Un diseño experimental dentro del sujeto utilizando una tarea de ubicación de objetos en ratas

Resumen

Este protocolo proporciona pasos detallados para una tarea de ubicación de objetos con cuatro repeticiones utilizando la misma cohorte de ratas. La codificación débil y fuerte puede producir recuerdos a corto y largo plazo. La flexibilidad del protocolo con repetición puede ser beneficiosa para los estudios que involucran operaciones quirúrgicas al ahorrar tiempo y trabajo de parto.

Resumen

El reconocimiento del lugar del objeto es un método prominente utilizado para investigar la memoria espacial en roedores. Esta memoria de reconocimiento de lugar de objeto forma la base de la tarea de ubicación del objeto. Este documento proporciona un extenso protocolo para guiar el establecimiento de una tarea de ubicación de objetos con la opción de hasta cuatro repeticiones utilizando la misma cohorte de ratas. Tanto los protocolos de codificación débiles como los fuertes se pueden utilizar para estudiar memorias espaciales a corto y largo plazo de fuerza variable y para permitir la implementación de manipulaciones relevantes que inhiben o mejoran la memoria. Además, la repetición de la prueba con el contrapeso presentado aquí permite la combinación de los resultados de dos o más pruebas para la comparación dentro del sujeto para reducir la variabilidad entre ratas. Este método ayuda a aumentar el poder estadístico y se recomienda encarecidamente, especialmente cuando se ejecutan experimentos que producen una alta variación en el comportamiento individual. Esto refina directamente el estudio al aumentar los datos obtenidos de cada animal y reducir el número total de animales necesarios. Finalmente, la implementación de la tarea de ubicación de objetos repetidos aumenta la eficiencia de los estudios que involucran procedimientos quirúrgicos al ahorrar tiempo y mano de obra.

Introducción

Las tareas de reconocimiento espontáneo(por ejemplo, reconocimiento de objetos, reconocimiento de lugares de objetos) se han utilizado en gran medida en la investigación de la memoria en roedores. Estas pruebas son diferentes a la variedad de pruebas utilizadas para evaluar la memoria que se basan en el condicionamiento del miedo o la motivación de recompensa, ya que las tareas de reconocimiento espontáneo se basan únicamente en el comportamiento exploratorio espontáneo hacia nuevos estímulos. Este comportamiento, denominado 'preferencia neótica'^1,es inherente a los roedores así como a otras especies de mamíferos y a algunos no mamíferos como las aves y los peces². El reconocimiento del lugar del objeto, que depende de la memoria espacial, se puede observar utilizando la tarea de ubicación del objeto (también conocida como tarea de reconocimiento de objetos espaciales)³. Los estudios de lesiones han demostrado que el reconocimiento del lugar del objeto requiere un hipocampo intacto^4,5. Debido al protocolo de entrenamiento relativamente simple y la ausencia de cualquier refuerzo, esta tarea es preferible en muchos estudios. La ausencia de refuerzo positivo y negativo minimiza los parámetros adicionales y las regiones cerebrales que podrían impulsar el comportamiento. Por lo tanto, el comportamiento aquí es neutral y se basa en la curiosidad y la memoria espacial, lo que permite la investigación de los mecanismos que están involucrados en la codificación, consolidación y recuperación de la memoria espacial.

El protocolo para la tarea de ubicación de objetos generalmente consiste en sesiones de habituación seguidas de una sola sesión de pruebas de codificación y prueba, separadas por un período de retraso, que varía de varios minutos a horas. Se recomienda encarecidamente que las ratas se manipulen de antemano para minimizar el nivel de estrés de los animales y, por lo tanto, el comportamiento que podría afectar la memoria de reconocimiento, como la aversión hacia la novedad. Del mismo modo, un protocolo de habituación bien diseñado juega un papel esencial en la prevención del estrés que podría obstaculizar el comportamiento natural de la rata durante la tarea. Sin embargo, el grado de manipulación y habituación varía en gran medida entre laboratorios y experimentadores, lo que puede contribuir a la baja replicabilidad^6,7,8. En la prueba de codificación, a la rata se le da tiempo para explorar una arena con dos objetos idénticos ubicados en dos esquinas designadas. En la prueba de prueba, que se retrasa por un período, a la rata se le da tiempo para explorar la arena con el mismo par de objetos, pero esta vez uno de ellos ha sido trasladado a un lugar novedoso. La preferencia espontánea exhibida por las ratas y el aumento resultante en el tiempo dedicado a explorar el objeto en la nueva ubicación son indicativos del reconocimiento espacial y la memoria de las ubicaciones de los objetos³. La modificación del ensayo de codificación (duración y número de repeticiones) influye en la fuerza de la memoria.

Dependiendo del objetivo del estudio, la duración del retraso entre la codificación y los ensayos de prueba se puede modificar para modelar la memoria a corto plazo independiente de la síntesis de proteínas o la memoria a largo plazo dependiente de la síntesis de proteínas. Por lo tanto, la tarea de ubicación del objeto se puede utilizar para una amplia variedad de estudios adaptando el protocolo según sea necesario. Además, la implementación de manipulaciones experimentales, como intervenciones farmacológicas y optogenéticas, también es posible entre estos ensayos, al igual que las imágenes in vivo. Hay varios estudios^9,10 que informan iteraciones repetidas de la tarea de ubicación del objeto dentro de la misma cohorte de ratas. Esto contrasta con el uso tradicional en el que un animal tiene una sesión sin repeticiones. Sin embargo, la efectividad de estos paradigmas no se ha investigado a fondo, ni hay ningún documento de método que los describa. Hasta donde sabemos, esta es la primera descripción reportada de un protocolo que describe en detalle una tarea de ubicación de objetos con hasta cuatro repeticiones utilizando la misma cohorte de ratas, que también compara sistemáticamente los resultados de cada repetición. Las repeticiones se pueden usar para contrarrestar las condiciones experimentales para permitir la comparación dentro del sujeto con una variabilidad reducida entre las pruebas. La repetición confiable de la tarea permite agrupar los datos, lo que significa que se puede generar una cantidad suficientemente grande de datos utilizando un número relativamente pequeño de ratas. Finalmente, las repeticiones con la misma rata pueden ser beneficiosas en experimentos que involucran operaciones quirúrgicas e implantes al reducir el número de ratas requeridas que, en consecuencia, ahorra tiempo y costos de mano de obra.

Este estudio presenta un extenso protocolo que detalla cómo realizar una tarea de localización de objetos en ratas adultas utilizando ensayos de codificación fuertes y débiles seguidos de ensayos de prueba con retrasos de 1 hora y 24 horas. El protocolo de codificación fuerte produce una memoria de reconocimiento estadísticamente significativa cuando se prueba con retrasos de 1 hora y 24 horas y, por lo tanto, se puede utilizar para estudiar recuerdos a corto y largo plazo tras la implementación de manipulaciones para inhibir estos recuerdos¹¹. En contraste, el protocolo de codificación débil solo produce una memoria significativa a corto plazo cuando se prueba con un retraso de 1 h. La ausencia de memoria a largo plazo se puede utilizar para estudiar manipulaciones para mejorar la retención de la memoria^11,12. Este protocolo también incluye sesiones detalladas de manejo y habituación, que tienen como objetivo aumentar la replicabilidad de la tarea de ubicación del objeto. Este artículo también demuestra la repetición de la tarea en cuatro contextos distintos con la misma cohorte de ratas utilizando el protocolo de codificación débil, que se confirma que produce resultados replicables y consistentes cada vez.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por las autoridades nacionales danesas (número de licencia: 2018-15-0201-01405) de acuerdo con las legislaciones danesas y de la UE sobre bienestar animal.

1. Configuración experimental y preparación de contextos distintos

1. Arena de ubicación de objetos con contexto
   NOTA: La configuración a continuación se muestra en una caja insonorizada cerrada(Figura 1B)con la fuente de luz ubicada a lo largo de los bordes del techo y la cámara ubicada en el centro del techo de la caja. La arena, de 60 cm x 60 cm con paredes de 100 cm de altura(Figura 1B),se coloca dentro de la caja y está completamente aislada de la habitación circundante. Todas las señales espaciales están dentro de la arena. Esto simplifica el proceso de creación de contextos distintos. Se puede lograr un nivel similar de aislamiento de la habitación circundante encerrando una arena normal de campo abierto con una cortina uniforme alrededor de las paredes.
   1. Obtenga una arena cuadrada hecha de plástico duro opaco y no poroso con un ancho mínimo de 60 cm y un mínimo de 50 cm de altura. Elija un color para el piso que contraste con el color de la rata para registrar con éxito los movimientos de la rata por el software automatizado (si corresponde). Coloque la arena dentro de una caja(Figura 1B)o en una plataforma que esté rodeada por una cortina.
   2. Para crear un contexto, obtenga una segunda capa de paredes insertables(por ejemplo, revestimiento de pared hecho del mismo material que la arena o papel tapiz de plástico que se pueda limpiar fácilmente) en diferentes colores y / o patrones(por ejemplo, negro, blanco, rayas o puntos). Inserte la segunda capa de paredes en la arena de tal manera que sean distintas entre sí.
   3. Obtener señales espaciales tridimensionales (3D) (1-2 por contexto) con dimensiones que varían entre 10 cm x 10 cm x 5 cm y 20 cm x 15 cm x 15 cm (ancho x largo x alto) y tener (i) formas geométricas distintas y (ii) colores que contrasten el color de la pared. Cuélgalos en las paredes lo suficientemente altas como para que las ratas no puedan alcanzar estas señales.
   4. Obtenga diferentes pares de objetos (tantos como el número de contexto) que no sean porosos, no masticables y fáciles de limpiar. Trate de tener formas geométricas y texturas distintas para cada nuevo objeto. Elija objetos que estén entre 5 y 15 cm de ancho y alto (evite cualquier objeto más alto). Consulte la Figura 1D para ver ejemplos de cuatro objetos distintos (conos, balones de fútbol, prismas rectangulares y prismas triangulares).
      NOTA: Cada objeto debe ser de interés similar al de las ratas, de modo que los tiempos totales de exploración para todos los objetos sean comparables.
   5. Encuentre la mejor solución para colocar los objetos en el piso de la arena(por ejemplo, usando esteras adhesivas, cinta adhesiva, colocando una placa de metal debajo del objeto y un imán de emparejamiento debajo de la arena, etc.).
   6. Al crear otro contexto, vuelva a crear las paredes de tal manera que contrasten la distribución del color y el patrón de las paredes con respecto a los contextos anteriores. Use nuevas señales espaciales 3D que sean diferentes y que contrasten con todas las señales anteriores. Consulte la Figura 1C para ver ejemplos de cuatro contextos distintos.
   7. Obtén una fuente de luz que asegure una iluminación difusa e igual dentro de la arena y que tenga una opción de atenuación. Ajuste la intensidad de la luz a aproximadamente 100-120 lux en las esquinas de la arena después de crear cada contexto. Obtenga una cámara y colóquela en el centro del techo de la caja.
      NOTA: La intensidad de la luz se puede ajustar a un nivel inferior si no se utiliza el software de puntuación automatizado.
2. Bucket de objetos
   1. Obtener un cucharón (>50 cm de diámetro). No elija una forma cuadrada para evitar cualquier parecido con la arena experimental. Llénalo con material de cama.
   2. Obtener 5-10 objetos de diferentes formas y tamaños (diferentes de los objetos que se van a utilizar en el experimento) y colocarlos todos al azar en el cubo(Figura 1A).

Figura 1: La configuración experimental, que incluye cuatro contextos y objetos distintos. (A) El bucket de objetos para la habituación de objetos. (B) El aparato de experimento (izquierda), que encierra la arena de ubicación del objeto, la cámara y la fuente de luz. La caja experimental y la arena antes de la configuración de contexto (centro) y la arena con configuración de contexto (derecha). (C) Cuatro contextos (1-4) con distintos colores y patrones de pared, así como señales espaciales tridimensionales. (D) Cuatro objetos que se utilizan en los contextos 1-4, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Cámara y software de seguimiento (opcional)
   1. Obtenga un software que se pueda usar para controlar de forma remota la grabadora de la cámara y que pueda rastrear las nórtesis de las ratas. Realice los ajustes de software para cada contexto específico y cepa de rata antes de cada experimento.
4. Contrapeso de ubicaciones de objetos y grupos experimentales
   1. Prepare posibles combinaciones de ubicaciones de objetos para pruebas de codificación y prueba, y asínóquelas como contadores. Cree las combinaciones de tal manera que cubran todas las esquinas como ubicaciones de objetos, y el movimiento de objetos desde esquinas adyacentes a diagonales y viceversa (Figura 2A).
   2. Prepare un cronograma para el experimento específico, haciendo coincidir cada rata en un grupo experimental con un contador. Use cada par de los dos contadores emparejados(Figura 2A)dentro de un grupo, si hay suficientes ratas. Utilice el mismo conjunto de contadores para ambos grupos experimentales en una sola sesión de codificación/prueba (Figura 2B). Reasignar contadores para las siguientes sesiones(es decir, cada nuevo contexto).
      NOTA: Ejecute las ratas en un orden mixto durante las sesiones de codificación / prueba(por ejemplo,no corra todas las ratas en una jaula una tras otra; en su lugar, gire las jaulas para garantizar un ambiente tranquilo dentro de una jaula de más de una rata).
   3. Cuando se utilizan dos o más contextos para contrarrestar los grupos experimentales(por ejemplo, memoria de 1 h frente a grupos de memoria de 24 horas), asigne ratas a cada grupo y cambie los grupos en los siguientes contextos(Figura 2B).

Figura 2: Métodos representativos de contrapeso. (A) Las posibles orientaciones de los objetos en la arena en las pruebas de codificación y prueba se denominan contadores. El objeto 1 es siempre el objeto en movimiento. Cada dos contadores se contrarresta de tal manera que la ubicación del objeto en movimiento cambia. Cada esquina se ocupa dos veces, y el objeto 1 se mueve de diagonal a adyacente y viceversa durante un número igual de veces. (B) Ejemplo de programación de codificación/prueba para dos sesiones contrabalanceada(por ejemplo, contextos 1 y 2). Las ratas se asignan a condiciones experimentales en el contexto 1 (sesión X, izquierda). Se selecciona un conjunto de pares de contadores(es decir, 1-2, 3-4, 5-6 y 7-8) y se asignan a cada rata en un grupo experimental. El mismo conjunto de contadores se asigna a las ratas en ambos grupos experimentales. En la siguiente sesión en el contexto 2 (sesión X + 1; derecha), las ratas en los grupos experimentales se cambian para el contraequilibrio y se asigna un nuevo conjunto de pares de contadores. Se debe tener en cuenta el momento al comienzo de la codificación y los ensayos de prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: Todas las sesiones de manejo, habituación y codificación/prueba en este protocolo se optimizaron durante la fase de luz de un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas y, por lo tanto, se recomienda que los experimentos se realicen durante la fase de luz.

2. Manejo y habituación

1. Comience a manipular ratas a partir del destete (si las ratas se crían en la instalación del hogar) o 2-3 semanas antes del comienzo de los experimentos (en el caso de que las ratas se ordenen desde una instalación externa, después de permitirles aclimatarse durante una semana después de la llegada).
2. Pase al menos 10-15 minutos en cada jaula de 4 ratas durante 2 o 3 días a la semana hasta que las ratas se sientan cómodas siendo tocadas y recogidas por el experimentador. Ajuste el tiempo asignado por jaula dependiendo del número de ratas en una jaula.
   NOTA: Es importante que todos los experimentadores que esperan trabajar con las ratas estén presentes durante el manejo.
3. En los casos en que la manipulación comience en el destete, reduzca la manipulación al mínimo (opcional) una vez que se alcance este nivel. Si comienza 2-3 semanas antes de los experimentos, continúe manejando hasta el comienzo de las sesiones de habituación.
4. Lleve a las ratas en sus jaulas a la sala de experimentos para habituar a las ratas al transporte, así como a la sala experimental. Permita que las ratas se sienten durante al menos 30 minutos para darles tiempo de calmarse y habituarse. Después de este tiempo, devuelva las ratas / jaulas a la sala de alojamiento.
   NOTA: El paso 2.4 se puede combinar con el manejo y repetir tantas veces como sea necesario. Se puede implementar una habituación adicional en este paso si el protocolo incluye manipulaciones adicionales(por ejemplo, manejo para el procedimiento de inyecciones, etc.).
5. Realizar la habituación de objetos para habituar a las ratas a interactuar con objetos y reducir los niveles generales de estrés derivados de la experiencia de nuevos entornos.
   1. Para la sesión 1, lleve todas las jaulas caseras a la sala de experimentos y deje que las ratas se habitúen a la habitación y se conformen durante al menos 30 minutos. Ponga las ratas (2-4 ratas) de la misma jaula juntas en el cubo durante 20 minutos. Limpie el cubo eliminando cualquier materia fecal entre cada grupo de ratas. Repita el procedimiento para todas las jaulas. Coloque a todas las ratas en sus jaulas domésticas y regrese a la sala de alojamiento.
   2. Para la sesión 2, en un día separado, lleve todas las jaulas a la sala de experimentos y déjelo durante al menos 30 minutos. Ponga cada rata individualmente en el cubo durante 10 minutos. Coloque la rata de nuevo en la jaula de la casa y limpie el cubo después de cada rata. Devuelva todas las jaulas a la sala de alojamiento.
   3. Para la sesión 3, repita el paso 2.5.2 en un día aparte.
6. Si el aparato experimental es una caja cerrada (Figura 1B), opte por realizar la habituación de caja vacía para habituar a las ratas al nuevo aparato experimental. En la sesión 4, lleve todas las jaulas a la sala de experimentos y déjelo durante al menos 30 minutos. Coloque a las ratas de la misma jaula juntas (2-4 ratas) en la arena vacía sin contexto ni señales espaciales(Figura 1B,en el medio) durante 20 minutos. Coloque todas las ratas de nuevo en la jaula de la casa y limpie la arena con 70% de etanol después de cada grupo de ratas.
   NOTA: Los pasos 2.5 y 2.6 deben realizarse en una sola semana, antes de la semana de habituación de contexto (paso 2.7; consulte la Figura 3). Un descanso de un par de días durante estos pasos es aceptable. Sin embargo, después de iniciar el paso 2.7, cada paso debe realizarse en días consecutivos según lo especificado, hasta el final de la prueba de prueba (paso 2.9).
7. Realizar la habituación del contexto para habituar a las ratas al contexto y las señales 3D, para reducir los niveles generales de estrés y para apoyar el aprendizaje espacial del entorno.
   1. Modifique la arena vacía para crear el primer contexto como se describe en la sección 1.1, pero no coloque los objetos en la arena. Preparar el aparato de control.
   2. Para la sesión 1, lleve todas las jaulas a la sala de experimentos y déjelo durante al menos 30 minutos. Inicie la grabadora si lo hace manualmente. Coloque la primera rata en el centro de la arena y permita que la rata explore la arena durante 10 minutos. Luego, detenga la grabadora (si es manual) y coloque a la rata de nuevo en la jaula de la casa. Limpie bien la arena con etanol al 70% después de cada rata y devuelva todas las jaulas a la sala de alojamiento cuando termine.
   3. Para las sesiones 2 y 3, repita el paso 2.7.2 para cada rata durante dos días consecutivos, de modo que haya 3 sesiones de habituación de contexto por rata en total.
      NOTA: Considere barajar el orden en que las ratas entran en la arena, especialmente cuando se trata de un grupo grande. Esto evita correr ratas específicas repetidamente a la misma hora del día.

Figura 3:El diseño del experimento de comportamiento, incluidos los protocolos de tareas de manejo, habituación y ubicación de objetos. Las ratas deben manipularse regularmente a partir de unas pocas semanas antes de la semana de habituación. En la semana 0, las habituaciones de objetos y cajas experimentales se llevan a cabo durante 4 sesiones con intervalos de al menos 24 horas entre ellos. En la semana 1, la habituación del contexto se lleva a cabo durante 3 sesiones consecutivas con intervalos de 24 horas entre ellos, seguidos de ensayos de codificación y prueba. Debe haber un mínimo de 48 h y hasta 1 semana de intervalo antes de continuar con la siguiente sesión(por ejemplo, comenzar la habituación al siguiente contexto en la semana 2 o 3). Abreviatura: Hab., habituación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. Prueba de codificación (Sesión 4)
   NOTA: En el caso de manipulaciones farmacológicas, un tiempo razonable para administrar un agente puede ser antes o inmediatamente después del ensayo de codificación y/o antes del ensayo de prueba, dependiendo de la naturaleza del agente farmacológico.
   1. Lleve todas las jaulas a la sala de experimentos y déjelo durante al menos 30 minutos. Utilizando el cronograma preparado de antemano(Figura 2B),coloque el primer par de objetos idénticos en los lugares designados (a 2 esquinas y a una distancia de >10 cm de cada pared respectiva; se puede usar una pieza de cartón en forma de L para mantener la misma distancia cada vez) mediante el uso de esteras adhesivas o cinta adhesiva de doble cara.
   2. Inicie la grabadora (si es manual). Coloque la primera rata en la arena frente a una pared o una esquina que no esté ocupada por ningún objeto (igual distancia a cada objeto).
      NOTA: Siga los pasos a continuación para la codificación débil o fuerte.
   3. Para una codificación débil (1 prueba),permita que la rata explore la arena y los objetos durante 20 minutos. Luego, detenga la grabadora (si es manual) y coloque a la rata de nuevo en la jaula de la casa. Retire los objetos y limpie tanto los objetos como la arena a fondo con etanol al 70%.
   4. Repita el paso 2.8.3 para todas las ratas de modo que cada rata reciba 1 ensayo de codificación de 20 min.
   5. Para una codificación fuerte (3 ensayos),permita que la rata explore la arena y los objetos durante 5 minutos. Luego, detenga la grabadora (si es manual) y coloque a la rata de nuevo en la jaula de la casa. No retire los objetos. Limpie la arena y los objetos con etanol al 70%.
   6. Repita el paso 2.8.5 dos veces más con la misma rata, de modo que haya 3 ensayos en total. Coloque a la rata de nuevo en la jaula de la casa cuando se asemete el tiempo. Retire los objetos para una limpieza a fondo y limpie los objetos y la arena con etanol al 70%.
      NOTA: El intervalo entre ensayos para una rata debe ser de aproximadamente 1-2 min.
   7. Repita los pasos 2.8.5-2.8.6 para cada rata.
   8. Si el tiempo de retraso es inferior a 24 h, mantenga las jaulas en la sala de experimentos hasta el ensayo de prueba. De lo contrario, devuelva todas las jaulas a la sala de alojamiento cuando esté terminada.
9. Prueba de prueba (Sesión 4)
   NOTA: El período de retraso debe contarse desde el comienzo de la prueba de codificación.
   1. En caso de un retraso de 24 horas (o cualquier retraso que requiera que la prueba de prueba se realice al día siguiente), lleve todas las jaulas a la sala de experimentos, dejando suficiente tiempo antes de la primera prueba para que las ratas puedan dejarse durante al menos 30 minutos. De acuerdo con el cronograma, coloque los objetos en las ubicaciones designadas (uno de los objetos en una nueva ubicación).
   2. Cuando llegue el momento, inicie la grabadora (si es manual). Coloque la primera rata en la arena frente a una pared o una esquina que no esté ocupada por ningún objeto (igual distancia a cada objeto).
   3. Permita que la rata explore la arena y los objetos durante 5 minutos. Luego, detenga la grabadora (si es manual). Coloque la rata de nuevo en la jaula de la casa. Retire los objetos y limpie tanto los objetos como la arena a fondo con etanol al 70%.
   4. Repita los pasos 2.9.2-2.9.3 para cada rata. Devuelva todas las jaulas a la sala de alojamiento.
      NOTA: En cada siguiente sesión de codificación/prueba, inicie el protocolo de habituación desde el paso 2.7 (habituación de contexto) después de un intervalo de al menos 48 h y hasta 1 semana.

3. Análisis de datos

1. Para cada rata, puntúe el tiempo de exploración para cada objeto tanto en la codificación como en las pruebas de prueba mediante el uso de software diseñado para este propósito o utilizando una configuración manual. Ensayos de codificación de puntuaciones para toda la duración. Pruebas de puntuación durante 2 minutos para obtener el mejor rendimiento de discriminación³. Si utiliza la puntuación automatizada de software en línea, exporte los datos de puntuación del software.
2. Cuente el tiempo de exploración cuando la rata está en contacto con el objeto, olfateando el objeto o mirando hacia el objeto a una distancia inferior a 2 cm. Incluya trepar y sentarse en el objeto como exploración a menos que la atención de la rata parezca estar en otro lugar que no sea el objeto(por ejemplo, apartar la vista del objeto).
3. Calcula el tiempo total de exploración de ambos objetos para cada rata. Considere excluir de esta prueba a cualquier rata que tenga un tiempo total de exploración de menos de 10 s en el ensayo de prueba (para una puntuación de 2 minutos), ya que puede reflejar una exploración poco confiable.
4. Calcular el porcentaje de exploración para cada objeto (ecuación 1) o el índice de discriminación (DI) para cada rata (ecuación 2), y calcular los valores medios para los grupos.
   (1)
   
   NOTA: Si el % de exploración es del 50% o el DI es 0, significa que el rendimiento está en el nivel de probabilidad y la rata no tiene preferencia por ninguno de los objetos. El porcentaje medio de exploración y DI durante los ensayos de codificación debe ser de ~50% o 0, respectivamente. Cualquier rata que muestre una preferencia superior a [± media (2 × SD)] por cualquiera de los objetos en el ensayo de codificación debe excluirse del análisis de la prueba respectiva. Esto permite una interpretación confiable de la preferencia en la prueba de prueba como la memoria de la ubicación estable del objeto. Este valor se puede calcular para una prueba individual o para datos de codificación combinados de varias pruebas.
5. Analice los datos por el método que mejor se ajuste a la configuración experimental. Utilice una prueba tde una muestra para detectar una preferencia significativa por encima del nivel de probabilidad.
6. Mientras usa más de un contexto con contrapeso, combine los resultados de la misma condición experimental en todos los contextos.
   NOTA: Esto dará como resultado grupos que consisten en las mismas ratas, lo que permitirá la comparación dentro del sujeto utilizando una prueba tpareada para dos grupos y utilizando el análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA) para más de dos grupos.

Resultados

Aquí se muestran los resultados representativos para los protocolos de codificación fuertes y débiles descritos utilizando ratas transgénicas macho tirosina hidroxilasa (Th)-Cre¹³ con cepa Long-Evans cruzada cuatro veces a cepa Lister Hooded y ratas Lister Hooded tipo salvaje. Se utilizaron ratas transgénicas Th-Cre, ya que esta línea de ratas se utilizará en futuros estudios con optogenética. Utilizando cada protocolo, se probó la memoria con retrasos de 1 y 24 h. Las pruebas a 1 h demuestran la memoria a corto plazo, mientras que las pruebas de 24 horas demuestran la memoria a largo plazo. El valor de exclusión para la preferencia de codificación se calculó como se describe en el protocolo, utilizando los datos combinados de cinco pruebas (protocolos de codificación fuertes y débiles) como [50,8% ± (2×10,8%)]. Las ratas que tenían una preferencia de codificación por encima y por debajo de estos valores fueron excluidas de los análisis de las pruebas respectivas.

Para experimentos de codificación fuerte, se utilizaron 16 ratas, y para experimentos de codificación débil, se utilizaron 19 ratas. Durante los ensayos de codificación fuertes (3 × 5 min de codificación; Figura 4A), no hubo preferencia significativa por ninguno de los objetos (52,0 ± 1,9%, n = 16, t₁₅ = 1,1, p = 0,29; una muestra de t-testversus nivel de probabilidad). Este fuerte protocolo de codificación condujo a la preferencia por el objeto en la nueva ubicación, como se muestra en términos de exploración porcentual media, que fue significativamente más alta que el nivel de probabilidad (50%) en pruebas con retrasos de 1 hora y 24 horas (memoria de 1 h, memoria de 77,9 ± 2,4%, n = 8, t₇ = 11,8, p < 0,001; memoria de 24 horas, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t₇ = 2,8, p = 0,025; prueba tde una muestra versus nivel de probabilidad). No hubo diferencias significativas entre la memoria de 1 h y 24 h (p = 0,056; prueba tde Welch no apareada).

Durante los ensayos de codificación débil (codificación de 20 minutos; resultados agrupados de cuatro contextos; Figura 4B), no hubo preferencia significativa por ninguno de los objetos (51,1 ± 1,0%, n = 66, t₆₅ = 1,2, p = 0,24; una muestra de t-testversus nivel de probabilidad). Este protocolo de codificación débil produjo un aumento significativo en la preferencia por el objeto en la nueva ubicación en comparación con el nivel de probabilidad en las pruebas con un retraso de 1 h, pero no un retraso de 24 h (datos combinados de los cuatro contextos; memoria de 1 h, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t₃₁ = 8,2, p < 0,001; memoria de 24 h, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t₃₃ = 0,16, p = 0,87; prueba tde una muestra versus nivel de probabilidad). Hubo una diferencia significativa entre el rendimiento en las pruebas con retrasos de 1 h y 24 h (memoria de 1 h: n = 32, memoria de 24 horas: n = 34, t_61,5 = 5,2, p < 0,001; prueba t de Welch no apareada).

La memoria a nivel de grupo no se observó en la prueba de retraso de 24 horas según lo indexado por el rendimiento a nivel de probabilidad, pero mostró variaciones individuales. Esta mayor variación para condiciones débiles a sin memoria(por ejemplo,prueba de 24 horas) se observó comúnmente debido a una exploración más aleatoria de los objetos. Por lo tanto, es importante no interpretar el rendimiento de las ratas individualmente. En su lugar, la distribución de puntos de datos individuales se puede utilizar junto con el promedio del grupo como el resultado confiable de la prueba. Cuanto más fuerte es la codificación, más uniforme se vuelve el comportamiento de las ratas y menor es el número de ratas necesarias para alcanzar la significación estadística, como se puede observar en la Figura 4A para el protocolo de codificación fuerte. Por el contrario, se necesitan grupos más grandes para obtener resultados confiables para condiciones débiles(Figura 4B).

Figura 4: Rendimiento de la memoria después de una codificación fuerte y débil. (A) La prueba de codificación fuerte (codificación de 3 × 5 minutos) seguida de pruebas de 1 h o 24 horas. No hubo preferencia significativa por ninguno de los objetos durante los ensayos de codificación (n = 16). La codificación fuerte produjo una preferencia significativamente mayor por el objeto en la nueva ubicación en las pruebas con retrasos de 1 y 24 h en comparación con el nivel de probabilidad (memoria de 1 h y 24 h: n = 8 en cada grupo). No hubo diferencias significativas entre los grupos. (B) El ensayo de codificación débil (codificación de 20 minutos) seguido de ensayos de prueba de 1 o 24 horas. No hubo preferencia significativa por ninguno de los objetos como grupo durante los ensayos de codificación (n = 66). La codificación débil produjo una preferencia significativamente mayor por el objeto en la nueva ubicación en la prueba con un retraso de 1 h, pero no de 24 h, en comparación con el nivel de probabilidad (memoria de 1 h: n = 32; memoria de 24 h: n = 34). Hubo una diferencia significativa entre el rendimiento en las pruebas con retrasos de 1 h y 24 h. Los resultados se agruparon a partir de cuatro contextos. Los puntos de datos individuales se presentan como puntos. Todas las barras muestran el porcentaje de exploración del objeto en una ubicación novedosa como media ± SEM. *p < 0.05, ***p < 0.001; prueba tde una muestra versus nivel de probabilidad (50%, línea discontinua). ^###p < 0,001; ns, no significativo; prueba tde Welch desapareada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una ventaja significativa de este protocolo establecido es que se puede realizar cuatro veces utilizando cuatro contextos distintos(Figura 1C)con la misma cohorte de ratas. Los resultados mostrados en la Figura 5 demuestran una posible forma de utilizar el contrapeso con dos grupos experimentales (grupos de memoria de 1-h y 24-h). Los dos grupos se contrarrestaron en dos contextos (contextos 1 y 2), y esto se repitió en dos contextos adicionales (contextos 3 y 4; Figura 5A). Los resultados de los cuatro contextos se presentan individualmente en la Figura 5B,D,donde se evaluó la memoria para cada grupo experimental comparando la preferencia al nivel de azar en cada contexto (memoria de 1-h: Contexto 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t₈ = 5,5, p < 0,001; Contexto 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t₈ = 4,0, p = 0,004; Contexto 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t₆ = 4,0, p = 0,007; Contexto 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t₆ = 2,7, p = 0,035; Memoria de 24 horas: Contexto 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t₈ = 0,77, p = 0,46; Contexto 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t₈ = 0,18, p = 0,86; Contexto 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t₇ = 1,7, p = 0,12; Contexto 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t₇ = 0,52, p = 0,62; prueba tde una muestra versus nivel de probabilidad).

En los contextos 1, 2 y 4, la comparación entre sujetos de los grupos reveló diferencias significativas entre la memoria de 1 h y 24 horas (memoria de 1 h versus memoria de 24 horas: Contexto 1, t_12,7 = 3,4, p = 0,005; Contexto 2, t_15,2 = 2,6, p = 0,019; Contexto 3, t_13,0 = 1,4, p = 0,17; Contexto 4, t_12,2 = 2,4, p = 0,032; prueba tde Welch desapareada). Para una mejor representación y comparación dentro del sujeto de los datos, se combinaron los resultados de dos contextos contrabalanceado(Figura 5C,E). Los grupos experimentales combinados se compararon nuevamente con el nivel de probabilidad individualmente (Contextos 1 y 2 combinados: memoria de 1 h, memoria de 67,8 ± 2,6%, n = 18, t₁₇ = 6,7, p < 0,001; memoria de 24 horas, 47,1 ± 3,9%, n = 18, t₁₇ = 0,74, p = 0,47; Contextos 3 y 4 combinados: memoria de 1 h, 65,3 ± 3,3%, n = 14, t₁₃ = 4,7, p < 0,001; Memoria de 24 horas, 52,4 ± 3,2%, n = 16, t₁₅ = 0,73, p = 0,48; prueba tde una muestra versus nivel de probabilidad). Luego, los grupos experimentales se compararon entre sí.

En ambos pares de contextos, hubo diferencias significativas entre los grupos según lo revelado por las comparaciones dentro del sujeto (memoria de 1 h versus memoria de 24 h: Contextos 1 y 2 combinados, t₁₆ = 3,5, p = 0,003; Contextos 3 y 4 combinados, t₁₃ = 2,4, p = 0,032; t-test pareado). También se obtuvieron resultados comparables con ratas Lister Hooded de tipo salvaje en el protocolo de codificación débil utilizando los contextos 1 y 4 para las dos sesiones contrapesadas (datos no mostrados). La replicabilidad y confiabilidad de los resultados se validaron comparando cada conjunto de datos utilizando ANOVA unidireccional. No se detectaron diferencias significativas entre los cuatro contextos (memoria de 1 h: F_3,28 = 0,31, p = 0,81; memoria de 24 h: F_3,30 = 0,99, p = 0,41). Por lo tanto, la prueba de ubicación del objeto se puede repetir de manera confiable con una influencia mínima de repeticiones, dado que se siguen las instrucciones de este protocolo.

Figura 5: Diferentes formas de presentar yanalizar los resultados del protocolo de codificación débil con dos grupos experimentales contrabalanceados en dos sesiones. (A) El diseño experimental para el contraequilibrio con dos grupos experimentales (grupos de memoria de 1-h y 24-h) en dos sesiones (contextos 1 y 2). El contrapeso se repitió en dos sesiones adicionales (contextos 3 y 4). (B y D) Los resultados de cada contexto y los grupos experimentales se compararon individualmente con el nivel de azar y entre sí. En los cuatro contextos, la preferencia por el objeto en la nueva ubicación en las pruebas con un retraso de 1 h aumentó significativamente en comparación con el nivel de probabilidad [Contexto 1 y 2: n = 9 por grupo (B); Contexto 3 y 4: n = 7 por grupo (D)]. En las pruebas de retardo de 24 horas, la preferencia por el objeto en la nueva ubicación no difirió del azar (Contexto 1 y 2: n = 9 por grupo; Contexto 3 y 4: n = 8 por grupo). Hubo una diferencia significativa entre las preferencias de los grupos experimentales en los contextos 1, 2 y 4, pero no en el contexto 3, como lo revela la comparación entre sujetos. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; prueba tde una muestra versus nivel de probabilidad (50%, línea discontinua). ^#p < 0,05; ^##p < 0.01; ns, no significativo; prueba tde Welch desapareada. (C y E) Los resultados se presentan después de combinar los grupos experimentales de los dos contextos contrapesados [Contextos 1 y 2 combinados, n = 17 por grupo (C); Contextos 3 y 4 combinados, n = 14 por grupo (E)]. La preferencia por el objeto en la nueva ubicación aumentó significativamente en comparación con el nivel de probabilidad en las pruebas con un retraso de 1 h, pero no de 24 horas, en ambos pares de contexto. La comparación dentro del sujeto de los grupos experimentales reveló diferencias significativas entre las preferencias por el objeto en la nueva ubicación en pruebas con retrasos de 1 y 24 horas en ambos pares de contexto. p < 0,001; prueba tde una muestra versus nivel de probabilidad (50%, línea discontinua). ^#p < 0.05, ^##p < 0.01; t-test pareado. Los puntos de datos individuales se presentan como puntos. Todas las barras muestran el porcentaje de exploración del objeto en la nueva ubicación como media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La tarea de ubicación del objeto se puede utilizar en una variedad de estudios para investigar la memoria espacial como se describió anteriormente. La flexibilidad de la configuración permite el modelado de la memoria a corto y largo plazo de diferentes fortalezas, y se puede implementar fácilmente a un bajo costo. Sin embargo, como hay muchos parámetros en el protocolo que pueden influir en los resultados, y los diferentes estudios varían ligeramente en estos parámetros^6,uno podría enfrentar dificultades para implementar con éxito la tarea por primera vez. El protocolo anterior está destinado a guiar a los lectores a través de este proceso sin problemas. A continuación se examinarán otras medidas cruciales que podrían ser importantes para la ejecución satisfactoria de la tarea con una alta replicabilidad.

Aunque la sesión de codificación / prueba a menudo es el foco cuando se ejecutan experimentos de ubicación de objetos, los protocolos de manejo y habituación tienen un profundo efecto en el resultado de este tipo de pruebas de comportamiento donde el resultado depende del comportamiento natural de la rata no perturbado^14,15. Como tal, los pasos que preceden a la sesión de codificación / prueba deben diseñarse con precaución, ya que pueden influir en el comportamiento y la memoria de la rata y, en consecuencia, influir en los resultados finales. Un buen nivel de manejo y habituación tal que las ratas se familiaricen con el experimentador y la tarea minimizará el efecto de los factores de estrés al tiempo que aumenta la probabilidad de exhibir un comportamiento natural⁸. Como se mencionó en el protocolo, el manejo puede comenzar tan pronto como el destete de los cachorros si la cepa de rata se mantiene en la instalación del hogar. Basado en la experiencia previa (datos no mostrados) y a partir de la de varios estudios previos^16,17,este manejo temprano resulta en baja ansiedad y mayor curiosidad en los meses siguientes.

Como la tarea de ubicación del objeto depende únicamente del impulso exploratorio intrínseco de las ratas, el comportamiento esperado puede verse obstaculizado fácilmente si las ratas no están ansiosas por explorar o son reacias a acercarse a la novedad, lo que se conoce como "comportamiento neofóbico"¹. Como tal, es muy recomendable incluir un protocolo de manejo y habituación exhaustivo de acuerdo con las necesidades específicas del estudio. Este protocolo se puede utilizar como una guía de requisitos mínimos, y se pueden implementar pasos adicionales(por ejemplo,si el estudio va a incluir inyecciones en una etapa posterior, se requiere habituación a procedimientos de inyección y posición de retención específica). La cepa y la edad de las ratas experimentales son otros dos factores influyentes y deben considerarse antes de planificar un experimento para evitar resultados subóptimos. Diferentes cepas de rata pueden tener diferentes comportamientos y niveles de ansiedad basales^18,19,20 y, por lo tanto, se puede requerir un ajuste específico al protocolo dependiendo de la cepa utilizada.

Se confirma que este protocolo funciona bien con ratas transgénicas Th-Cre con cepa Long-Evans cruzada cuatro veces a la cepa Lister Hooded y a las ratas Lister Hooded de tipo salvaje. Una edad de inicio lógicamente ideal para las ratas en experimentos de comportamiento es de alrededor de 12 semanas^20,pero se debe tener en cuenta la variabilidad entre cepas y los requisitos específicos de la tarea. También podría ser posible utilizar ratas en desarrollo si es de interés para el estudio, aunque es posible que se requieran ajustes al protocolo y no se cubran aquí. Sin embargo, es importante considerar si la rata a una edad determinada ha desarrollado las funciones cognitivas necesarias para realizar con éxito esta tarea. Un estudio²¹ que investiga esto ha reportado que solo las ratas adolescentes en el día postnatal 38 y no antes, mostraron memoria espacial alocéntrica reflejada en preferencia por el objeto en la nueva ubicación, como se observó en ratas adultas. El protocolo presentado aquí fue exitoso utilizando ratas que tenían 15-16 semanas de edad al comienzo de la primera sesión de codificación / prueba. Anteriormente, el mismo protocolo de codificación fuerte producía resultados subóptimos a negativos cuando se usaban ratas de 23 semanas de edad que no habían alcanzado el nivel óptimo de habituación debido a la falta de manejo y habituación a una edad lo suficientemente temprana. Estas ratas no lograron desempeñarse de manera diferente al nivel de azar o, de hecho, mostraron aversión hacia la novedad como se observó en términos de preferencia por los objetos estables en lugar de los objetos desplazados (datos no mostrados). Estos resultados proporcionan evidencia de que la edad y el momento del manejo de la habituación pueden tener un impacto en la efectividad de la habituación y, como resultado, contribuir a la observación del comportamiento ansioso y neofóbico en las pruebas.

Aquí, se describen dos protocolos diferentes, lo que garantiza una codificación fuerte o débil en la tarea de ubicación del objeto. Durante el establecimiento de estos protocolos, se observó que el interés en los objetos disminuyó después de 5-10 minutos de exploración durante ensayos largos individuales(por ejemplo, codificación de 20 minutos), y las ratas finalmente dejaron de explorar. Esto da como resultado una memoria más débil de las ubicaciones de los objetos. Un protocolo de codificación que intercala ensayos de codificación con períodos de descanso cortos(por ejemplo, codificación de 3 x 5 minutos) supera esto y conduce a una alta exploración a lo largo de los ensayos. Por lo tanto, el tiempo de exploración activo y el diferente diseño de estos dos protocolos de codificación influyen en la fuerza de la memoria, que es más fuerte después de 3 x 5 minutos de codificación que después de 20 minutos de codificación de protocolos. También se pueden lograr resultados similares utilizando duraciones ligeramente diferentes con protocolos de ensayo único versus protocolos de ensayo intercalados, y se pueden hacer ajustes para adaptarse a las necesidades del estudio y la cepa de la rata.

A diferencia de los protocolos que utilizan un campo abierto blanco liso con solo señales externas en la sala, el protocolo presentado aquí utiliza una arena con contextos distintos y señales dentro del laberinto que probablemente requieran más tiempo para aprender. Por lo tanto, se recomienda la adición de un paso de habituación de contexto en el protocolo antes del ensayo de codificación. Esto permitirá a las ratas formar un mapa espacial de cada contexto durante la habituación y disminuir la duración del siguiente ensayo de codificación, ya que las ratas solo necesitarán codificar las ubicaciones de los objetos en relación con este mapa. Además, la habituación del contexto permitirá a las ratas habituarse a cualquier posible distractor dentro de cada contexto, como las señales espaciales 3D, minimizando comportamientos distintos de la exploración de objetos en la sesión de codificación / prueba a seguir. Con la implementación de un método de contrapeso exhaustivo que consta de varios niveles(es decir, una amplia gama de combinaciones de ubicación de objetos (contadores) y la dirección del desplazamiento del objeto), las preferencias no deseadas que pueden aumentar debido a las variaciones en la intensidad de la luz y los colores / patrones de la pared en las esquinas de la arena se minimizan.

Se deben considerar varios factores al repetir la tarea para aumentar la replicabilidad entre las sesiones de codificación / prueba y minimizar la influencia de la repetición. En primer lugar, es necesario diseñar contextos distintos (tantos como el número de repeticiones de sesiones de codificación/prueba) para evitar la acumulación de memoria espacial que podría ser causada por la realización de las sesiones repetidas utilizando el mismo contexto. Para lograr esto, se utilizó un aparato con paredes reemplazables de diferentes colores y patrones(Figura 1B,C). Las distintas paredes y objetos 3D (como juguetes o pequeños artículos cotidianos de distintos colores y formas, ver protocolo y Figura 1C)colgados en las paredes son las señales espaciales y puntos de referencia que las ratas potencialmente utilizan para aprender las ubicaciones de los objetos en relación con sus contextos. En el caso de que una prueba no produzca preferencia por el objeto movido, se puede considerar cambiar estos parámetros del contexto (diseño de pared y señales espaciales). Alternativamente, se puede usar una arena de forma rectangular o circular para tareas de ubicación de objetos en lugar de una arena cuadrada como en este protocolo. Se informa que las arenas circulares eliminan las preferencias de esquina²² que a menudo se observan en arenas con esquinas y, por lo tanto, puede ser beneficioso cuando se trata de una rata o ratón particularmente de alta ansiedad. Si bien los requisitos de crear cuatro contextos distintos en este protocolo funcionan de manera más óptima con una forma cuadrangular, una arena circular también se puede hacer funcional después de algunos ajustes.

En segundo lugar, los intervalos entre cada sesión de codificación / prueba deben determinarse de tal manera que las ratas conserven el mismo nivel de interés cada vez, evitando al mismo tiempo el riesgo de aprendizaje acumulativo resultante de un denso programa de repeticiones. Por lo general, un intervalo de al menos el doble de la duración del tiempo de retardo entre la codificación y los ensayos de prueba es suficiente, y los intervalos más largos son más favorables para más de dos repeticiones. Esto significa que, mientras que un intervalo mínimo de 48 horas después de una prueba de 24 horas es suficiente para una o dos repeticiones, se recomienda usar un intervalo de 1 semana para cuatro repeticiones. Como muestran los resultados de la Figura 5 y la comparación con ANOVA, la tarea se puede repetir con éxito cuatro veces. En base a esto, el protocolo establecido se puede utilizar para contrarrestar hasta cuatro condiciones experimentales. El número de grupos experimentales determina el número de repeticiones de sesiones de codificación/ensayo en distintos contextos. Los resultados de la Figura 5 representan una posible forma de utilizar el protocolo con dos grupos experimentales. Los grupos se contrarrestaron en dos sesiones, y las mismas condiciones se repitieron en dos sesiones adicionales (para fines de validación). El segundo conjunto de sesiones contrapesadas también podría utilizarse para contrarrestar las nuevas condiciones. Del mismo modo, se pueden comparar tres o cuatro condiciones experimentales utilizando tres o cuatro sesiones contrabalanceadas, respectivamente.

En estos casos, los contextos deben diseñarse para acomodar características contrastantes descritas en el protocolo. Cabe destacar que el diseño contrabalanceado puede no ser adecuado para experimentos en los que se deben utilizar manipulaciones adicionales, como una intervención farmacológica que podría dejar un efecto o daño duradero. Para mantener la efectividad y replicabilidad de las pruebas, el experimento debe diseñarse en consecuencia. Los datos de las pruebas repetidas se pueden presentar y analizar de varias maneras, como se demuestra en la Figura 5. Para un análisis inicial, los grupos experimentales en cada contexto se pueden comparar individualmente con el nivel de azar utilizando una prueba tde muestra para determinar cualquier preferencia significativa(Figura 5B,D). Esto puede ser útil para obtener una comprensión rápida de los datos, pero garantiza solo una comparación indirecta de los grupos. Por lo tanto, para comparar dos o más grupos, los datos deben analizarse utilizando pruebas tde dos muestras (pareadas o no emparejadas) o ANOVA, respectivamente. Esto puede ser en forma de comparación entre sujetos de los grupos dentro de una sola sesión de codificación / prueba(Figura 4A y Figura 5B,D)o comparación dentro del sujeto de los grupos de dos (o más) contextos contrabalanceados(Figura 5C,E). Este último método es muy recomendable, especialmente cuando se trata de condiciones de memoria débiles, lo que, como se explicó anteriormente, resulta en una alta varianza debido a la aleatoriedad en el comportamiento.

La combinación de los contextos contrabalanceados conduce a grupos más grandes que se requieren para visualizar de manera confiable el comportamiento del grupo con una variación mínima. Usando un protocolo con repeticiones en sesiones contrabalanceadas, se puede esperar una disminución en el número de ratas a alrededor de un tercio del número que se requeriría usando una sola prueba con el mismo poder estadístico. Por lo general, los tamaños de muestra en un rango de 7 a 15 ratas (total) para sesiones contrapesados y en un rango de 20 a 50 ratas (10 a 25 por grupo) para una sola sesión con un tamaño de efecto y potencia ambos mayores de 0.8 son suficientes. La disminución en el número de animales necesarios y el aumento en la información que obtenemos de cada animal utilizando este protocolo refina el estudio y sirve a los principios 3R de usos éticos de los animales en la investigación. Es importante en este paso tener en cuenta que el comportamiento aleatorio de la rata, que no se acompaña de una memoria fuerte, puede resultar en preferencias fuertes individuales tanto por debajo como por encima del azar, pero el promedio del grupo debe producir una preferencia no significativamente diferente del azar. Los datos individuales deben interpretarse cuidadosamente. La distribución de puntos de datos individuales dentro de un grupo también puede ser informativa para interpretar los resultados. Como se ve en la Figura 4 y la Figura 5,la distribución cambia dependiendo de la fuerza de la memoria. En general, el protocolo presentado aquí se puede seguir fácilmente para implementar la tarea de ubicación de objetos con repeticiones para modelar la memoria espacial a corto y / o largo plazo. El protocolo de entrenamiento simple y flexible y la posibilidad de implementar manipulaciones adicionales hacen de esta tarea una opción popular. Estas modificaciones al protocolo permiten la investigación de pasos particulares como la adquisición, consolidación y recuperación de memoria.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open-field/experimental box	O'Hara & Co (Japan)	OF-3001	Open-field box for the object location task
Object 1: cones	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RR
Object 2: footballs	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RB
Object 3: rectangular blocks	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RC	Rectangular blocks were modified after purchase
Object location task apparatus	O'Hara & Co (Japan)	SPP-4501	Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task
Tracking software	O'Hara & Co (Japan)	TimeSSI	For movement tracking and automated camera functions
Wild-type Lister Hooded rats	Charles River	603