צדדיות (MUVs).
    7. השתמש בסוניקציה לאמבטיה ואחריה סוניקציה של בדיקה בהספק של 25 וואט כדי ליצור שלפוחיות חד-כילמניות קטנות (רכבי שטח) משלפוחיות רב-חד-צדדיות (MUV).
      הערה: רכבי השטח צריכים להיראות כמו תמיסת ליפוזום שקופה. אם לא, הגדל את מספר הפולסים של 30 שניות לסירוגין במרווח של דקה אחת. קוטר הידרודינמי ופוטנציאל פני השטח נמדדים (איור 4) במנתח גודל חלקיקים.
  2. היווצרות קומפלקס mRNA/ליפוזומים ובדיקת פיגור ג'ל
    1. להכנת יחסי מטען שונים של שומנים-RNA מ-1:1 עד 8:1, יש לדלל את ה-mRNA והליפוזום הקטיוני במים נטולי יונים בנפרד כמפורט בטבלה 7.
    2. מערבבים את ה-mRNA המדולל לתמיסת ליפוזום כפי שמצוין בטבלה 7 ודוגרים אותו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להיווצרות ליפופלקס.
    3. הוסף 20 מיקרוליטר של צבע טעינת RNA פי 2 לתוך המתחם והעמיס על הבאר. mRNA לבדו משמש כבקרה.
    4. טען את הדגימות על ג'ל אגרוז 1% במאגר TAE 1x והפעל ב-100 וולט למשך 45 דקות.
    5. דמיין את רצועות ה-RNA על מכשיר תיעוד ג'ל (איור 5).
  3. טרנספקציה של mRNA במבחנה
    1. זרע 45,000 תאי יונקים לבאר של 48 צלחות באר במדיה שלמה ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 20 שעות של טרנספקציה.
    2. לאחר 16 עד 20 שעות, בדוק את צפיפות התאים. בזמן הטרנספקציה, מפגש התאים צריך להיות בסביבות 80%.
    3. לצינורות של 0.5 מ"ל, הוסף 150 ננוגרם של קומפלקס mRNA מקודד חלבון GFP עם יחס מטען של 1:1 של ליפוזומים קטיוניים ו-mRNA במדיום DMEM ללא סרום. הנפח הכולל הוא עד 20 מיקרוליטר.
    4. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    5. הוסף ליפופלקס לתאים ודגר אותו למשך 4 שעות בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 .
    6. הסר את המדיה מבלי להפריע לתאים. הוסף 250 מיקרוליטר של מדיה שלמה עם 10% FBS (טבלה 8) לכל באר.
    7. לאחר 72 שעות של טרנספקציה, צפו בביטוי GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 6, 7).
    8. כדי לכמת את ביטוי ה-GFP, עבד את התאים לניתוח ציטומטר זרימה.
    9. הסר את המדיה ושטוף עם 1x PBS פעמיים. נסה את התאים ועבד את התאים כדי לכמת את אחוז התאים החיוביים ל-GFP בציטומטר זרימה.
    10. רכוש את התאים בציטומטר זרימה באמצעות לייזר 488. שער את האוכלוסייה החיה מזה ונתח את אחוז התאים החיוביים ל-GFP. כמת את עוצמת הפלואורסצנט הממוצעת (MFI) (איור 6, 7).

תוצאות

ביצענו אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור ייצור mRNA שהשתנה על ידי me1Ψ-UTP, הכנת ליפוזומים וניסויי טרנספקציה של mRNA עם ליפוזומים קטיוניים לתאי יונקים מרובים (איור 1). כדי לסנתז mRNA, תבנית ה-eGFP IVT המותאמת לקודון יונקים הוגברה מווקטור ביטוי היונקים mEGFP-N1 וטוהרה בשיטת מי...

Discussion

היישומים הטיפוליים של mRNA לא מותאמים הוגבלו בשל מחצית החיים הקצרה שלהם ויכולתם להפעיל תגובות חיסוניות מולדות תוך תאיות, אשר בתורן מובילות לביטוי חלבון לקוי בתאים שעברו טרנספטקט11. קטלין ועמיתיו הראו כי RNA המכיל נוקלאוזידים מותאמים כגון m5C, m6A, ΨU ו-me1Ψ-UTP יכול למ...

Disclosures

ללא גילוי נאות

Acknowledgements

MS מודה למחלקה לביוטכנולוגיה, הודו, על התמיכה הכספית (BT/PR25841/GET/119/162/2017), לד"ר אלוק סריבסטבה, ראש CSCR, Vellore, על תמיכתו ולד"ר סנדיה, מתקני הליבה של CSCR להדמיה וניסויי FACS. אנו מודים ל- R. Harikrishna Reddy ו- Rajkumar Banerjee, החטיבה לביולוגיה יישומית, CSIR-המכון ההודי לטכנולוגיה כימית Uppal Road, Tarnaka, Hyderabad, 500 007, TS, הודו, על עזרתם בניתוח נתונים פיזיקו-כימיים של הליפוזומים. Vigneshwaran V, וג'ושוע A, CSCR על עזרתם ביצירת וידאו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseLonza50004
Bath sonicatorDNMANM IndustriesUSC-100
Cationic lipidSynthesized in the lab
ChlorofromMP biomedicals67-66-3"Caution"
CholesterolHimediaGRM335
DEPC waterSRL BioLit66886
DMEMLonza12-604F
DNA LadderGeneDireXDM010-R50C
DOPETCID4251
EDTA sodium saltMP biomedicals194822
EthanolHaymanF204325"Caution"
Fetal bovine serumGibco10270
Flow cytometryBDFACS Celesta
Fluroscence MicroscopeLeicaMI6000B
Gel documentation systemCell BiosciencesFlurochem E
Glacial acetic acidFisher Scientific85801"Caution"
mEGFP-N1, Mammalian expression vectorAddgene54767
N1-Methylpseudo-UTPJena BioscienceNU-890
Phenol:chloroform:isoamyl alchol (25:24:1), pH 8.0SRL BioLit136112-00-0"Caution"
Phosphate Buffer Saline (PBS), pH 7.4CellCloneCC3041
Probe sonicatorSonics Vibra CellsVCX130
RNA ladderNEBN0362S
RNase inhibitorThermo ScientificN8080119
SafeView dyeabmG108
Sodium acetateSigmaS7545
ThermocyclerApplied biosystems4375786
ThermomixerEppendrof22331
Tris bufferSRL BioLit71033
TrypsinGibco25200056

References

  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Schlake, T., Thess, A., Fotin-Mleczek, M., Kallen, K. J. Developing mRNA-vaccine technologies. RNA Biology. 9 (11), 1319-1330 (2012).
  3. Carlile, T. M., et al. Pseudouridine profiling reveals regulated mRNA pseudouridylation in yeast and human cells. Nature. 515 (7525), 143-146 (2014).
  4. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  5. Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
  6. Srujan, M., et al. The influence of the structural orientation of amide linkers on the serum compatibility and lung transfection properties of cationic amphiphiles. Biomaterials. 32 (22), 5231-5240 (2011).
  7. Dharmalingam, P., et al. Transfection: Cationic Lipid Nanocarrier System Derivatized from Vegetable Fat, Palmstearin Enhances Nucleic Acid Transfections. ACS Omega. 2 (11), 7892-7903 (2017).
  8. Hoy, S. M. Patisiran: First Global Approval. Drugs. 78 (15), 1625-1631 (2018).
  9. Anderson, E. J., et al. Safety and Immunogenicity of SARS-CoV-2 mRNA-1273 Vaccine in Older Adults. New England Journal of Medicine. , (2020).
  10. Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. New England Journal of Medicine. , (2020).
  11. Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid-sensing. Nature Reviews Immunology. 16 (9), 566-580 (2016).
  12. Kariko, K., Buckstein, M., Hi, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  13. Mauger, D. M., et al. mRNA structure regulates protein expression through changes in functional half-life. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (48), 24075-24083 (2019).
  14. Vaidyanathan, S., et al. Uridine Depletion and Chemical Modification Increase Cas9 mRNA Activity and Reduce Immunogenicity without HPLC Purification. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 12, 530-542 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MRNARNAEGFP MRNAMRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved